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Neuroscience

माउस Cochlear explants की लंबी अवधि के समय चूक इमेजिंग

Published: November 2, 2014 doi: 10.3791/52101
Automatic Translation
1, 1,2,3
1Biological Sciences Platform, Sunnybrook Research Institute, 2Department of Otolaryngology - Head and Neck Surgery, University of Toronto, 3Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto

Summary

हाथ में विकास की प्रक्रिया दस दिनों में एक अस्थायी ढाल पर संचालित क्योंकि भ्रूण स्तनधारी कोक्लीअ के लाइव इमेजिंग चुनौती दे रहा है. यहाँ हम पांच दिनों में एक फ्लोरोसेंट संवाददाता माउस से लिया भ्रूण कर्णावत explant ऊतक इमेजिंग फिर संवर्धन और के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं.

Abstract

यहाँ हम रहते भ्रूण माउस कर्णावत explants की लंबी अवधि के समय चूक इमेजिंग के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं. लगभग दस दिनों के लिए स्तनधारी कोक्लीअ आय का अत्यधिक आदेश दिया, जटिल संरचना के निर्माण के लिए जिम्मेदार विकास कार्यक्रम. इस अवधि में जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन और दवा या आनुवंशिक हेरफेर करने के लिए उनकी प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए, लंबे समय तक इमेजिंग आवश्यक है. इससे पहले, लाइव इमेजिंग आमतौर पर एक मानक माइक्रोस्कोप के ऊपर एक humidified कक्ष में explanted ऊतकों की व्यवहार्यता द्वारा सीमित किया गया है. नमी और तापमान के संबंध में संस्कृति के विकास के लिए इष्टतम स्थितियों को बनाए रखने में कठिनाई इमेजिंग प्रयोगों की लंबाई पर सीमा रखा गया है. एक संशोधित टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में एकीकृत एक माइक्रोस्कोप दीर्घकालिक-रहते इमेजिंग के लिए एक शानदार वातावरण प्रदान करता है. इस विधि में हम भ्रूण माउस कर्णावत explants स्थापित करने के लिए कैसे और समय व्यतीत हो imagi संचालन करने के लिए एक मशीन माइक्रोस्कोप का उपयोग करने के लिए कैसे प्रदर्शितएनजी 5 दिनों में एक ठेठ भ्रूण दिन (ई) 13 कर्णावत explant और Sox2, कोक्लीअ के prosensory कोशिकाओं के एक मार्कर के व्यवहार की जांच करने के उज्ज्वल क्षेत्र और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी दोनों का उपयोग कर.

Introduction

स्तनधारी कोक्लीअ एक अत्यधिक आदेश दिया जटिल अंग है. माउस में, जल्दी प्रसव के बाद के चरणों में कान का दिन E11 पर पुटिका और विकास कार्यक्रम के पूरा होने से आदिम भीतरी कान के उद्भव के बीच, सेल संकेतन के कई तरंगों और जीन अभिव्यक्ति में समन्वित परिवर्तन जगह ले. कर्णावत वाहिनी के शीर्ष करने के लिए बेस से चल रहा है Corti के संवेदी उपकला, या अंग का पता लगाने ध्वनि है. Corti के अंग का विकास उत्कृष्ट विकास के अंत तक, यह भीतरी बालों की कोशिकाओं का एक ही पंक्ति से मिलकर बनता है कि इस तरह से नियंत्रित किया जाता है, बाहरी बालों की कोशिकाओं की तीन पंक्तियों का समर्थन कोशिकाओं के पांच पंक्तियों (स्तंभ कोशिकाओं की दो पंक्तियाँ, तीन के साथ interspersed Deiters 'कोशिकाओं की पंक्तियाँ) 1. , हानि सुनवाई उत्पत्ति और संवेदी epithemlium 2 की patterning यापन करने studye के महत्व heighlighting में इस सटीक क्रम परिणामों से विचलन.

भ्रूण माउस Coch की इन विट्रो संवर्धन मेंघास का मैदान Corti के अंग के विकास के तंत्र के अध्ययन में एक अनिवार्य उपकरण है. इस तकनीक को 1974 में स्थापित किया गया था और पिछले 40 वर्षों में, संवेदी उपकला निर्दिष्ट और Corti के अंग 3 की स्थापना की है जिसके द्वारा तंत्र के कई स्पष्ट करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. कोक्लीअ गतिशील विकास की प्रक्रिया के साथ एक जटिल अंग है; सात दिन 1 प्रकट करने के रूप में एक जोड़-तोड़ के रूप में लंबे समय लग सकता है. E13 पर एक कर्णावत explant संस्कृति को जीएसके 3β अवरोधकों जोड़ने जब ​​उदाहरण के लिए, इष्टतम ऊष्मायन अवधि परिसर के एक मजबूत प्रभाव छह दिन 4 निरीक्षण करने के लिए.

विकासशील कोक्लीअ के लाइव इमेजिंग Corti के अंग की आकृति विज्ञान में परिवर्तन की जांच की अनुमति देता है, जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन, पलायन की ट्रैकिंग proliferating या कोशिकाओं मर रहा है, और यह वास्तविक समय दवा एजेंटों के परिणामों का अवलोकन और संकेत के विघटन की अनुमति देता है रास्ते. अब तक, कोक्लीअ की इमेजिंग रहते हैंमुख्य रूप से कम समय अवधि 5-8 से अधिक Corti के अंग की छवि छोटे क्षेत्रों को confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग किया है, लेकिन इस तकनीक explant व्यवहार्यता के कारण सीमाएँ किया गया है. धीमी गति से विकास की प्रक्रिया पर लंबी अवधि के जोड़तोड़ के प्रभाव की इमेजिंग में, इमेजिंग माहौल महत्वपूर्ण है. आमतौर पर एक confocal रहते इमेजिंग प्रणाली माइक्रोस्कोप पर बैठता है कि एक humidified प्लास्टिक बॉक्स का उपयोग करता है. गर्मी और उमस ऐसी उद्देश्य या प्रकाश स्रोत के रूप में यह hinged उद्घाटन के माध्यम से और microscope- के विभिन्न भागों के आसपास अंतराल के माध्यम से, पहुँच खिड़कियों के माध्यम से, माइक्रोस्कोप तालिका से मिलता है जहां incubating बॉक्स में अंतराल के माध्यम से बच सकते हैं. यह अधिक से अधिक दो या तीन दिनों के लिए स्वस्थ explants को बनाए रखने के लिए इष्टतम नहीं है.

हम एक मानक सीओ 2 इनक्यूबेटर अंदर सील एक औंधा माइक्रोस्कोप, बजाय खुर्दबीन के आसपास का निर्माण एक मशीन के रूप में 'इनक्यूबेटर माइक्रोस्कोप' को परिभाषित. एक मशीन माइक्रोस्कोप पूर्वप्रयोग के जीवन आदत नहीं बल्कि दो या तीन दिनों में इमेजिंग से, नमूने के लिए दो सप्ताह के लिए imaged किया जा सकता है कि इस तरह के. एक मशीन माइक्रोस्कोप संस्कृतियों और मानक नियंत्रित परिस्थितियों explant को न्यूनतम अशांति के साथ, सेल के विकास और भेदभाव के लिए एक शानदार वातावरण प्रदान करता है. कई दिनों से अधिक जगह ले कि अध्ययन में यह इनक्यूबेटर से उन्हें हटाने और एक औंधा फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के लिए उन्हें ले जाने से एक दैनिक आधार पर इमेजिंग नमूनों का सहारा आम है. इस दृष्टिकोण से काम कर सकते हैं, इनक्यूबेटर से व्यंजन हटाने संवेदनशील विकासशील ऊतक पर तनाव inflicts. कारण इनक्यूबेटर से हटाने के लिए तापमान में संवर्धन मध्यम और उतार चढ़ाव की अम्लता में परिवर्तन suboptimal विकास और अस्वस्थ ऊतक में परिणाम कर सकते हैं. एक ही फोकल हवाई जहाज़ पर और हर समय बिंदु पर एक ही अभिविन्यास में एक ही क्षेत्र इमेजिंग बेहद चुनौतीपूर्ण है. एक मशीन के भीतर एक स्वचालित प्रणाली का उपयोग करके, यह स्वस्थ बनाए रखने के लिए संभव हैऊतक, अधिक समय बिंदुओं पर छवियों को इकट्ठा करने के लिए और एक ही क्षेत्र हर फ्रेम में कब्जा कर लिया है कि यह सुनिश्चित करने के लिए. हाल के वर्षों में कई एकीकृत माइक्रोस्कोप ऊतक इन्क्यूबेटरों, विकसित किया गया है इन क्लिनिकल प्रैक्टिस 9 में, लेकिन यह भी स्टेम सेल और कैंसर अनुसंधान 10,11 में न केवल उपयोगी किया गया है.

यहाँ हम भ्रूण माउस कर्णावत explants के दीर्घकालिक लाइव इमेजिंग के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. हम निर्धारित समय बिंदुओं पर कई नमूने की छवियों पर कब्जा करने की क्षमता है कि एक मानक सीओ 2 इनक्यूबेटर अंदर एक स्वचालित माइक्रोस्कोपी प्रणाली का उपयोग करें. प्रणाली एक मशीन के अंदर सेट एक औंधा माइक्रोस्कोप के होते हैं. नमूने हर समय बिंदु पर कई नमूनों की इमेजिंग की अनुमति देता है कि एक घूर्णन मंच में रखा जाता है. रोशनी, छवि पर कब्जा, और मंच के रोटेशन Metamorph सॉफ्टवेयर के माध्यम से संचालित एक स्वचालित प्रणाली द्वारा नियंत्रित कर रहे हैं. ऑपरेटिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर एक इमेजिंग दिनचर्या निर्धारित करके हम TW अप करने के लिए चलाने के लिए एक प्रयोग सेट कर सकते हैंन्यूनतम मानवीय हस्तक्षेप के साथ ओ सप्ताह. इस उदाहरण में हम विशेष रूप से बड़े पैमाने पर विकास और कोक्लीअ के पुनर्निर्माण, और, prosensory क्षेत्र दिखाने के लिए दोनों उज्ज्वल क्षेत्र और प्रतिदीप्ति का उपयोग करें. इस प्रयोग में, cochleae. भ्रूण दिन E13 पर Sox2 EGFP संवाददाता चूहों से विच्छेदित किया जाएगा इन विट्रो संस्कृतियों की स्थापना की जाएगी और उसके बाद पांच दिनों में imaged.

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Protocol

माउस ऊतक बनाए रखा और देखभाल और प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग के लिए पशु की देखभाल के दिशा निर्देशों पर कनाडा परिषद के अनुसार euthanized चूहों 12 -reporter Sox2 EGFP से काटा गया था.

1. संवर्धन भ्रूण Cochleae

  1. 8.89 DMEM के मिलीलीटर, भ्रूण गोजातीय सीरम के 1 मिलीलीटर (एफ बी एस), 100x एन 2 के पूरक के 100 μl, और / एमएल सिप्रोफ्लोक्सासिन 10 मिलीग्राम की 10 μl मिश्रण से Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) अनुपूरक. 100% HEPES के 5 मिलीलीटर के साथ 495 मिलीलीटर HBSS के मिश्रण से हांक संतुलित नमक समाधान (HbSS) अनुपूरक.
  2. गिलास नीचे संस्कृति व्यंजन तैयार करें:
    1. एक लामिना का प्रवाह हुड में, 5 मिलीलीटर DMEM में 200 μl तहखाने झिल्ली निकालने सब्सट्रेट resuspend. 10 मिमी कुओं के साथ 35 मिमी व्यास गिलास नीचे संस्कृति व्यंजन तैयार करते हैं. प्रत्येक गिलास के केंद्र में पिपेट 150 μl सब्सट्रेट / DMEM के पकवान तली. ये व्यंजन 40 मिनट ऊष्मायन के बाद इस्तेमाल किया जा सकता है, या एक सीओ 2 में संग्रहित कर सकते हैं नोट: डिश के आधार पारदर्शी और इमेजिंग के लिए उपयुक्त है कि यह सुनिश्चित करने के लिए, अच्छी तरह से explants अंत में एक आसानी स्थित क्षेत्र में बसा है और करने के लिए अनुमति देता है कि डिश के केंद्र में एक बनाने के लिए: कांच के बर्तन निम्नलिखित कारणों के लिए उपयोग किया जाता है तली तो एक प्रयोग के बाद नमूना immunostaining के और बाद के विश्लेषण के लिए कार्रवाई की जा सकती है.
  3. काम-स्टेशन और उपकरण तैयार करें:
    1. लामिना का प्रवाह स्वच्छ बेंच चालू करें, और एक स्वच्छ काम की जगह बनाने के लिए 70% EtOH के साथ नीचे स्प्रे. 70% EtOH में (एजेंट (भाग 1) और चारकोल पाउडर (2.5 ग्राम) के इलाज के 184 सिलिकॉन elastomer (10 भागों) का मिश्रण,) संदंश, चम्मच, और एक काले रंग की 184 सिलिकॉन elastomer पकवान लेना.
  4. स्वच्छ काम स्टेशन में प्रयोग के लिए फसल भ्रूण. ठंड HBSS 1% HEPES के साथ पूरक बर्फ में उपयुक्त हमल के भ्रूण लीजिए.
    1. प्रदर्शन करेंगे कि एक बाहरी या दिखाई अंग का निर्धारण करेंसंवाददाता गतिविधि और एक फ्लोरोसेंट स्टीरियो माइक्रोस्कोप का उपयोग भ्रूण जांच करते हैं. प्रयोग के विषय के रूप में इन 1% HEPES के साथ कर रहे हैं पूरक ठंड HBSS बर्फ में रिपोर्टर गतिविधि दिखा रहे कि भ्रूण लीजिए.
  5. लौकिक हड्डियों को ले लीजिए:
    1. एक शांत प्रकाश स्रोत और ठीक संदंश का उपयोग, कार्य जल्दी, पिल्ले का सिर इकट्ठा. लौकिक हड्डियों को नुकसान से बचने के लिए गर्भाशय ग्रीवा कशेरुक पर और जबड़े के नीचे क्लिप को ध्यान रखना.
    2. ध्यान से खोपड़ी खुला. , मस्तिष्क निकालें सिर के सामने बंद ट्रिम, और एक स्वच्छ थाली में 1% HEPES के साथ पूरक ताजा बर्फ ठंड HBSS को पीछे खोपड़ी हस्तांतरण. ध्यान से कुशलता में vestibular प्रणाली रखने के लिए देखभाल करने के मूंगफली के आकार का लौकिक हड्डियों बाहर काटना.
  6. कोक्लीअ काटना:
    1. , ठंड HBSS 1% HEPES के साथ पूरक बर्फ में एक काले रंग की सिलिकॉन elastomer लेपित डिश के लिए अस्थायी हड्डियों स्थानांतरण हड्डी के vestibular क्षेत्र पिन. पर कीट पिन डालेंलौकिक हड्डी को स्थिर करने और संदंश के लिए कमरे बनाने के क्रम में एक परोक्ष कोण. लौकिक हड्डी यह एक अक्षुण्ण कोक्लीअ फसल के लिए बहुत मुश्किल है बहुत ज्यादा स्थानांतरित करने के लिए अनुमति दी है के रूप में अगर लगाए प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण कदम है.
    2. ध्यान से कोक्लीअ आसपास उपास्थि को हटा दें. कोक्लीअ के आधार के बाहरी छोर पर कार्टिलेज में संदंश की एक शाखा डालें और उपास्थि में एक छेद क्लिप.
    3. , ओर एक फ्लैप ऊपर क्लिप संदंश की शाखा डालने और धीरे उपास्थि से वाहिनी की छत अलग. तिरछे ऊपर और पार क्षैतिज क्लिप, और ध्यान से कैप्सूल के सामने खंड लिफ्ट बंद. शेष उपास्थि और वाहिनी के बीच में संदंश की एक शूल डालें और धीरे पिछले अनुभाग बंद क्लिप. कोक्लीअ के शिखर सतह अब सामने आ रहा है.
    4. आधार पर शुरू, वाहिनी की छत कर्णावत उपकला मिलता है जहां क्षेत्र को पकड़ने और कर्णावत वाहिनी खुला. धीरे trimming, छत छीलजब आवश्यक यह पूरी तरह से हटा दिया जाता है जब तक. वाहिनी की औसत दर्जे का पक्ष पर छोड़ दिया झिल्ली के किसी भी भाग से दूर ट्रिम. अतिरिक्त mesenchymal ऊतक की नली को साफ और vestibular प्रणाली से नली अलग.
  7. संस्कृति explants:
    1. ध्यान से, एक सब्सट्रेट लेपित गिलास नीचे संस्कृति डिश के केंद्र में, एक explant, luminal सतह के ऊपर रखें तरल के सभी बंद आकर्षित और दो मिनट के लिए छोड़ दें. यह परेशान करने के लिए नहीं ख्याल रख रही DMEM बूंद-वार explant को पूरक 150 μl जोड़ें. Explant, मुक्त फ्लोट संदंश के साथ का स्थान है, लेकिन यह सब्सट्रेट करने के लिए संलग्न कर सकते हैं कि इतना explant पकवान की तह तक बैठती है कि ध्यान रखना चाहिए.
    2. नमी बनाए रखने के लिए बाँझ पानी की एक छोटी डिश के साथ, एक गहरी 12 सेमी व्यास पेट्री डिश में गिलास नीचे बर्तन रखें. रातोंरात explant सब्सट्रेट करने के लिए देते हैं और समतल करने के लिए आदेश में एक 35 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में संस्कृतियों रखो.

2. लाइव Imagआईएनजी

  1. Explant नमूने का चयन करें. प्रत्येक explanted कोक्लीअ की स्थिति का मूल्यांकन करने के लिए एक फ्लोरोसेंट स्टीरियो माइक्रोस्कोप का उपयोग करें. वाहिनी बरकरार है और एपेक्स को आधार से कांच से जुड़ी है, जहां केवल explants का चयन करें.
  2. संस्कृति कर्णावत ऊतक को 5% सीओ 2 के साथ 35 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर सेट करें. इनक्यूबेटर खुर्दबीन में संस्कृतियों रखो:
    1. धीरे पूरक DMEM बंद महाप्राण और कम से कम 500 μl ताजा मीडिया के साथ बदलें. 6 दिनों तक इमेजिंग के लिए, 1-1.5 मिलीलीटर बेहतर है. Explants शिथिल जुड़े होते हैं जहां मामलों में, पकवान के किनारे के आसपास मीडिया की एक अंगूठी पिपेट. यह मैट्रिक्स को संलग्न करने के लिए जारी है, जबकि यह अतिरिक्त तरल explant परेशान बिना एक लघु 'humidified कक्ष' कर देगा.
      1. वैकल्पिक रूप से, उपयोग अभिकर्मकों छवि संग्रह के बीच अंतराल के दौरान विमर्श किए जाने की जरूरत है अगर पकवान माइक्रोस्कोप में इसकी फिटिंग में रहता है, जबकि डिश ढक्कन खोलने के लिए शामिल किया गया hinged. Hinged पकवान कवर पलकों होने की अनुमतिनमूनों को परेशान करने या उनकी सेटिंग से व्यंजन हटाने के बिना खोला. यह बाद में छवि कब्जा के लिए उनकी सही स्थिति बनाए रखता है.
    2. नमूना पकवान धारक में उपयुक्त नमूने युक्त गिलास नीचे व्यंजन डालें. इस उदाहरण में माइक्रोस्कोप आठ 35 मिमी नमूना व्यंजन रखती है कि एक घूर्णन मंच है.
    3. लामिना का प्रवाह हुड के तहत गिलास lids के साथ प्लास्टिक lids की जगह है और नमूना पकवान धारक में व्यंजन डालें. डिश के तल से explants बेदखल करने के लिए या मीडिया को परेशान करने की नहीं इनक्यूबेटर देखभाल के अंदर नमूना पकवान धारक रखें.
  3. इमेजिंग दिनचर्या निर्धारित करें:
    1. माइक्रोस्कोप, यूवी दीपक और कैमरे पर स्विच और इमेजिंग सॉफ्टवेयर खोलें.
    2. नमूने का पता लगाएँ अनुक्रम में प्रत्येक पकवान के लिए जोखिम बार, एक इमेजिंग क्षेत्र लेने फोकस के विमान और समायोजित. फोकस शुरू के समय में explant के दृश्य पर ही नहीं निर्भर करता है की विमान चुनें, लेकिन अलइसलिए ऊतक कदम होगा कैसे और समय कोर्स चलेंगे कितनी देर तक मन में असर.
    3. प्रतिदीप्ति चैनल में चयनित फोकल हवाई जहाज़ के आसपास केंद्रित एक जेड ढेर सेट करें. प्रयोग के लिए नमूने की आवृत्ति और लंबाई निर्धारित करें. नमूने की आवृत्ति यह छवियों को इकट्ठा करने में लगने वाले समय से सीमित हो जाएगा, तो यह देखने के क्षेत्रों का चयन और एक जेड ढेर करने के बाद निर्धारित किया जाना चाहिए. इस मामले में नमूने पांच दिनों में हर 30 मिनट जगह लेता है. प्रयोग की अवधि के लिए 14 दिन हो सकता है.
  4. एक फिल्म तैयार करें:
    1. समय व्यतीत अवधि के अंत में छवि फ़ाइलों को खोलने के. अनुक्रमिक संग्रह अंक खोलता है कि इस मामले में Metamorph सॉफ्टवेयर प्रयोग किया जाता है. फ्रेम से फ्रेम ब्याज की सेल की आबादी दिखाने के लिए सबसे अच्छा फोकल हवाई जहाज़ लेने.
    2. एक AVI फ़ाइल के लिए इन छवियों को बदलने, या एकाधिक फॉर्मा के लिए खोला गया है और विश्लेषण इमेज प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर में या परिवर्तित किया जा सकता है कि छवियों का एक सेट उत्पन्न करने के लिए एक असेंबल के रूप में उन्हें निर्यातवीडियो संसाधन सॉफ्टवेयर का उपयोग कर टीएस.

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Representative Results

यहाँ हम एक असेंबल (चित्रा 1) और E13.5 पर चढ़ाया अगर एक ठेठ organotypic कर्णावत explant बढ़ेगा प्रदर्शन कैसे एक फिल्म (चित्रा 2) दिखा. एक Sox2 संवाददाता माउस prosensory क्षेत्र कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. फिल्म कोक्लीअ विकास और अभिसरण और विस्तार की प्रक्रिया दिखाता है कि, हरी Sox2 डोमेन के पार्श्व क्षेत्र में कोशिकाओं वह फैलता आसपास के ऊतकों के रूप में विभाजित करने के लिए नहीं है. इस Corti के अंग की एक विशेषता है; E13 पर भावी संवेदी उपकला सेल चक्र से बाहर निकालता है और बाद में परमाणु अप्रसार 13 के क्षेत्र के रूप में जाना जाता है. एक अलग कर्णावत explant के मध्य बेस (आंकड़े 3 और 4) यह फैली रूप में, prosensory क्षेत्र संकरी यह दर्शाता है कि पर केंद्रित एक दूसरी बार चूक प्रयोग. संस्कृति में तीन दिनों के बाद ऊतक यह व्यक्तिगत कल्पना करने के लिए संभव है कि काफी ऐसे चपटा हो गया है कि नोटदोहरी fluorescing कोशिकाओं, शुरुआत में होने के कारण ऊतक मोटाई के लिए प्रकाश की आंतरिक प्रतिबिंब यह संभव अभिव्यक्ति के क्षेत्रों लेकिन व्यक्तिगत नहीं कोशिकाओं की पहचान बनाने वाले क्षेत्रों से कर रहे हैं, जबकि.

चित्रा 1
चित्रा 1:. समय - पांच दिनों में एकत्र Sox2 संवाददाता कर्णावत ऊतक की चूक छवियों इस असेंबल explant वृद्धि दिन शून्य पर शुरू करने और एक 10X उद्देश्य का उपयोग हर 30 मिनट के नमूने, पांच दिन पर समाप्त होने की प्रगति को दर्शाता है. explant E13 पर स्थापित और इमेजिंग से पहले रात में सुसंस्कृत किया गया था. Explant रूप में वह परिपक्व दोनों बढ़ता है और संसृत विस्तार आंदोलनों आए. 12 घंटा के अंतराल पर कर्णावत विकास की हद दिखा (ए) अनुक्रमिक छवियों. दृश्य प्रकाश चैनल GFP प्रतिदीप्ति जीन से मढ़ाEGFP Sox2 रिपोर्टर द्वारा मूल्यांकन किया गया. (बी) GFP प्रतिदीप्ति चैनल ही. स्केल बार 200 माइक्रोन से मेल खाती है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2 :. 5 दिनों में एकत्र Sox2 संवाददाता कर्णावत ऊतक के समय चूक एनीमेशन यह आंकड़ा 1 में संकेत ही explant प्रयोग है, इस समय फ्रेम 5 दिनों में 30 मिनट के अंतराल पर चयनित और एक उत्पन्न करने के लिए एक AVI फ़ाइल के रूप में संयुक्त रहे हैं फिल्म.

चित्रा 3
चित्रा 3:. मिड आधार सीई आंदोलनों के दौर से गुजर और सपाट Sequentiमध्य बेस के prosensory उपकला (EGFP), संकरी फैली और 5 दिनों के दौरान अधिक दुबला बना दिखा रहा है कि अल छवियों. तीर संकरी है कि क्षेत्र से संकेत मिलता है. एक 10X उद्देश्य का उपयोग 12 घंटा के अंतराल पर एक 5 दिन का समय व्यतीत हो जाने के क्रम से चयनित फ्रेम्स. स्केल बार 200 माइक्रोन से मेल खाती है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 4 :. मध्य आधार सीई आंदोलनों के दौर से गुजर और सपाट एनिमेटेड समय चूक अनुक्रम अभिसरण और 30 मिनट के अंतराल पर चयनित फ्रेम के साथ 3 चित्र में दिखाया संवेदी उपकला के विस्तार को दिखाने का समय चूक एनीमेशन.

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Discussion

संस्कृतियों की स्थापना की और दीर्घकालिक इमेजिंग के लिए आदेश में समय चूक माइक्रोस्कोप स्थापित करने में कर रहे हैं जब विचार करने के लिए कई तकनीकी बातें हैं.

हम कर्णावत explants संवर्धन के लिए एक सब्सट्रेट के रूप में तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स का उपयोग, लेकिन सब्सट्रेट सेल प्रकार के अनुरूप होना चाहिए. उदाहरण के लिए, छवि neuronal संस्कृतियों के लिए, यह एक फ़ाइब्रोनेक्टिन कोटिंग प्रदान करने के लिए बेहतर हो सकता है. ऊष्मायन तापमान और गैस रचना भी ऊतक प्रकार के हिसाब से चुना जाना चाहिए. Explant के उम्र का चयन महत्वपूर्ण है. E12 पर विकास की दिशा में कम उम्मीद के मुताबिक है क्योंकि हम जल्द से जल्द E13 पर शुरू करते हैं. यह explants सब्सट्रेट करने के लिए संलग्न करने के लिए रात में संवर्धित कर रहे हैं कि आवश्यक है, प्रयोगों अगले दिन शुरू करने के लिए योजना बनाई जानी चाहिए. एक प्रयोग E15 पर या पुराने शुरू करने के लिए है, तो संस्कृतियों ऊतक दुबला बना देती है और इसलिए कोशिकाओं छवि के लिए आसान कर रहे हैं फैलता समय के साथ के रूप में E13 पर स्थापित किया जाना चाहिए (चित्रा 3 देखें). Corti के अंग imaged किया जा रहा है, यह कोक्लीअ बहुत ध्यान से विच्छेदित है कि आवश्यक है. Explant के पार्श्व बढ़त में nicks कोक्लीअ दृश्य से बाहर ब्याज के क्षेत्र स्थानांतरित कर सकते हैं protrusion.This फलाव आकार का एक 'वी' के गठन आंसू के माध्यम से, कोशिकाओं 'गिर' रूपात्मक rearrangements आए इसलिए जब, ऊतक की आंतरिक तनाव को तोड़ने . साथ ही, देखभाल संभव के रूप में औसत दर्जे का पक्ष पर वाहिनी की छत के रूप में ज्यादा दूर करने के लिए लिया जाना चाहिए. इस ऊतक explant फैलता है और देखने से यह obscuring हित के क्षेत्र के शीर्ष पर विकसित कर सकते हैं के रूप में पैदा करने के लिए जारी है.

इमेजिंग दिनचर्या की स्थापना, कोक्लीअ की आकृति विज्ञान में विकास और परिवर्तन को ध्यान से विचार किया जाना चाहिए. उद्देश्य क्षेत्र का आकार imaged किया जा पर ही नहीं, बल्कि उस क्षेत्र के लिए कदम या विस्तार होगा कि क्या ध्यान में ले आधार पर चुना जाना चाहिए. औसत दर्जे क्षेत्र में प्रकोष्ठोंइसलिए एक उच्च बढ़ाई (20X, 40X, 60X) का इस्तेमाल किया जा सकता है कोक्लीअ (चित्रा 1 और 2) विभाजन और एक सीमित क्षेत्र के भीतर ले जाते हैं, के. Explant के रूप में होती कोर्टी या पार्श्व उपकला के अंग में सेल, हालांकि, कदम होगा; कोशिकाओं को देखने के क्षेत्र में रहेगी कि संभावना अधिक है के रूप में एक कम बढ़ाई (10X या 20X), बेहतर है. कोक्लीअ के स्थिर क्षेत्रों की इमेजिंग उच्च आवर्धन पर संभव है. हम पूरे explant दिखाने के लिए कामना की है क्योंकि प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में एक 10x उद्देश्य का उपयोग करने के लिए चुना है, और ऊतक आंदोलन प्रारंभिक दौर में गतिशील है.

विचार करने के लिए अगला फोकस का विमान है. Explant बाहर हो जाना और समतल करना होगा कि यह देखते हुए, यह फोकल हवाई जहाज़ समय के पाठ्यक्रम पर नाटकीय रूप से बदल जाएगा संभावना है. ब्याज के क्षेत्र कोर्टी या पार्श्व उपकला के अंग, इस आशंका और मदद कर सकते हैं explant के बाहर पलायन कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित है. यह अल हैइतने कम बढ़ाई उद्देश्यों को प्रयोग करने के लिए एक तर्क. यह प्रतिदीप्ति और डीआईसी दोनों के लिए जेड ढेर सेट करने के लिए संभव है. ब्याज की कोशिकाओं को अंतिम चरण के कवर कांच के विमान में है, खासकर अगर यह प्रतिक्रिया कर सकते हैं कदम प्रति 3-5 माइक्रोन का एक जेड ढेर की स्थापना, ध्यान से बाहर ले जाने की संभावना है. यह कोशिकाओं की पैकिंग के घनत्व के रूप में, एक दिन पर संस्कृतियों को देखने जब सही विमान चुनने के लिए मुश्किल हो सकता है और एक स्पष्ट दृष्टिकोण रोका जा सकता है ऊतक आसपास से प्रकाश परावर्तित कर सकते हैं. बाद में एक फिल्म या असेंबल उत्पन्न करने के लिए फ्रेम की समीक्षा करते समय, जेड विमानों का चयन सावधानी से भी तीन आयामों में सेल आंदोलनों की ट्रैकिंग की अनुमति देता है. प्रयोग नमूना सीमा से बाहर कदम अगर फोकस सेटिंग्स समायोजित करने के लिए किसी भी बिंदु पर रोक दिया जा सकता है.

एक सप्ताह से अधिक एक कर्णावत explant के लाइव इमेजिंग confocal रहते इमेजिंग पूरक होगा कि कोक्लीअ के विकास को समझने के लिए एक नया आयाम कहते हैं. यह जब विस्तृत लंबे अंग का उपयोग करने के लिए एक शानदार तरीका हैअवधि परीक्षा आवश्यक है, लेकिन अल्पावधि एकल कोशिका के अध्ययन के लिए उच्च बढ़ाई confocal इमेजिंग की जगह नहीं होगी. तकनीक की च्वाइस imaged किया जा ऊतक के प्रकार और प्रयोग के संदर्भ पर निर्भर है. इस तकनीक जांचकर्ताओं वास्तविक समय में रिपोर्टर जीन अभिव्यक्ति, सेल प्रसार और प्रवास के स्थानिक-सामयिक परिवर्तनों की जांच और संभव पहले की तुलना में अधिक विस्तार से कोशिकाओं की दवा एजेंटों और व्यवहार्यता के लिए रिपोर्टर जीन प्रतिक्रिया का अध्ययन अनुमति देने के लिए अनुमति देगा.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

सहायक टिप्पणियों और उनके रचनात्मक सलाह के लिए तीन अनाम समीक्षक के लिए तकनीकी सहायता के लिए विली सूर्य और डॉ क्रिस Gellynck करने के लिए धन्यवाद. इस काम Sunnybrook सुनवाई पुनर्जनन पहल द्वारा वित्त पोषित किया गया

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagle media Gibco 12430 Multiple brands manufacture this
Basement membrane extract  Corning 354230 Matrigel. Alternative similar products are available from other suppliers.
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Fetal bovine serum Gibco 16000044 Multiple brands manufacture this
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HEPES Gibco 5630080 Multiple brands manufacture this
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100 x N2 supplement Gibco 17502-048 Multiple brands manufacture this
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Ciprofloxacin Sigma Aldrich 17850-5G-F Multiple brands manufacture this
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Hank's balanced salt solution Gibco 14170161 Multiple brands manufacture this. Should be refidgerated before use.
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Fine Forceps Fine Science tools 11254-20 Size number 5
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Insect Pins Fine Science Tools 26001-35 Must be stainless Steel
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50 mm plastic dishes Corning/Falcon 351006 Multiple brands manufacture this
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Glass bottom dishes MatTek P35G-0-10-C The dimensions of the dish are determined by the specifications of the imaging system.  35 mm diameter, 10mm well, number 0 coverslip fits Olympus Vivaview FL.
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Stereomicroscope Zeiss  495101-9804-000  Stemi 2000 model. multiple brands manufacture similar items
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Cold Light Source Zeiss 000000-1063-182 Multiple brands manufacture similar items
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Fluorescent Stereomicroscope  Leica microsystems Contact Leica microsystems Leica M165-FC. Multiple brands manufacture similar items
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Incubator Microscope +imaging software Olympus Contact Olympus Inverted microcope sealed inside a Co2 incubator. Vivaview FL incubator microscope with proprietry Metamorpoh imaging software.
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Clean bench Thermo Scientific 51029701 Multiple brands manufacture similar items
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CO2 incubator Thermo Scientific 3310 Multiple brands manufacture similar items
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Laminar Flow hood Thermo Scientific 51026651 Multiple brands manufacture similar items
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Mulvaney, J. F., Dabdoub, A. Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants. J. Vis. Exp. (93), e52101, doi:10.3791/52101 (2014).

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