Summary
胚胎哺乳动物耳蜗的实时成像是具有挑战性的，因为手头的发育过程超过十天时间梯度进行操作。在这里，我们提出了培养，然后从成像荧光记者鼠标采取了五天的胚胎耳蜗植体组织的方法。
Abstract
在这里，我们提出了活鼠胚胎的耳蜗植长期时间推移成像的方法。负责建设的哺乳动物耳蜗收益的高度有序的，复杂的结构，大约十天后的发展计划。为了研究在此期间基因表达的变化和它们的响应的药物或基因操作，长期成像是必要的。先前，实时成像已经典型地通过移植组织的存活，在湿润的腔室顶上标准显微镜的限制。难以保持对培养物生长有关的湿度和温度的最佳条件已经放置在成像实验的长度的限制。显微镜集成到修改后的组织培养孵化器提供长期，实时成像的良好环境。在这个方法中，我们演示了如何建立胚胎小鼠耳蜗植，以及如何使用孵化器的显微镜来进行时间的推移意马使用毫微都亮场和荧光显微镜检查的典型胚胎天（E） - 13耳蜗植体和Sox2，耳蜗的prosensory细胞的标记，在5天的行为。
Introduction
哺乳动物耳蜗是高度有序的复杂器官。在小鼠中，从上一天E11耳泡和发育程序完成后，将原始内耳的出现在出生后早期阶段之间，细胞信号转导的多种波和协调的基因表达的变化发生。从基本运行到顶点的蜗管的是声音探测感觉上皮尔蒂的，或器官。柯蒂氏器的发展精美控制，使得通过显影结束时，其将包括内毛细胞的单排，三排外毛细胞的散布有五排支持细胞（两列支柱细胞，三行Deiters'细胞）1。偏离这个精确的顺序会导致听力下降，heighlighting studye的国税发起源和感官epithemlium 2的图案化的重要性。
在胚胎小鼠COCH的体外培养LEA是研究Corti器的发展机制的一个重要工具。该技术成立于1974年，并在过去的40年中，一直被用来阐明许多由感官上皮规定和Corti器建立3的机制。耳蜗是一个复杂的器官的动态发育过程;一个操作可能需要长达7天的表现1。例如，添加GSK3β抑制剂在E13耳蜗植体培养时，最佳的潜伏期，观察该化合物的一个健壮效果为6天4。
显影耳蜗的实时成像可以调查变化的柯蒂氏器的形态，基因表达的变化，跟踪迁移的，增殖或死亡的细胞，并允许实时观察药剂的结果的和信号的中断途径。到现在为止，住耳蜗的摄像已经主要使用共聚焦显微镜对柯蒂氏在短时间内5-8的脏器图像的小区域进行的，但该技术具有由于外植体存活的局限性。在较长期的操作慢发育过程的影响成像，成像环境是至关重要的。典型的共焦实时成像系统采用的加湿塑料箱，它位于所述的显微镜。热和湿度，可以通过在孵育箱那里它满足显微镜台，通过接入窗，通过铰链孔，并通过围绕microscope-各部分的间隙的间隙逸出，如目标或光源。这不是最优的用于维持健康植超过两三天。
我们定义“孵化显微镜'为倒置显微镜内部的标准的CO 2培养箱中密封，而不是在显微镜周围建造一个孵化器。孵化器显微镜前趋于实验的寿命，使得而非成像在两三天，样品可以被成像长达两周。培养箱显微镜提供用于细胞生长和分化良好的环境，以最小的干扰外植体培养物和标准控制的条件。在研究，发生在多天里，通常通过从培养箱中取出，并携带它们到一个倒置荧光显微镜诉诸成像样品，每天。虽然这种方法可以工作，从培养箱中取出盘子对其造成的敏感发展组织应力。由于除去从孵化器中的更改培养用培养基和波动的温度的酸度可导致次优的发展和不健康的组织。成象的区域在同一焦平面上，并在相同的取向，在每一个时间点是非常有挑战性的。通过利用恒温箱中的自动化系统，它能够维持健康组织，采集图像，在多个时间点，并确保在同一区域被捕获在每一帧。近年来几个集成显微镜组织培养箱被开发出来，这些不仅在临床实践9，而且在干细胞和癌症研究10,11是有用的。
在这里，我们提出了一个协议，用于胚胎小鼠耳蜗外植体的长期实时成像。我们使用自动显微镜系统内部的标准的CO 2培养箱具有捕获多个样品的图像在设定的时间点的能力。该系统由一个倒置显微镜孵化器内设定的。样品被放置在一个旋转的讲台，允许多个样品的成像在每个时间点。照明，图像采集和讲台的旋转是通过的Metamorph软件操作的自动化系统控制。通过操作软件设置的成像程序，我们可以设置一个实验，运行长达TWØ周以最少的人工干预。在这个例子中我们使用两个亮场和荧光显示大规模增长和耳蜗的重排，并且具体地，prosensory区域。在该实验中，耳蜗将从Sox2的EGFP报告小鼠解剖胚胎天E13。 在体外培养物将被建立，然后成像五天。
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Protocol
小鼠组织从Sox2的EGFP收获-reporter维护和安乐死按照中国的护理和使用实验动物的动物护理准则加拿大议会小鼠12。
1.培养胚胎耳蜗
- 通过混合8.89毫升DMEM中，加入1ml的胎牛血清（FBS），100微升100×N2补充，和10μl的10mg / ml的环丙沙星补充的Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）。通过混合495毫升的HBSS，用5毫升100％的HEPES补充Hank氏平衡盐溶液（HBSS）中。
- 准备玻璃底培养皿：
- 在层流罩，悬浮200μl的基底膜提取物衬底的5ml DMEM中。准备直径35 mm的玻璃底培养皿10毫米井。吸取150微升底物/ DMEM在每个玻璃中央见底菜。这些菜可以使用后40分钟温育，或可以存储在CO 2 注：玻璃有底菜肴用于下列原因：以确保盘的底部是透明的并且适于成像，以良好的，其允许外植体，以解决在一个容易找到区和最后的盘的中心创建一个使一个试验后的样品可用于免疫染色及随后的分析处理。
- 准备工作站和工具：
- 打开层流洁净工作台，并喷洒下来用70％乙醇，以创造一个干净的工作空间。浸泡镊子，勺子，和一个黑色184硅酮弹性体培养皿（184硅酮弹性体（10份）混合，固化剂（1份）和木炭粉（2.5克））在70％EtOH中。
- 在洁净工作台，收获胚胎的实验。收集在冰适当妊娠冷HBSS中补充有1％HEPES的胚胎。
- 确定外部或可见机关将展示用荧光立体显微镜报告基因活性并检查胚胎。收集表现出报告基因活性在冰冷的HBSS中补充有1％HEPES，因为这些是在实验的受试者的胚胎。
- 收集颞骨：
- 工作迅速，使用冷色光源和细镊子，收集幼崽的头。照顾到夹在颈椎和下颚下方，以避免损坏的颞骨。
- 小心地打开头盖骨。取出脑，修剪过的头部的前部，并且所述后颅骨转移到新鲜的冰冷的HBSS在干净的培养皿补充有1％HEPES。仔细剖析出花生形颞骨注意保持前庭系统的机智。
- 解剖耳蜗：
- 传送颞骨到在冰黑硅弹性体涂覆的培养皿冷HBSS中补充有1％HEPES，针骨的前庭区域。插入昆虫针在的倾斜角，以稳定的颞骨和创建房间的钳子。钉扎是在这个过程中的一个关键步骤，因为如果颞骨被允许移动至太大，很难收获完整的耳蜗。
- 小心取出围绕耳蜗的软骨。插入钳子的一个齿进入软骨在耳蜗的基底的外边缘和夹子的孔进入软骨。
- 夹的翼片向上侧，插入钳子的齿和轻轻分开从软骨管道的屋顶。剪辑水平穿过顶部和倾斜，并小心地取下胶囊的前部。插入镊子的一个叉头中剩余的软骨与管道之间并轻轻夹关闭最后一节。耳蜗的顶端面现露出。
- 开始在基，抓其中所述导管的屋顶满足耳蜗上皮面积和打开耳蜗管。轻轻撕下屋顶，修剪必要时，直到它被完全除去。剪掉膜左内侧上的导管中的任何部分。清理多余的间叶组织的管道，并从分离的前庭系统的风管。
- 文化的外植体：
- 将外植体，腔表面了，在一个基板镀膜玻璃底培养皿的中心，精心编制了所有的液体，留下了两分钟。加入150微升补充DMEM落明智的外植体，注意不要打扰它。应的外植体自由漂浮，定位钳，但要小心，外植体沉淀到培养皿的底部，使得它可以连接到基板上。
- 将玻璃底菜在深直径12cm的培养皿中，用一小碟的无菌水来保持湿度。将培养物在一个35℃的培养箱中过夜，以使外植体附着到基片和压平。
2.现场的ImagING
- 选择植样本。用荧光立体显微镜来评估每个外植耳蜗的条件。只有选择的外植体，其中所述管道是完好并附着在玻璃从基部到顶点。
- 设置培养箱中于35℃，5％CO 2下培养耳蜗组织。把文化进入孵化器的显微镜：
- 轻轻吸过的DMEM补充和替换，至少500微升新鲜培养基。用于成像长达6天，1-1.5毫升为好。在其中植体的连接不牢固的情况下，吸取的媒体的环周围的盘的边缘。这个额外的液体将一个微型“加湿室'而不干扰外植体，而它仍然附着于基质。
- 可选地，使用铰接盘覆盖，打开盖子，而盘停留在其在显微镜嵌合如果试剂需要在图像集合之间的时间间隔交换。铰链盖菜让盖被开不干扰样品或从它们的设置去除菜肴。这样可保持其对后续的图像捕捉精确位置。
- 将包含相应的样品放入样品盘架的玻璃底菜。在本实施例的显微镜具有旋转平台，保持835毫米样品菜肴。
- 在层流罩更换塑料盖用玻璃盖并插入餐具放入样品盘支架。将样品盘支架培养箱照顾内不从培养皿的底部去除所述外植体或扰乱介质。
- 轻轻吸过的DMEM补充和替换，至少500微升新鲜培养基。用于成像长达6天，1-1.5毫升为好。在其中植体的连接不牢固的情况下，吸取的媒体的环周围的盘的边缘。这个额外的液体将一个微型“加湿室'而不干扰外植体，而它仍然附着于基质。
- 成立了成像程序：
- 交换机上的显微镜，紫外灯和摄像头，打开图像处理软件。
- 找到样品，挑的成像区域，重点平面和调整曝光时间顺序每道菜。选择焦点不仅取决于外植体在起动时的视图的平面，但人所以铭记如何组织将移动多久的时间过程会运行。
- 设置为Z堆栈围绕所选焦平面定心在荧光通道。设置采样进行实验的次数和时间长度。采样的频率也由它需要采集图像的时间是有限的，所以这应该在选择视场和设置为Z堆叠后确定。在这种情况下，需要采样的地方，每隔30分钟，超过五天。在实验的持续时间可长达14天。
- 生成的电影：
- 在时间流逝期结束打开的图像文件。打开连续采集点在这种情况下的Metamorph软件使用。逐帧选出最佳焦平面为示出感兴趣的细胞群。
- 这些图像转换为.avi文件，或者将其导出为一蒙太奇以生成一组可被打开并分析在图像处理软件或转换为多个预估图像利用视频处理软件TS。
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Representative Results
在这里，我们将展示一个蒙太奇（ 图1），看电影（ 图2），这说明一个典型的器官耳蜗植将如何发展，如果镀上E13.5。一个Sox2的记者鼠标采用可视化的prosensory区域。动画示出了耳蜗经历生长和收敛性和扩展，使细胞中的绿色Sox2的域的横向区域似乎没有划分为围绕它展开的组织。这是Corti器的特性;关于E13准感觉上皮退出细胞周期和随后称为防扩散13的区域。第二个时间推移实验围绕不同的耳蜗植体的中间底部（ 图3和图4）表明，随着它延伸，所述prosensory区域变窄。需要注意的是在培养三天组织已相当平坦化，使得其能够以可视化INDIVI双荧光细胞，而在开始时有区域，其中光由于组织厚度内反射使人们有可能确定表达的区域而不是单个的细胞。
图1：时间-收集五天Sox2的记者耳蜗组织的推移图像这蒙太奇显示的外植体开始生长以第0天，结束第5天，取样用10X物镜，每30分钟的进展。外植体成立于E13和成像前过夜培养。作为外植体的成熟它都生长和发生会聚伸展运动。（A）的连续图像，显示在12小时的时间间隔耳蜗生长的程度。可见光通道覆盖有绿色荧光基因额定的EGFP Sox2的记者。（B）GFP荧光通道而已。比例尺对应于200微米。 请点击这里查看该图的放大版本。
图2 ：定时动画收集5天以上Sox2的记者耳蜗组织的 ，这是在图1中所示的相同的外植体实验中，这个时间帧，在30分钟的间隔选在5天，并组合成一个.avi文件，以产生一个电影。
图3：中秋节基地进行CE运动和整平 Sequenti人的图像，显示了中间基材的prosensory上皮（EGFP）的变窄，延伸并变平超过5天的过程中。箭头指示区域变窄。帧由5天时间流逝序列使用10X物镜12小时的间隔选择。比例尺对应于200微米。 请点击这里查看该图的放大版本。
图4 ：定时动画中期碱进行的CE动作和平坦化的动画时间推移序列表示收敛和延伸在30分钟的间隔选择的帧显示在图3中的感觉上皮的。
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Discussion
有几种技术要点当培养物被建立并在成立的时间推移显微镜为了长期成像来考虑。
我们用基底膜基质作为基质培养耳蜗植体，但在衬底应匹配于细胞类型。例如，将图像的神经元培养物，它可能是更好的是提供一种纤连蛋白涂层。温育温度和气体组成也应当根据组织类型选择。选择外植体的年龄是很重要的。我们开始对E13在最早因为对E12的生长方向是难以预料。因为它是必不可少的外植体是过夜培养，以连接到所述衬底，实验应该计划开始的第二天。如果一个实验是开始在E15或以上，培养应在E13被建立为随着时间的推移，组织变平并扩散，以便在细胞中更易于图像（参见图3）。 如果柯蒂氏器是将要被成像，它是必不可少的耳蜗是非常小心解剖。在所述外植体的横向边缘的刻痕破裂的组织的内部张力，因此当耳蜗经历形状上的重排，细胞“溢出”到撕裂形成和'v'形protrusion.This突起可以移动的感兴趣区域出来的视图。此外，必须小心，以除去尽可能多的管道的屋顶的内侧上成为可能。本组织继续增殖为外植体膨胀，可以生长在感兴趣从视图遮蔽它的区域的顶部。
当设置在成像程序中，生长以及改变耳蜗的形态，必须仔细考虑。目标应该不仅基于要成像的区域的大小，而且还考虑到该区域是否移动或扩展选择。在中间区域的细胞的耳蜗（ 图1和2）划分和一个封闭区域内移动，所以高倍率可以使用（20X，40X，60X）。在尔蒂或横向上皮的器官的细胞，但是，将作为外植体生长而移动;一个较低的放大倍率（10X或20X）是更好的，因为这些细胞将保持在视场中的几率较高。耳蜗的固定区域的成像，可以在高放大倍率。我们选择使用10X物镜在代表性结果部分是因为我们希望以显示整个外植体，并且由于在组织运动是动态的，在早期阶段。
接下来要考虑的是焦点平面。鉴于植将增长向外压平，它是可能的焦平面将极大地改变在时间过程。如果感兴趣的区域是尔蒂或横向上皮的器官，预测这和聚焦于细胞迁移出的外植体可以帮助的。这是人所以使用较低倍物镜的参数。所以可以集合Z堆叠两个荧光和DIC。如果感兴趣的细胞有可能移动至离焦，设置每步3-5微米为Z栈可以解决这个问题，尤其是当最后一步是在玻璃盖的平面。它可能很难在第一天观察培养物时，由于细胞的填料的密度，以选择正确的平面和反射的光从周围的组织可以防止清晰的影像。在审查帧后，生成一个电影或蒙太奇，精心挑选的Z-飞机也允许细胞运动的跟踪在三个方面。该实验可以在任何时候暂停，如果样品移出的范围来调整焦点的设置。
人工耳蜗植了一个多星期的实时成像增加了一个新的层面理解，以补充现场共聚焦成像耳蜗的发展。这是使用时的器官宽长的好方法-term检查是必要的，但不会取代高倍聚焦成像短期单细胞的研究。技术的选择依赖于组织的待成像的类型和实验的情况下。该技术将允许调查研究中报道基因表达，细胞增殖和迁移的实时时空变化和允许的报告基因响应于药剂的细胞生存力和研究中更详细地比以前可能的。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
谢谢孙威利对技术援助和克里斯Gellynck博士有益的意见和三个匿名评审的建设性意见。这项工作是由美国的新宁听力重建倡议
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle media | Gibco | 12430 | Multiple brands manufacture this |
| Basement membrane extract | Corning | 354230 | Matrigel. Alternative similar products are available from other suppliers. http://catalog2.corning.com/Lifesciences/en-US/Shopping/Product.aspx?categoryname=Cell+Culture+and+Bioprocess%28Lifesciences%29|Extracellular+Matrix+Proteins+ECMs+and+Attachment+Factors%28Lifesciences%29|Matrigel+Basement+Membrane+Matrix+%28Lifesciences%29 |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000044 | Multiple brands manufacture this http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=fbs&resultPage=1&results PerPage=15&autocomplete= |
| HEPES | Gibco | 5630080 | Multiple brands manufacture this http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=hepes&resultPage=1&results PerPage=15&autocomplete= |
| 100 x N2 supplement | Gibco | 17502-048 | Multiple brands manufacture this http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=n2&resultPage=1&results PerPage=15&autocomplete= |
| Ciprofloxacin | Sigma Aldrich | 17850-5G-F | Multiple brands manufacture this http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/17850?lang=en®ion=CA |
| Hank's balanced salt solution | Gibco | 14170161 | Multiple brands manufacture this. Should be refidgerated before use. http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/cell-culture/mammalian-cell-culture/reagents/balanced-salt-solutions/hbss-hanks-balanced-salt-solution.html?s_kwcid=AL!3652!3!26107410508!e!!g!!hbss&ef_id=xoFOglw2s UMAAMU8:20140228185720:s |
| Fine Forceps | Fine Science tools | 11254-20 | Size number 5 http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=350&CategoryId=29 |
| Curette | Fine Science Tools | 10080-05 | size 1 mm http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=91&CategoryId=118 |
| Insect Pins | Fine Science Tools | 26001-35 | Must be stainless Steel http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=124 |
| 50 mm plastic dishes | Corning/Falcon | 351006 | Multiple brands manufacture this |
| charcoal | Sigma Aldrich | 05105-250G | Multiple brands manufacture similar items http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/05105?lang=en®ion=CA |
| 184 silicone elastomer | Dow/Corning | SYLGARD® 184 SILICONE ELASTOMER KIT | Dishes are home made several weeks in advance. Silicone elastomer can be from any supplier.http://www.dowcorning.com/applications/search/products/Details.aspx?prod=01064291 |
| Glass bottom dishes | MatTek | P35G-0-10-C | The dimensions of the dish are determined by the specifications of the imaging system. 35 mm diameter, 10mm well, number 0 coverslip fits Olympus Vivaview FL. http://glass-bottom-dishes.com/catalog/index.php?main_page=product_info&cPath= 1_4_15&products_id=2 |
| Stereomicroscope | Zeiss | 495101-9804-000 | Stemi 2000 model. multiple brands manufacture similar items http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/stereo-zoom-microscopes/stemi-2000.html |
| Cold Light Source | Zeiss | 000000-1063-182 | Multiple brands manufacture similar items http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/microscope-components/lightsources.html |
| Fluorescent Stereomicroscope | Leica microsystems | Contact Leica microsystems | Leica M165-FC. Multiple brands manufacture similar items http://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/fluorescence/details/product/leica-m165-fc/ |
| Incubator Microscope +imaging software | Olympus | Contact Olympus | Inverted microcope sealed inside a Co2 incubator. Vivaview FL incubator microscope with proprietry Metamorpoh imaging software. http://olympuscanada.com/seg_section/product.asp?product=1055&c=0 |
| Clean bench | Thermo Scientific | 51029701 | Multiple brands manufacture similar items http://www.thermoscientific.com/en/product/heraguard-eco-clean-bench.html |
| CO2 incubator | Thermo Scientific | 3310 | Multiple brands manufacture similar items http://www.thermoscientific.com/en/products/co2-incubators.html |
| Laminar Flow hood | Thermo Scientific | 51026651 | Multiple brands manufacture similar items http://www.thermoscientific.com/en/products/biological-safety-cabinets-clean-benches.html |
References
- Wu, D. K., Kelley, M. W. Molecular mechanisms of inner ear development. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 4, (2012).
- Shim, K. The auditory sensory epithelium: the instrument of sound perception. The international journal of biochemistry & cell biology. 38, 1827-1833 (2006).
- Van de Water, T., Ruben, R. J. Growth of the inner ear in organ culture. The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 83, 1-16 (1974).
- Jacques, B. E., et al. A dual function for canonical Wnt/beta-catenin signaling in the developing mammalian cochlea. Development. 139, 4395-4404 (2012).
- Castellano-Munoz, M., Peng, A. W., Salles, F. T., Ricci, A. J. Swept field laser confocal microscopy for enhanced spatial and temporal resolution in live-cell imaging. Microscopy and microanalysis : the official journal of Microscopy. Society of America, Microbeam Analysis Society, Microscopical Society of Canada. 18, 753-760 (2012).
- Szarama, K. B., Gavara, N., Petralia, R. S., Chadwick, R. S., Kelley, M. W. Thyroid hormone increases fibroblast growth factor receptor expression and disrupts cell mechanics in the developing organ of corti. BMC developmental biology. 13, 6 (2013).
- Appler, J. M., et al. Gata3 is a critical regulator of cochlear wiring. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 3679-3691 (2013).
- Wibowo, I., Pinto-Teixeira, F., Satou, C., Higashijima, S., Lopez-Schier, H. Compartmentalized Notch signaling sustains epithelial mirror symmetry. Development. 138, 1143-1152 (2011).
- Hashimoto, S., Kato, N., Saeki, K., Morimoto, Y. Selection of high-potential embryos by culture in poly(dimethylsiloxane) microwells and time-lapse imaging. Fertility and sterility. 97, 332-337 (2012).
- Matsuoka, F., et al. Morphology-based prediction of osteogenic differentiation potential of human mesenchymal stem cells. PloS one. 8, (2013).
- Ma, G. F., et al. et al.Transforming growth factor-beta1 and -beta2 in gastric precancer and cancer and roles in tumor-cell interactions with peripheral blood mononuclear cells in vitro. PloS one. 8, (2013).
- Taranova, O. V., et al. SOX2 is a dose-dependent regulator of retinal neural progenitor competence. Genes & development. 20, 1187-1202 (2006).
- Chen, P., Segil, N. p27(Kip1) links cell proliferation to morphogenesis in the developing organ of Corti. Development. , 1581-1590 (1999).
