À long terme Accéléré imagerie de souris cochléaires explants

Summary

Imagerie en temps réel de la cochlée des mammifères embryonnaire est difficile parce que les processus de développement de la main fonctionnent sur un gradient temporel de plus de dix jours. Nous présentons ici une méthode pour la culture et l'imagerie des tissus embryonnaires des explants cochléaire pris d'une souris rapporteur fluorescent sur cinq jours.

Abstract

Nous présentons ici une méthode à long terme imagerie time-lapse de direct embryonnaires explants cochléaires de la souris. Le programme de développement responsable de la construction de la très ordonnée, la structure complexe de la cochlée des mammifères produit une dizaine de jours. Afin d'étudier les changements dans l'expression des gènes au cours de cette période et leur réponse aux pharmaceutique ou manipulation génétique, l'imagerie à long terme est nécessaire. Auparavant, l'imagerie en temps réel a généralement été limitée par la viabilité des tissus expiantes dans une chambre humidifiée au sommet d'un microscope standard. La difficulté dans le maintien des conditions optimales pour la croissance de la culture en ce qui concerne l'humidité et la température a placé les limites de la longueur d'expériences d'imagerie. Un microscope intégré dans un incubateur de culture tissulaire modifié fournit un excellent environnement pour imagerie longue durée en direct. Dans cette méthode, nous démontrons comment établir explants cochléaires embryonnaires de souris et comment utiliser un microscope incubateur de mener laps de temps Imaging utilisant à la fois champ lumineux et la microscopie à fluorescence pour examiner le comportement d'une journée typique embryonnaire (E) 13 explant cochléaire et Sox2, un marqueur des cellules prosensory de la cochlée, sur 5 jours.

Introduction

La cochlée des mammifères est un organe complexe très ordonnée. Chez la souris, entre l'émergence de l'oreille interne primitif de la vésicule otique le jour E11 et l'achèvement du programme de développement à des stades postnatales, de multiples vagues de signalisation cellulaire et des changements coordonnés dans l'expression génique ont lieu. Exécution de la base au sommet de la cochlée est la détection épithélium sensoriel, ou organe de Corti son. Développement de l'organe de Corti est superbement contrôlé de telle sorte que d'ici la fin du développement, il sera composé d'une seule rangée de cellules ciliées internes, trois rangées de cellules ciliées externes entrecoupées de cinq rangées de cellules de soutien (deux rangées de cellules de pilier, trois des rangées de cellules de Deiters ^1). Déviation de cette précises résultats d'ordre dans la perte d'audition, heighlighting l'importance de studye DELA genèse et la structuration de la epithemlium sensorielle ^2.

Dans la culture in vitro de l'embryon de souris cochLea est un outil essentiel dans l'étude des mécanismes de développement de l'organe de Corti. Cette technique a été créé en 1974 et au cours des 40 dernières années, a été utilisé pour élucider bon nombre des mécanismes par lesquels l'épithélium sensoriel est spécifié et l'organe de Corti établi ^3. La cochlée est un organe complexe avec les processus dynamiques de développement; une manipulation peut prendre aussi longtemps que sept jours pour manifester ^1. Par exemple, lors de l'ajout d'inhibiteurs de GSK 3β à une culture d'explant cochléaire à E13, la période d'incubation optimal pour observer un effet robuste du composé ⁴ est de six jours.

Imagerie en temps réel de la cochlée développement permet l'étude des changements dans la morphologie de l'organe de Corti, les changements dans l'expression des gènes, le suivi de migration, prolifération ou mourants cellules, et il permet d'observer en temps réel les résultats des agents pharmaceutiques et la perturbation de la signalisation voies. Jusqu'à présent, vivre l'imagerie de la cochléea principalement été effectués en utilisant la microscopie confocale à l'image de petites zones de l'organe de Corti sur des périodes courtes ^5-8, mais cette technique a des limites dues à la viabilité explant. Dans l'imagerie des effets de manipulations à long terme sur les processus de développement lent, le milieu de formation d'image est cruciale. Typiquement, un système d'imagerie confocale en direct utilise une boîte en plastique humidifié qui se trouve sur le microscope. La chaleur et l'humidité peuvent échapper à travers les lacunes dans la boîte incubation où il rencontre la table de microscope, à travers les fenêtres d'accès, à travers les ouvertures à charnières et à travers les interstices autour des différentes parties de la microscope- comme la source de lumière ou objectif. Ce ne sont pas optimales pour le maintien en bonne santé explants pendant plus de deux ou trois jours.

Nous définissons «incubateur microscope» comme un microscope inversé scellé à l'intérieur d'une norme incubateur à _CO2, plutôt que d'un incubateur construit autour du microscope. Un ex incubateur de microscopetend la vie de l'expérience, de telle sorte que, plutôt que l'imagerie sur deux ou trois jours, les échantillons peuvent être imagés par un maximum de deux semaines. Un microscope incubateur offre un excellent environnement pour la croissance et la différenciation cellulaire, avec une perturbation minimale de explantation des cultures et des conditions standard contrôlée. Dans les études qui se déroulent sur plusieurs jours, il est courant de recourir à des échantillons d'imagerie sur une base quotidienne en les retirant de l'incubateur et les portant à un microscope à fluorescence inversé. Bien que cette approche peut travailler, de sortir la vaisselle de l'incubateur inflige une tension sur le tissu développement sensible. Les variations de l'acidité du milieu de culture et les fluctuations de température dues à l'enlèvement de l'incubateur peuvent se traduire par le développement et des tissus sous-optimale malsain. L'imagerie de la même région au même plan focal et dans la même orientation à chaque point de temps est extrêmement difficile. En utilisant un système automatisé à l'intérieur d'un incubateur, il est possible de maintenir en bonne santétissu, de recueillir des images à plusieurs points dans le temps et à veiller à ce que la même zone est capturée dans chaque image. Au cours des dernières années, plusieurs incubateurs de tissus au microscope intégrés ont été développés, ceux-ci ont été utiles non seulement dans la pratique clinique ⁹ mais aussi sur les cellules souches et le cancer recherche ^10,11.

Nous présentons ici un protocole d'imagerie en temps réel à long terme de embryonnaires explants cochléaires de la souris. On utilise un système de microscopie automatisée à l'intérieur d'un incubateur à CO ₂ standard qui est capable de capturer des images de plusieurs échantillons à des instants de consigne. Le système se compose d'un microscope inversé posée dans un incubateur. Les échantillons sont placés dans une estrade tournante qui permet l'imagerie d'échantillons multiples à chaque point de temps. Illumination, capture d'images, et la rotation de l'estrade sont contrôlés par un système automatisé exploité par le logiciel Metamorph. En définissant une routine d'imagerie utilisant le logiciel d'exploitation, nous pouvons définir une expérience à fonctionner jusqu'à two semaines avec une intervention humaine minimale. Dans cet exemple, nous utilisons deux champs lumineux et fluorescence d'afficher une croissance à grande échelle et le réarrangement de la cochlée, et plus précisément, la région prosensory. Dans cette expérience, cochlée sera disséqué de souris rapporteurs Sox2 ^EGFP le jour embryonnaire E13. Cultures in vitro sera établi et imagé sur cinq jours.

Protocol

Tissu souris a été récolté à partir de Sox2 ^EGFP -reporter souris ¹² maintenus et euthanasiés conformément aux lignes directrices du Conseil canadien de protection des animaux sur pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire.

1. La culture embryonnaire cochlées

1. Supplément milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) en mélangeant 8,89 ml de DMEM, 1 ml de sérum bovin fœtal (FBS), 100 ul de 100x supplément N2, et 10 pi de 10 mg / ml de la ciprofloxacine. Supplément solution saline équilibrée de Hank (HBSS) en mélangeant 495 ml de HBSS avec 5 ml de HEPES 100%.
2. Préparer des boîtes de culture de fond de verre:
   1. Dans une hotte à flux laminaire, la remise en suspension de 200 ul de substrat sous-sol extrait de membrane dans 5 ml de DMEM. Préparer 35 mm verre de diamètre des boîtes de culture de 10 mm avec fond des puits. Pipette 150 ul substrat / DMEM dans le centre de chaque fond de verre plat. Ces plats peuvent être utilisés après 40 minutes d'incubation, ou peuvent stockée dans un CO ₂ REMARQUE: à fond de verre plats sont utilisés pour les raisons suivantes: veiller à ce que le fond du plat est transparent et adapté pour l'imagerie, pour créer un puits au centre de l'assiette qui permet de régler les explants dans une zone facilement localisé et enfin de sorte que, après une expérience de l'échantillon peut être traité pour une analyse ultérieure et immunocoloration.
3. Préparer le poste de travail et outils:
   1. Tournez sur le banc de nettoyage à écoulement laminaire, et arroser avec EtOH à 70% pour créer un espace de travail propre. Faire tremper pinces, cuillères, et un 184 plat en élastomère de silicone noir (un mélange de 184 élastomère de silicone (10 parties), l'agent (1 partie) et de la poudre de charbon de bois (2,5 g) de durcissement) dans EtOH à 70%.
4. Dans le poste de travail propre, les embryons de récolte pour l'expérience. Recueillir des embryons de la gestation approprié dans la glace HBSS froid additionné de 1% HEPES.
   1. Déterminer un organe externe ou visible qui démontreral'activité du rapporteur et examiner les embryons en utilisant un microscope stéréoscopique fluorescent. Recueillir les embryons qui présentent une activité de journaliste dans la glace HBSS froid additionné de 1% HEPES que ceux-ci font l'objet de l'expérience.
5. Recueillir os temporaux:
   1. En travaillant rapidement, à l'aide d'une source de lumière froide et une pince fine, recueillir les têtes des petits. Prenez soin de couper au niveau des vertèbres cervicales et en dessous de la mâchoire pour éviter d'endommager l'os temporal.
   2. Ouvrez soigneusement le crâne. Retirez le cerveau, coupez le devant de la tête, et de transférer le crâne postérieur à glace fraîche HBSS froid additionné de 1% HEPES dans un plat propre. Disséquer soigneusement les arachides os temporaux en forme en prenant soin de garder le système vestibulaire de tact.
6. Disséquer la cochlée:
   1. Transférer les os temporaux dans un plat recouvert d'élastomère de silicone noir dans la glace HBSS froid additionné de 1% HEPES, la broche de la région vestibulaire de l'os. Insérer les broches d'insectes àun angle oblique afin de stabiliser l'os temporal et créer un espace pour la pince. Épingler est une étape cruciale dans le processus comme si l'os temporal est autorisé à se déplacer trop, il est très difficile de récolter une cochlée intacte.
   2. Retirez délicatement le cartilage entourant la cochlée. Insérer une dent de la pince dans le cartilage sur le bord extérieur de la base de la cochlée et découper un trou dans le cartilage.
   3. Attachez un rabat sur le côté, insérer la dent de la pince et se séparer en douceur le toit de la gaine du cartilage. Couper horizontalement sur le dessus et en diagonale, et soulevez délicatement la partie avant de la capsule. Insérez un volet de la pince entre le cartilage restant et le conduit et le clip doucement la dernière section. La surface apicale de la cochlée est maintenant exposé.
   4. À partir de la base, attraper la zone où le toit de la conduite répond l'épithélium cochléaire et ouvrir le canal cochléaire. Retirez délicatement le toit, le paragelorsque cela est nécessaire jusqu'à ce qu'il soit complètement retiré. Coupez les portions de membrane à gauche sur la face interne de la conduite. Faire ramoner le conduit de tissu mésenchymateux excès et détacher la conduite du système vestibulaire.
7. Culture: les explants
   1. Passer une explantation, surface luminale place, dans le centre d'un verre recouvert boîte de culture bas de substrat, soigneusement prélever tout le liquide et laisser reposer pendant deux minutes. Ajouter 150 ul complétée DMEM goutte à goutte à l'expiant, en prenant soin de ne pas déranger. Si l'expiant flotter librement, repositionner avec une pince, mais veiller à ce que l'explantation se dépose au fond de la boîte de sorte qu'il peut se brancher sur le substrat.
   2. Placez les plats à fond de verre dans un 12 cm de diamètre plat de Pétri de profondeur, avec un petit plat d'eau stérile pour maintenir l'humidité. Mettre les cultures dans un incubateur à 35 ° pendant une nuit pour que l'expiant pour fixer au substrat et l'aplatir.

2. direct ImagING

1. Sélectionnez échantillons explants. Utilisation d'un microscope stéréoscopique fluorescent pour évaluer l'état de chaque cochlée explantée. Sélectionner uniquement explants où le canal est intact et attaché au verre à partir de la base au sommet.
2. Régler l'incubateur à 35 ° C avec 5% de CO ₂ à la culture de tissus cochléaire. Mettez les cultures dans le microscope de l'incubateur:
   1. Aspirer doucement le DMEM supplémenté et remplacer avec au moins 500 pi de milieu frais. Pour l'imagerie jusqu'à 6 jours, de 1-1,5 ml est mieux. Dans les cas où explants sont mal fixés, une pipette un anneau de médias autour du bord du plat. Ce liquide supplémentaire fera une "chambre humide" miniature sans perturber l'expiant alors qu'il continue à attacher à la matrice.
      1. Vous pouvez aussi utiliser articulé plat couvre pour ouvrir les couvercles alors que le plat reste dans sa mise en place dans le microscope si les réactifs doivent être échangés pendant les intervalles entre les collections d'images. Couvercles plat charnières permettent aux couvercles d'êtreouvert sans déranger les échantillons ou de retirer les plats de leurs paramètres. Cela permet de maintenir leur position exacte des captures d'images suivantes.
   2. Insérez les plats en verre fond contenant des échantillons appropriés dans le support de plat de l'échantillon. Le microscope dans cet exemple a une plate-forme rotative qui contient huit plats de 35 mm de l'échantillon.
   3. Sous la hotte à flux laminaire remplacer les couvercles en plastique avec couvercles en verre et insérer les plats dans le support de plat de l'échantillon. Placez le support de plat de l'échantillon à l'intérieur de l'incubateur en prenant soin de ne pas déloger les explants du fond du plat ou de perturber les médias.
3. Mettre en place la routine d'imagerie:
   1. Allumez le microscope, lampe UV et l'appareil, ouvrez le logiciel d'imagerie.
   2. Repérez les échantillons, choisir une zone d'imagerie, plan de mise au point et ajuster les temps d'exposition pour chaque plat en séquence. Choisir le plan de mise au point en fonction non seulement de la vue de l'explant au moment du démarrage, mais alen gardant à l'esprit la façon dont le tissu se déplace et combien de temps le cours du temps sera exécuté.
   3. Définir une pile Z de centrage dans le plan focal sélectionné dans le canal de fluorescence. Réglez la fréquence et la durée de l'échantillonnage pour l'expérience. La fréquence d'échantillonnage est limitée par le temps qu'il faut pour recueillir des images, ce qui devrait être déterminée après la sélection de champs de vision et la fixation d'un empilement de Z. Dans ce cas, le prélèvement est effectué toutes les 30 min pendant cinq jours. La durée de l'expérience peut aller jusqu'à 14 jours.
4. Générer un film:
   1. A la fin de la période de laps de temps d'ouvrir les fichiers d'image. Dans ce cas, le logiciel Metamorph qui ouvre des points de collecte séquentielles est utilisé. Image par image choisir le meilleur plan focal pour montrer la population cellulaire d'intérêt.
   2. Convertir ces images dans un fichier .avi, ou les exporter sous forme d'un montage pour produire un ensemble d'images qui peuvent être ouverts et analysés dans le logiciel de traitement d'image ou convertis en forma multiplets en utilisant un logiciel de traitement vidéo.

Representative Results

Ici, nous montrons un montage (figure 1) et un film (Figure 2) montrant comment un explant cochléaire organotypique typique va croître si plaqué sur E13.5. Un journaliste souris Sox2 a été utilisé pour visualiser la région prosensory. Le film montre que la cochlée est soumis à une croissance et à la convergence et l'extension, les cellules dans la région latérale du domaine de Sox2 vert ne semblent pas se diviser le tissu environnant comme il se dilate. Ceci est une caractéristique de l'organe de Corti; E13 sur l'épithélium sensoriel éventuel sort du cycle cellulaire et est par la suite appelée la zone de non-prolifération ^13. Une deuxième expérience a time-lapse de centrage sur la base d'un milieu différent explant cochléaire (figures 3 et 4) montre que lors de son extension, la région prosensory rétrécit. Notez que, après trois jours de culture, le tissu a considérablement aplati de telle sorte qu'il est possible de visualiser indiviles cellules fluorescentes double, alors qu'au début il ya des régions où la réflexion interne de la lumière due à l'épaisseur du tissu permettent d'identifier les régions d'expression, mais pas des cellules individuelles.

Figure 1:. Temps - images accélérées de Sox2 journaliste tissu cochléaire recueillies pendant cinq jours Ce montage montre la progression de la croissance des explants à partir du jour zéro et se terminant le cinquième jour, échantillonnage toutes les 30 minutes en utilisant un objectif 10X. L'explant a été établi sur E13 et cultivées pendant la nuit avant l'imagerie. Comme l'expiant mûrit à la fois se développe et subit des mouvements d'extension convergentes. (A) des images séquentielles montrant l'ampleur de la croissance cochléaire à intervalles de 12 h. Canal de la lumière visible recouverte avec le gène de fluorescence de la GFPclassé par le rapporteur de l'EGFP Sox2. canal de fluorescence (B) de la GFP seule. La barre d'échelle correspond à 200 um. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2 :. animation Time-lapse de Sox2 journaliste tissu cochléaire recueillis sur 5 jours Ceci est la même expérience de l'explantation indiqué à la figure 1, cette fois les cadres sont sélectionnés à intervalles de 30 minutes pendant 5 jours et combinées en un fichier .avi pour générer une film.

Figure 3:. De base à mi subissant des mouvements de la CE et l'aplatissement sequential images qui montrent que l'épithélium prosensory milieu de la base (EGFP) se rétrécit, et se prolonge aplatit au cours des 5 jours. Les flèches indiquent la région qui se rétrécit. Cadres sélectionnés à partir d'une séquence laps de temps de 5 jours à intervalles de 12 h à l'aide d'un objectif 10x. La barre d'échelle correspond à 200 um. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4 : animation Time-lapse de la base milieu subissant des mouvements de la CE et l'aplatissement d'animation séquence time-lapse convergence et l'extension de l'épithélium sensoriel de la figure 3 avec les images sélectionnées à intervalles de 30 minutes montrant..

Discussion

Il ya plusieurs points techniques à prendre en compte lorsque les cultures sont établies et à mettre en place le microscope time-lapse pour que l'imagerie à long terme.

Nous utilisons sous-sol matrice de la membrane comme substrat pour la culture des explants cochléaires, mais le substrat doit être adapté au type de cellule. Par exemple, à l'image des cultures de neurones, il peut être préférable de fournir un revêtement de fibronectine. La température d'incubation et la composition du gaz doivent également être choisis en fonction du type de tissu. Le choix de l'âge de l'explant est important. Nous commençons à E13, au plus tôt, car le E12 la direction de croissance est moins prévisible. Comme il est essentiel que les explants sont mis en culture pendant une nuit à attacher au substrat, les expériences devraient être prévus pour commencer le jour suivant. Si une expérience est de commencer à E15 ou plus, les cultures devraient être établis sur E13 comme au fil du temps le tissu aplatit et se propage si les cellules sont plus faciles à l'image (voir Figure 3). Si l'organe de Corti est à imager, il est essentiel que la cochlée est disséqué très soigneusement. Entailles dans le bord latéral de l'explant se cassent la tension interne du tissu, par conséquent, lorsque la cochlée est soumis à des réarrangements morphologiques, les cellules de la fuite "à travers le déchirement formant un« V »protrusion.This saillie en forme peut se déplacer la région d'intérêt hors de la vue . En outre, il faut prendre soin d'éliminer autant du toit du conduit sur le côté médial du possible. Ce tissu continue à proliférer comme l'explant se dilate et peut croître au-dessus de la région d'intérêt obscurcir la vue.

Lors du réglage de la routine d'imagerie, la croissance et les changements dans la morphologie de la cochlée doivent être soigneusement examinées. L'objectif devrait être choisi en fonction non seulement de la taille de la région à imager, mais aussi en prenant en considération le fait que cette région se déplace ou se développer. Les cellules dans la région médianede la cochlée (Figure 1 et 2) diviser et se déplacer dans un espace confiné, donc un fort grossissement peut être utilisé (20X, 40X, 60X). Les cellules dans l'organe de Corti ou l'épithélium latérale, cependant, se déplacent comme l'explant se développe; un faible grossissement (10X ou 20X) est mieux, car les chances que les cellules restent dans le champ de vision est plus élevé. Imagerie des régions fixes de la cochlée est possible à fort grossissement. Nous avons choisi d'utiliser un objectif 10X dans la section des résultats représentatifs parce que nous avons voulu montrer toute explantation, et parce que le mouvement des tissus est dynamique à des stades précoces.

Suivant à considérer est le plan de mise au point. Étant donné que l'explant va croître vers l'extérieur et l'aplatir, il est probable que le plan focal va changer radicalement au cours du temps. Si la région d'intérêt est l'organe de Corti ou épithélium latérale, anticiper cela et se concentrer sur les cellules migrent hors de l'expiant peut vous aider. Ceci est alsi un argument pour l'utilisation des objectifs à faible grossissement. Il est possible de mettre des piles Z pour les deux fluorescence et DIC. Si les cellules d'intérêt sont susceptibles de se déplacer hors de mise au point, la mise en place d'une pile en Z de 3-5 um pour contrer cette étape peuvent, en particulier si la dernière étape est dans le plan de la lamelle couvre-objet. Il peut être difficile de choisir le bon plan lors de la visualisation cultures dès le premier jour, que la densité de tassement des cellules et la lumière réfléchie par le tissu environnant peut empêcher une vision claire. Lors de l'examen des cadres de générer un film ou un montage plus tard, une sélection rigoureuse de Z-plans permet également le suivi des mouvements cellulaires en trois dimensions. L'expérience peut être interrompue à tout moment pour ajuster les réglages de mise au point si l'échantillon se déplace hors de portée.

Imagerie en temps réel d'un explant cochléaire plus d'une semaine ajoute une nouvelle dimension à la compréhension du développement de la cochlée qui viendra compléter l'imagerie confocale en direct. Ceci est une excellente méthode à utiliser pour orgue longue et largeExamen -terme est nécessaire, mais ne remplacera pas fort grossissement imagerie confocale pour l'étude de cellules unique à court terme. Choix de la technique dépend du type de tissu à imager et le cadre de l'expérience. Cette technique permettra aux chercheurs d'étudier les changements spatio-temporels de l'expression du gène rapporteur, la prolifération cellulaire et la migration en temps réel et permettent à l'étude de la réponse d'un gène rapporteur à des agents pharmaceutiques et de la viabilité des cellules de manière plus détaillée que précédemment possible.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle media	Gibco	12430	Multiple brands manufacture this
Basement membrane extract	Corning	354230	Matrigel. Alternative similar products are available from other suppliers. http://catalog2.corning.com/Lifesciences/en-US/Shopping/Product.aspx?categoryname=Cell+Culture+and+Bioprocess%28Lifesciences%29|Extracellular+Matrix+Proteins+ECMs+and+Attachment+Factors%28Lifesciences%29|Matrigel+Basement+Membrane+Matrix+%28Lifesciences%29
Fetal bovine serum	Gibco	16000044	Multiple brands manufacture this http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=fbs&resultPage=1&results PerPage=15&autocomplete=
HEPES	Gibco	5630080	Multiple brands manufacture this http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=hepes&resultPage=1&results PerPage=15&autocomplete=
100 x N2 supplement	Gibco	17502-048	Multiple brands manufacture this http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=n2&resultPage=1&results PerPage=15&autocomplete=
Ciprofloxacin	Sigma Aldrich	17850-5G-F	Multiple brands manufacture this http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/17850?lang=en&region=CA
Hank's balanced salt solution	Gibco	14170161	Multiple brands manufacture this. Should be refidgerated before use. http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/cell-culture/mammalian-cell-culture/reagents/balanced-salt-solutions/hbss-hanks-balanced-salt-solution.html?s_kwcid=AL!3652!3!26107410508!e!!g!!hbss&ef_id=xoFOglw2s UMAAMU8:20140228185720:s
Fine Forceps	Fine Science tools	11254-20	Size number 5 http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=350&CategoryId=29
Curette	Fine Science Tools	10080-05	size 1 mm  http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=91&CategoryId=118
Insect Pins	Fine Science Tools	26001-35	Must be stainless Steel http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=124
50 mm plastic dishes	Corning/Falcon	351006	Multiple brands manufacture this
charcoal	Sigma Aldrich	05105-250G	Multiple brands manufacture similar items http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/05105?lang=en&region=CA
184 silicone elastomer	Dow/Corning	SYLGARD® 184 SILICONE ELASTOMER KIT	Dishes are home made several weeks in advance.  Silicone elastomer can be from any supplier.http://www.dowcorning.com/applications/search/products/Details.aspx?prod=01064291
Glass bottom dishes	MatTek	P35G-0-10-C	The dimensions of the dish are determined by the specifications of the imaging system.  35 mm diameter, 10mm well, number 0 coverslip fits Olympus Vivaview FL. http://glass-bottom-dishes.com/catalog/index.php?main_page=product_info&cPath= 1_4_15&products_id=2
Stereomicroscope	Zeiss	495101-9804-000	Stemi 2000 model. multiple brands manufacture similar items http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/stereo-zoom-microscopes/stemi-2000.html
Cold Light Source	Zeiss	000000-1063-182	Multiple brands manufacture similar items http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/microscope-components/lightsources.html
Fluorescent Stereomicroscope	Leica microsystems	Contact Leica microsystems	Leica M165-FC. Multiple brands manufacture similar items http://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/fluorescence/details/product/leica-m165-fc/
Incubator Microscope +imaging software	Olympus	Contact Olympus	Inverted microcope sealed inside a Co2 incubator. Vivaview FL incubator microscope with proprietry Metamorpoh imaging software. http://olympuscanada.com/seg_section/product.asp?product=1055&c=0
Clean bench	Thermo Scientific	51029701	Multiple brands manufacture similar items http://www.thermoscientific.com/en/product/heraguard-eco-clean-bench.html
CO2 incubator	Thermo Scientific	3310	Multiple brands manufacture similar items http://www.thermoscientific.com/en/products/co2-incubators.html
Laminar Flow hood	Thermo Scientific	51026651	Multiple brands manufacture similar items http://www.thermoscientific.com/en/products/biological-safety-cabinets-clean-benches.html