Summary
Imágenes en vivo de la cóclea de mamíferos embrionario es un reto porque los procesos de desarrollo en la mano operan en un gradiente temporal de más de diez días. Aquí presentamos un método para cultivar y luego la formación de imágenes de embriones tejido explante coclear tomado de un ratón reportero fluorescente en cinco días.
Abstract
Aquí presentamos un método para obtener imágenes de lapso de tiempo a largo plazo de los explantes cocleares de ratón embrionarias en vivo. El programa de desarrollo responsable de la construcción de la muy ordenada, compleja estructura de los ingresos cóclea de mamíferos durante unos diez días. Con el fin de estudiar los cambios en la expresión génica durante este período y su respuesta a farmacéutico o la manipulación genética, de formación de imágenes a largo plazo es necesario. Anteriormente, imágenes en vivo ha sido típicamente limitada por la viabilidad del tejido explantado en una cámara humidificada encima de un microscopio estándar. Dificultad en el mantenimiento de las condiciones óptimas para el crecimiento del cultivo con respecto a la humedad y la temperatura ha puesto límites en la longitud de los experimentos de imagen. Un microscopio integrado en una incubadora de cultivo de tejidos modificados ofrece un excelente ambiente para la formación de imágenes a largo plazo en directo. En este método se demuestra cómo establecer ratón embrionario explantes cocleares y cómo utilizar un microscopio incubadora para realizar Imagi lapso de tiempong utilizando tanto de campo brillante y microscopía fluorescente para examinar el comportamiento de un día típico embrionario (E) 13 explante coclear y Sox2, un marcador de las células prosensoriales de la cóclea, durante 5 días.
Introduction
La cóclea de los mamíferos es un órgano complejo altamente ordenada. En el ratón, entre la aparición del oído interno primitiva de la vesícula ótica en el día E11 y la finalización del programa de desarrollo en las etapas postnatales tempranas, múltiples oleadas de la señalización celular y los cambios coordinados en la expresión génica se llevan a cabo. Que va desde la base al ápice del conducto coclear es el sonido detectar epitelio sensorial, o el órgano de Corti. Desarrollo del órgano de Corti está exquisitamente controlada de tal manera que al final del desarrollo, que consistirá en una sola fila de células ciliadas internas, tres filas de células ciliadas externas intercalados con cinco filas de células de apoyo (dos filas de células pilar, tres hileras de células Deiters ') 1. La desviación de esta precisos resultados de orden en la pérdida de audición, heighlighting la importancia de studye deEl génesis y el patrón de la epithemlium sensorial 2.
En el cultivo in vitro de la coch ratón embrionariolea es una herramienta esencial en el estudio de los mecanismos de desarrollo del órgano de Corti. Esta técnica fue establecida en 1974 y en los últimos 40 años, ha sido utilizado para dilucidar muchos de los mecanismos por los que se especifica el epitelio sensorial y el órgano de Corti estableció 3. La cóclea es un órgano complejo con los procesos de desarrollo dinámicos; una manipulación puede llegar a tardar hasta siete días para manifestar 1. Por ejemplo, cuando la adición de inhibidores de GSK 3β a un cultivo de explantes cocleares en E13, el período de incubación óptimo para observar un efecto robusta del compuesto es de seis días 4.
Imágenes en vivo de la cóclea permite el desarrollo de investigación sobre los cambios en la morfología del órgano de Corti, los cambios en la expresión génica, el seguimiento de la migración, proliferación o células que mueren, y que permite la observación en tiempo real de los resultados de los agentes farmacéuticos y la alteración de la señalización vías. Hasta ahora, la imagen en directo de la cócleaprincipalmente se ha realizado utilizando microscopía confocal para pequeñas áreas de imagen del órgano de Corti en períodos de tiempo cortos 5-8, pero esta técnica tiene limitaciones debido a la viabilidad de explante. En las imágenes de los efectos de las manipulaciones a largo plazo sobre los procesos de desarrollo lento, el entorno de imagen es crucial. Normalmente, un sistema de imagen confocal en vivo utiliza una caja de plástico humidificado que se sienta en el microscopio. El calor y la humedad pueden escapar a través de los huecos en el cuadro de la incubación de donde se encuentra con la mesa del microscopio, a través de las ventanas de acceso, a través de las aberturas de bisagra y a través de los huecos alrededor de varias partes de la Microscopio- tales como el objetivo o la fuente de luz. Este no es óptimo para el mantenimiento de explantes sanos durante más de dos o tres días.
Definimos 'microscopio incubadora' como un microscopio invertido sellado dentro de un incubador de CO2 estándar, en lugar de una incubadora construida alrededor del microscopio. Un microscopio incubadora extiende la vida del experimento de tal manera que en lugar de formación de imágenes de más de dos o tres días, las muestras se pueden obtener imágenes de hasta dos semanas. Un microscopio incubadora ofrece un excelente ambiente para el crecimiento y la diferenciación celular, con el menor trastorno posible a explante culturas y condiciones estándar controlado. En los estudios que se llevan a cabo a través de múltiples día es común que recurrir a muestras de formación de imágenes sobre una base diaria por la eliminación de ellos de la incubadora y llevándolos a un microscopio de fluorescencia invertido. Si bien este enfoque puede funcionar, la eliminación de los platos de la incubadora inflige presión sobre el tejido en desarrollo sensible. Los cambios en la acidez del medio de cultivo y las fluctuaciones en la temperatura debido a la eliminación de la incubadora pueden resultar en el desarrollo subóptima y tejido enfermo. Imágenes de la misma región en el mismo plano focal y en la misma orientación en cada punto de tiempo es extremadamente difícil. Mediante el uso de un sistema automatizado dentro de una incubadora, es posible mantener saludabletejido, para recoger imágenes en más puntos de tiempo y para garantizar que la misma área es capturada en cada fotograma. En los últimos años se han desarrollado varias incubadoras de tejido microscopio integrados, estos han sido útiles no sólo en la práctica clínica 9, sino también en células madre y la investigación del cáncer 10,11.
Aquí se presenta un protocolo para obtener imágenes en vivo a largo plazo de explantes cocleares embrionarias de ratón. Utilizamos un sistema de microscopía automatizada dentro de un incubador de CO2 estándar que tiene la capacidad de capturar imágenes de múltiples muestras en los puntos de tiempo establecidos. El sistema consta de un microscopio invertido conjunto dentro de una incubadora. Las muestras se colocan en una tarima giratoria que permite obtener imágenes de múltiples muestras en cada punto de tiempo. La iluminación, la captura de imágenes, y la rotación de la tarima están controlados por un sistema automatizado operado a través de software Metamorph. Al establecer una rutina de imágenes utilizando el software de funcionamiento podemos establecer un experimento para funcionar durante un máximo de two semanas, con mínima intervención humana. En este ejemplo usamos tanto de campo claro y fluorescencia para mostrar el crecimiento a gran escala y la reordenación de la cóclea, y en concreto, la región prosensorial. En este experimento, cochleae será disecado de ratones reportero EGFP Sox2 en el día embrionario E13. Se establecerá cultivos in vitro y luego fotografiada durante cinco días.
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Protocol
Tejido de ratón fue cosechada de Sox2 EGFP -reporter ratones 12 mantenidos y sacrificados de acuerdo con el Consejo Canadiense de Cuidado de Animales directrices para el cuidado y uso de animales de laboratorio.
1. El cultivo embrionario cochleae
- Suplemento Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) mediante la mezcla de 8,89 ml de DMEM, 1 ml de suero bovino fetal (FBS), 100 l de 100x suplemento N2, y 10 l de 10 mg / ml de ciprofloxacina. Suplemento solución salina equilibrada de Hank (HBSS) mediante la mezcla de 495 ml de HBSS con 5 ml de HEPES 100%.
- Preparar vidrio placas de cultivo de fondo:
- En una campana de flujo laminar, resuspender 200 l sótano sustrato extracto de membrana en 5 ml de DMEM. Preparar 35 mm de vidrio de diámetro inferior con placas de cultivo de 10 pozos mm. Pipetear 150 l de sustrato / DMEM en el centro de cada plato de fondo de cristal. Estos platos se pueden utilizar después de 40 min de incubación, o pueden almacenarse en un CO 2 NOTA: Vidrio de fondo platos se utilizan por las siguientes razones: para asegurarse de que la base del plato es transparente y adecuada para formación de imágenes, para crear un pozo en el centro del plato que permite a los explantes a establecerse en una zona de fácil situado y finalmente de modo que después de un experimento de la muestra se puede procesar para la inmunotinción y el análisis subsiguiente.
- Prepare la estación de trabajo y herramientas:
- Encienda el flujo laminar banco limpio, y rocíe con EtOH al 70% para crear un espacio de trabajo limpio. Remoje pinzas, cucharas y un negro 184 plato de elastómero de silicona (una mezcla de 184 elastómero de silicona (10 partes), agente (1 parte) y polvo de carbón vegetal (2,5 g) de curado) en EtOH al 70%.
- En la estación de trabajo limpia, embriones de cosecha para el experimento. Recoger los embriones de la gestación apropiado en hielo frío HBSS suplementado con 1% HEPES.
- Determinar un órgano externo o visible que demostraráactividad de reportero y examinar los embriones utilizando un microscopio estereoscópico fluorescente. Recoger los embriones que presentan actividad de reportero en el hielo frío HBSS suplementado con 1% de HEPES como éstos son objeto del experimento.
- Recoger los huesos temporales:
- Trabajando rápidamente, utilizando una fuente de luz fría y unas pinzas finas, recoger las cabezas de los cachorros. Tenga cuidado de clip en las vértebras cervicales y debajo de la mandíbula para evitar daños a los huesos temporales.
- Abra cuidadosamente el cráneo. Retire el cerebro, recortar la parte delantera de la cabeza, y transferir el cráneo posterior a hielo fresco HBSS frío suplementado con 1% de HEPES en un plato limpio. Diseccionar cuidadosamente los huesos temporales con forma de maní, teniendo cuidado de mantener el sistema vestibular en el tacto.
- Diseccionar la cóclea:
- La transferencia de los huesos temporales a un plato recubierto de elastómero de silicona negro en el hielo frío HBSS suplementado con 1% de HEPES, el pin de la región vestibular del hueso. Inserte clavijas de insectos enun ángulo oblicuo con el fin de estabilizar el hueso temporal y crear espacio para los fórceps. Prender con alfileres es un paso crucial en el proceso como si se permite que el hueso temporal para moverse demasiado, es muy difícil de cosechar una cóclea intacta.
- Retire con cuidado el cartílago que rodea la cóclea. Inserte una púa de las pinzas en el cartílago en el borde exterior de la base de la cóclea y el clip de un agujero en el cartílago.
- Clip una solapa hacia arriba el lado, inserte el diente de las pinzas y separar suavemente el techo del conducto desde el cartílago. Clip horizontalmente a través de la parte superior y en diagonal, y levante con cuidado la sección delantera de la cápsula. Inserte una punta de las pinzas en entre el cartílago restante y el conducto y el clip suavemente de la última sección. La superficie apical de la cóclea está ahora expuesto.
- Comenzando en la base, coger el área donde el techo del conducto coclear se encuentra con el epitelio y abra el conducto coclear. Tienes que despegar de la azotea, el recortecuando sea necesario, hasta que se elimina por completo. Se quita porciones de membrana izquierda en el lado medial del conducto. Limpiar el conducto de exceso de tejido mesenquimal y separar el conducto desde el sistema vestibular.
- Cultura de los explantes:
- Publicar un explante, luminal superficie hacia arriba, en el centro de una placa de cultivo de vidrio recubierta inferior sustrato, cuidadosamente extrayendo todo el líquido y dejar actuar durante dos minutos. Añadir 150 ml de DMEM complementado gota a gota para el explante, teniendo cuidado de no molestar a ella. Si el explante flotar libremente, vuelva a colocar con pinzas, pero tener cuidado de que el explante se deposita en el fondo del plato de manera que se puede unir al sustrato.
- Coloque los platos de fondo de cristal en un profundo 12 cm placa de Petri de diámetro, con un pequeño plato de agua estéril para mantener la humedad. Ponga las culturas en las que un 35 ° C incubadora durante la noche para que el explante para adjuntar al sustrato y aplanar.
2. Vivo ImagING
- Seleccionar muestras de explantes. Utilice un microscopio estereoscópico de fluorescencia para evaluar la condición de cada cóclea explantado. Sólo seleccione explantes donde el conducto está intacto y unido al cristal de la base al ápice.
- Ajuste la incubadora a 35 ° C con 5% de CO 2 al tejido coclear cultura. Ponga las culturas en el microscopio incubadora:
- Aspirar suavemente la DMEM suplementado y reemplazar con al menos 500 l de medio nuevo. Para obtener imágenes de hasta 6 días, 1-1,5 ml es mejor. En los casos en los explantes están vagamente conectados, una pipeta un anillo de los medios de comunicación alrededor del borde del plato. Este líquido adicional hará una 'cámara de humidificado' miniatura sin perturbar el explante mientras se sigue concediendo a la matriz.
- Como alternativa, el uso de bisagras plato cubre para abrir los párpados, mientras que el plato se mantiene en su adaptación en el microscopio si los reactivos deben ser intercambiados durante los intervalos entre las colecciones de imágenes. Tapas de platos de bisagras permiten que las tapas seanabierto sin molestar a las muestras o la eliminación de los platos de su configuración. Esto mantiene su posición exacta para capturas de imágenes posteriores.
- Inserte los platos de cristal inferior que contienen muestras adecuadas en el soporte de plato de muestra. El microscopio en este ejemplo tiene una plataforma giratoria que tiene ocho platos de 35 mm de la muestra.
- En virtud de la campana de flujo laminar reemplazar las tapas de plástico con tapas de vidrio e insertar los platos en el soporte de plato de muestra. Coloque el soporte de platos de la muestra dentro de la incubadora teniendo cuidado de no desalojar los explantes de la parte inferior del plato o molestar a los medios de comunicación.
- Aspirar suavemente la DMEM suplementado y reemplazar con al menos 500 l de medio nuevo. Para obtener imágenes de hasta 6 días, 1-1,5 ml es mejor. En los casos en los explantes están vagamente conectados, una pipeta un anillo de los medios de comunicación alrededor del borde del plato. Este líquido adicional hará una 'cámara de humidificado' miniatura sin perturbar el explante mientras se sigue concediendo a la matriz.
- Establecer la rutina de imagen:
- Encienda el microscopio, lámpara UV y la cámara y abra el software de imágenes.
- Busque las muestras, escoger un área de imagen, el plano de enfoque y ajustar los tiempos de exposición para cada plato en secuencia. Elija el plano de enfoque dependiendo no sólo de la vista del explante en el momento de partida, pero alpor lo que teniendo en cuenta cómo el tejido se moverá y el tiempo que el curso del tiempo se ejecutará.
- Establecer una pila Z centrado alrededor del plano focal seleccionada en el canal de fluorescencia. Ajuste la frecuencia y la duración de la toma de muestras para el experimento. La frecuencia de muestreo será limitado por el tiempo que se necesita para recoger imágenes, por lo que esta debe determinarse después de seleccionar campos de visión y el establecimiento de una pila Z. En este caso, el muestreo se lleva a cabo cada 30 minutos durante cinco días. La duración del experimento puede ser de hasta 14 días.
- Generar una película:
- Al final del período de tiempo transcurrido abrir los archivos de imagen. En este caso el software Metamorph que se abre puntos de recogida secuenciales se utiliza. Cuadro por cuadro elegir el mejor plano focal para mostrar la población celular de interés.
- Convertir estas imágenes en un archivo .avi o exportarlos como un montaje para generar un conjunto de imágenes que se pueden abrir y analizados en el software de procesamiento de imágenes o convertir en múltiple-formats utilizando el software de procesamiento de vídeo.
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Representative Results
Aquí mostramos un montaje (Figura 1) y una película (Figura 2) que demuestra cómo una típica explante coclear organotípico crecerá si chapado en E13.5. Un reportero del ratón Sox2 se utiliza para visualizar la región prosensorial. La película ilustra que la cóclea se somete a crecimiento y la convergencia y la extensión, las células en la región lateral del dominio Sox2 verde no parecen dividir como el tejido circundante se expande. Esta es una característica del órgano de Corti; E13 en el epitelio sensorial prospectivo sale del ciclo celular y posteriormente se conoce como la zona de la no proliferación 13. Un segundo experimento de lapso de tiempo centrado en la base de un explante mediados coclear diferente (Figuras 3 y 4) demuestra que la medida que se extiende, la región prosensorial se estrecha. Tenga en cuenta que después de tres días en cultivo del tejido se ha aplanado considerablemente de tal manera que es posible visualizar indivicélulas fluorescentes duales, mientras que al principio hay regiones donde la reflexión interna de la luz debido al espesor del tejido hacen posible identificar regiones de expresión, pero no las células individuales.
Figura 1:. Tiempo - imágenes de lapso de tejido coclear reportero Sox2 recogido más de cinco días Este montaje muestra el progreso del crecimiento del explante de partida en el día cero y terminando en el quinto día, el muestreo cada 30 minutos utilizando un objetivo de 10X. El explante se estableció el E13 y se cultivaron durante la noche antes de la imagen. A medida que el explante madura que tanto crece y se somete a los movimientos de extensión convergentes. (A) imágenes secuenciales que muestran el grado de crecimiento coclear a intervalos de 12 h. Canal de luz visible cubrió de gen GFP fluorescenciacalificado por el reportero EGFP Sox2. canal de fluorescencia (B) sólo GFP. La barra de escala corresponde a 200 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.
Figura 2 :. animación de lapso de tiempo de tejido coclear reportero Sox2 recogido más de 5 días Este es el mismo experimento explante indica en la Figura 1, esta vez los marcos se seleccionan a intervalos de 30 min durante 5 días y se combinaron como un archivo .avi para generar una película.
Figura 3:. Mediados de someterse a base de movimientos de CE y aplanamiento SequentiAL imágenes que muestran que el epitelio prosensorial de la base de MID (EGFP) se estrecha, se extiende y se aplana en el transcurso de 5 días. Las flechas indican región que se estrecha. Marcos seleccionados a partir de una secuencia de lapso de tiempo de 5 días en intervalos de 12 h utilizando un objetivo de 10X. La barra de escala corresponde a 200 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.
Figura 4 : animación Time-lapse de la base de mediados de someterse a los movimientos de la CE y el aplanamiento secuencia de lapso de tiempo de animación que muestra la convergencia y la extensión del epitelio sensorial se muestra en la Figura 3 con cuadros seleccionados en intervalos de 30 min..
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Discussion
Hay varios puntos técnicos a tener en cuenta cuando se establecen las culturas y en la creación del microscopio de lapso de tiempo para que la imagen a largo plazo.
Utilizamos matriz de membrana basal como sustrato para el cultivo de explantes cocleares, pero el sustrato debe corresponder al tipo de células. Por ejemplo, para cultivos neuronales de la imagen, puede ser mejor para proporcionar un revestimiento fibronectina. La temperatura de incubación y la composición de gas también deben ser elegidos según el tipo de tejido. La elección de la edad del explante es importante. Comenzamos en E13 en la primera porque en E12 la dirección del crecimiento es menos predecible. Como es esencial que los explantes se cultivan durante la noche para unir al sustrato, los experimentos deben ser planificadas para comenzar el día siguiente. Si un experimento es comenzar a E15 o más viejos, los cultivos deben establecerse sobre E13 como el tiempo, el tejido se aplana y se extiende de modo que las células son más fáciles de imagen (véase la Figura 3). Si el órgano de Corti es en ser fotografiado, es esencial que la cóclea se diseca cuidadosamente. Nicks en el borde lateral del explante romper la tensión interna del tejido, por lo tanto, cuando la cóclea sufre reordenamientos morfológicas, derrame '' las células a través de la formación de una 'v' protrusion.This protuberancia en forma de lágrima puede mover la región de interés fuera de la vista . Además, se debe tener cuidado para eliminar la mayor cantidad de la cubierta del conducto en el lado medial como sea posible. Este tejido continúa proliferando como el explante se expande y puede crecer sobre la parte superior de la región de interés ocultando de la vista.
Al configurar la rutina de imágenes, el crecimiento y los cambios en la morfología de la cóclea se deben considerar cuidadosamente. El objetivo debe ser elegido sobre la base no sólo del tamaño de la región para obtener imágenes, sino también teniendo en cuenta si esa región se moverá o ampliar. Las células en la región medialde la cóclea (Figura 1 y 2) se dividen y se mueven dentro de un área confinada, por lo que una gran ampliación puede ser utilizado (20X, 40X, 60X). Las células en el órgano de Corti o el epitelio lateral, sin embargo, se moverán como el explante crece; un aumento menor (10X o 20X) es mejor, ya que las posibilidades de que las células permanecerá en el campo de visión son más altos. Obtención de imágenes de regiones fijas de la cóclea es posible a altas magnificaciones. Elegimos utilizar un objetivo de 10X en la sección de resultados representativos porque hemos querido mostrar todo el explante, y debido a que el movimiento de los tejidos es dinámica en las primeras etapas.
Siguiente a considerar es el plano de enfoque. Dado que el explante crecerá hacia el exterior y aplanar, es probable que el plano focal va a cambiar dramáticamente en el transcurso del tiempo. Si la región de interés es el órgano de Corti o epitelio lateral, anticipando esto y centrarse en las células que migran fuera del explante puede ayudar. Esto es alpor lo que un argumento para el uso de los objetivos de aumento más bajo. Es posible establecer pilas Z, tanto para fluorescencia y DIC. Si las células de interés son probable que se mueva fuera de foco, la creación de una pila Z de 3-5 micras por paso puede contrarrestar esto, especialmente si el último paso es en el plano de la cubierta de vidrio. Puede ser difícil elegir el plano correcto durante la visualización de las culturas en el día uno, como la densidad de empaquetamiento de las células y la luz del tejido circundante puede prevenir una visión clara reflejada. Al revisar los marcos para generar una película o montaje más tarde, la selección cuidadosa de Z-planos también permite el seguimiento de los movimientos de las células en tres dimensiones. El experimento se puede detener en cualquier momento para ajustar los ajustes de enfoque si la muestra se mueve fuera de rango.
Imágenes en vivo de un explante coclear más de una semana añade una nueva dimensión a la comprensión del desarrollo de la cóclea que complementará imágenes en vivo confocal. Este es un método excelente para usar cuando el órgano de ancho de largo-término examen es necesario, pero no sustituirá a alta magnificación de imagen confocal para estudios de células solo a corto plazo. Elección de la técnica depende del tipo de tejido a la imagen y el contexto del experimento. Esta técnica permitirá a los investigadores para examinar los cambios espacio-temporales en la expresión del gen indicador, la proliferación celular y la migración en tiempo real y permiten el estudio de la respuesta del gen reportero a los agentes farmacéuticos y viabilidad de las células con más detalle que antes era posible.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
¡Gracias a Willy Sun para la asistencia técnica y el Dr. Kris Gellynck por sus valiosos comentarios y tres revisores anónimos por sus consejos constructivos. Este trabajo fue financiado por la Iniciativa de Regeneración Audiencia Sunnybrook
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle media | Gibco | 12430 | Multiple brands manufacture this |
| Basement membrane extract | Corning | 354230 | Matrigel. Alternative similar products are available from other suppliers. http://catalog2.corning.com/Lifesciences/en-US/Shopping/Product.aspx?categoryname=Cell+Culture+and+Bioprocess%28Lifesciences%29|Extracellular+Matrix+Proteins+ECMs+and+Attachment+Factors%28Lifesciences%29|Matrigel+Basement+Membrane+Matrix+%28Lifesciences%29 |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000044 | Multiple brands manufacture this http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=fbs&resultPage=1&results PerPage=15&autocomplete= |
| HEPES | Gibco | 5630080 | Multiple brands manufacture this http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=hepes&resultPage=1&results PerPage=15&autocomplete= |
| 100 x N2 supplement | Gibco | 17502-048 | Multiple brands manufacture this http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=n2&resultPage=1&results PerPage=15&autocomplete= |
| Ciprofloxacin | Sigma Aldrich | 17850-5G-F | Multiple brands manufacture this http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/17850?lang=en®ion=CA |
| Hank's balanced salt solution | Gibco | 14170161 | Multiple brands manufacture this. Should be refidgerated before use. http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/cell-culture/mammalian-cell-culture/reagents/balanced-salt-solutions/hbss-hanks-balanced-salt-solution.html?s_kwcid=AL!3652!3!26107410508!e!!g!!hbss&ef_id=xoFOglw2s UMAAMU8:20140228185720:s |
| Fine Forceps | Fine Science tools | 11254-20 | Size number 5 http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=350&CategoryId=29 |
| Curette | Fine Science Tools | 10080-05 | size 1 mm http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=91&CategoryId=118 |
| Insect Pins | Fine Science Tools | 26001-35 | Must be stainless Steel http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=124 |
| 50 mm plastic dishes | Corning/Falcon | 351006 | Multiple brands manufacture this |
| charcoal | Sigma Aldrich | 05105-250G | Multiple brands manufacture similar items http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/05105?lang=en®ion=CA |
| 184 silicone elastomer | Dow/Corning | SYLGARD® 184 SILICONE ELASTOMER KIT | Dishes are home made several weeks in advance. Silicone elastomer can be from any supplier.http://www.dowcorning.com/applications/search/products/Details.aspx?prod=01064291 |
| Glass bottom dishes | MatTek | P35G-0-10-C | The dimensions of the dish are determined by the specifications of the imaging system. 35 mm diameter, 10mm well, number 0 coverslip fits Olympus Vivaview FL. http://glass-bottom-dishes.com/catalog/index.php?main_page=product_info&cPath= 1_4_15&products_id=2 |
| Stereomicroscope | Zeiss | 495101-9804-000 | Stemi 2000 model. multiple brands manufacture similar items http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/stereo-zoom-microscopes/stemi-2000.html |
| Cold Light Source | Zeiss | 000000-1063-182 | Multiple brands manufacture similar items http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/microscope-components/lightsources.html |
| Fluorescent Stereomicroscope | Leica microsystems | Contact Leica microsystems | Leica M165-FC. Multiple brands manufacture similar items http://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/fluorescence/details/product/leica-m165-fc/ |
| Incubator Microscope +imaging software | Olympus | Contact Olympus | Inverted microcope sealed inside a Co2 incubator. Vivaview FL incubator microscope with proprietry Metamorpoh imaging software. http://olympuscanada.com/seg_section/product.asp?product=1055&c=0 |
| Clean bench | Thermo Scientific | 51029701 | Multiple brands manufacture similar items http://www.thermoscientific.com/en/product/heraguard-eco-clean-bench.html |
| CO2 incubator | Thermo Scientific | 3310 | Multiple brands manufacture similar items http://www.thermoscientific.com/en/products/co2-incubators.html |
| Laminar Flow hood | Thermo Scientific | 51026651 | Multiple brands manufacture similar items http://www.thermoscientific.com/en/products/biological-safety-cabinets-clean-benches.html |
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