Abstract
Majoriteten av alle kjente sykdommer er ledsaget av forstyrrelser i det kardiovaskulære systemet. Studier av kompleksiteten i samspill trasé aktiveres under kardiovaskulære sykdommer er imidlertid begrenset av mangel på robuste og fysiologisk relevante metoder. For å modellere patologiske vaskulære hendelser har vi utviklet en in vitro-analyse for å studere interaksjonen mellom endotel og helblod. Analysen består av primære humane endotelceller, som er plassert i kontakt med humant helblod. Metoden utnytter naturlig blod med ingen eller svært liten antikoagulant, slik studie av ømfintlige interaksjoner mellom molekylære og cellulære komponenter som er tilstede i et blodkar.
Vi undersøkte funksjonaliteten til analysen ved å sammenligne aktivering av koagulasjon med forskjellige blodvolumer inkubert med eller uten human navlestrengvene endotelialceller (HUVEC). Mens en større blodvolum bidro tilen økning i dannelsen av trombin antitrombin (TAT) -komplekser, tilstedeværelse av HUVEC resulterte i redusert aktivering av koagulasjon. Videre påføres vi bildeanalyse av leukocytter festing til HUVEC stimulert med tumornekrosefaktor (TNFa) og funnet tilstedeværelsen av CD16 + -celler til å være betydelig høyere på TNFa-stimulerte celler sammenlignet med ustimulerte celler etter blod kontakt. Som konklusjon, kan analysen bli anvendt for å studere vaskulære patologier, hvor vekselvirkninger mellom endotel og blodrommet er opprørt.
Introduction
Metoder for å analysere blod-vaskulære interaksjoner i hjerte-og karsykdommer generelt involverer dyr forskningseksperimenter. Resultater som er opprettet i eksperimentelle undersøkelser dyremodeller kan imidlertid ha liten eller ingen innvirkning på human sykdom. 1,2 Som sådan, er det behov for godt og pålitelig in vitro-modeller for å undersøke cellulære interaksjoner mellom blodkammeret og vaskulære endotelceller i en human-lignende system. Vi har derfor etablert en blod endotelceller kammer modell. Dette er basert på en tidligere beskrevet modell som brukes for å undersøke interaksjonen mellom biomaterialer og humant helblod. 3. I motsetning til andre in vitro-oppsett der vanligvis begrenset antall av rensede komponenter, dvs., trombocytter, leukocytter eller endotelceller er tilgjengelige, inkorporerer den foreliggende modellen alle de komponenter som er tilstede i et blodkar.
Oppsettet av blodet endothelial cell kammermodellen er utformet for å muliggjøre bruk av ferskt humant blod trukket med lite eller intet tilsatt antikoagulant. Blood lagret under lengre tidsperioder tilegne såkalte lagrings lesjoner der nedbryting av erytrocytter kan forstyrre delikat samspill mellom blod og endotelceller. 4
For å unngå klumpdannelse under håndtering av helt blod ex vivo krever enten høye doser av antikoagulerende middel, eller at alt materiale i kontakt med blod må være ikke-aktiverende. Som ikke-aktiverende flater er sjeldne i laboratoriemiljø, kan materialer alternativt være utstyrt med et beskyttende lag av immobilisert heparin. Et beskyttende lag av immobilisert heparin (heretter referert til som Corline heparin flate (CHS)) som kan anvendes på de fleste materialer skaper en overflate hvor blod kontakt kan forekomme uten å forårsake en aktivering av koagulasjonskaskaden. 5 Således, innredning av kamrene med CHS, blodet endothelial cell kammermodell muliggjør bruk av meget lave konsentrasjoner av antikoagulant i blodet. Å unngå tilsetning av høye konsentrasjoner av antikoagulant i blodet endotelial kammeret modellen gjør det mulig å studere interaksjoner følsomme innenfor et blodkar som ellers kunne maskeres. 6
Blodet endotelial cellekammer modellen består av to kammere som dannes ved å feste plastsylindre (høyde: 8 mm, radius: 9 mm) til en plast-objektglass. Kantene som vender oppover på sylindrene er utstyrt med spor som er utstyrt med O-ringer som benyttes for forsegling av de mot kamrene cellekulturen lysbilde. Kamrene er bare delvis fylt med blod som luften som er igjen i kammeret holder blod i bevegelse når kamrene blir deretter rotert i en vertikal stilling (figur 1).
For å vurdere funksjonaliteten av modellen, vi utført eksperimenter med enten en helt CHS belagtkammer eller Menneskelig navleveneendotel Cells (HUVEC). To separate blodvolum ble analysert og dannelsen av trombin antitrombin (TAT) komplekser (en indirekte markør for koagulering) ble målt med enzymbundet immunosorbent assay (ELISA). Vi så vurdert effekten av blodvolum og tumornekrosefaktor (TNF-alfa) stimulerte endotelceller på leukocytt rekruttering av bildeanalyse.
Figur 1. Oppsett av blodet endotelceller kammer modell. (A) ovenfra skjematisk tegning av blodkammeret laget i PMMA. (B) Primære humane endoteliale celler dyrkes på 1-brønners kammerobjektglass. Friskt humant helblod ble tilsatt til to kammere på et objektglass. Kamrene og alle stoffer som benyttes for håndtering av blodet er behandlet med et beskyttende belegg HS. Etter fjerning veggene av cell kultur slide, blir cellene plassert vender mot blodet, og systemet er klemt stengt. (C) Det blod endotelial cellekamre inkuberes deretter i henhold til dreining i 37 ° C. Etterpå kan reaksjonene i blodrommet bli analysert ved hjelp av ELISA og endotelcellene kan bli analysert ved hjelp av mikroskopi.
Protocol
MERK: Blood ble trukket fra friske individer ved åpent system venepunksjon i godkjenning med Ethical Review Board i Uppsala (Permit nr 2008/264).
1. Seeding Cells
- Kultur primære humane umbilikalvene endotelceller (HUVEC) ved 37 ° C i 5% CO2 i T75-kolber belagt med 1% gelatin i PBS pH 7,4.
- Fjern kulturmedium fra en T75-kolbe inneholdende HUVEC (eller annen type av primære humane endotelceller), og vaske cellene med 2,1 mM EDTA i PBS pH 7,4. Løsne cellene ved tilsetning av 1 ml 0,25% trypsin-EDTA og inkubering i 2 - 3 minutter i 37 ° C.
- Samle celler ved å skylle kolben med 9 ml 10% FBS i PBS pH 7,4 og overføre cellesuspensjonen i et 15 ml rør. Spinne ned cellene ved 735 x g i 5 min.
- Fjern supernatanten og resuspender pelleten forsiktig i cellen endotelial cellevekstmedium mikrovaskulær (EC GMMV) og tell cellene i et Burker kammer. Seed 21.000 calen / cm 2 i 1-brønners cellekultur lysbilder og inkuber ved 37 ° C. Den HUVEC vil bli sammenflytende etter 1 - 2 dager med kultur. Overvåke cellemorfologi og konfluens daglig under et lysmikroskop.
2. Utarbeidelse av Whole Blood
- Forbered alle kunstige overflater som kommer i kontakt med blod med et dobbelt lag med immobilisert heparin (CHS) i henhold til produsentens instruksjoner. CHS belagt materiale beskyttet mot støv kan oppbevares i romtemperatur inntil 6 måneder uten tap av funksjon.
- Bruk åpent system venepunksjon for å trekke blod fra en frisk donor kort tid (<30 min) før blodet endotelial kammeret eksperiment. Par en kanyle (18 G x 50 mm) for å CHS silikonbelagt rør (indre diameter: 2 mm) før nøye å samle blod i en belagt CHS 50 ml rør. Supplement blod med ufraksjonert heparin for å nå en sluttkonsentrasjon på 0,75 IU / ml. Bland blodet forsiktig ved inverting røret 2 - 3 ganger.
3. Blood Endothelial Chamber Model
- Dikte blod kamre (Figur 1A, ovenfra) i akryl polymetylmetakrylat (PMMA) som består av to sylindere (høyde 8 mm og radius 9 mm) som er limt til en PMMA lysbilde (25 x 75 mm). Passer til kantene av sylinderne vendt oppover med gummi O-ringer for å tette blodkammeret mot de glassplater med dyrkede endoteliale celler (Figur 1b). Rotere blodkamrene er koblet til kulturglass med endotelceller deretter i en vertikal stilling (figur 1C).
- Bruk en CHS belagt pipette til å overføre 1,5 ml blod inn i hver CHS belagt kammer tar seg ikke å aktivere blodet.
- Overføring 1 ml blod inn i mikrosentrifugerør inneholdende 30 ul 0,34 MK 3-EDTA for å nå en sluttkonsentrasjon på 3 10 mM K-EDTA for bestemmelse av innledende plasmaproteinkonsentrasjoner ved hjelpen enzymbundet immunosorbent assay (ELISA). Omhyggelig blande blodet og holde rørene på is.
- Fjern plast veggene i cellekultur glass i henhold til produsentens instruksjoner og nøye vaske cellene i PBS pH 7,4. Sørg for å fjerne senere så mye væske som mulig fra lysbildene. Ikke la cellene tørke ut.
- Plasser lysbildet på toppen av blodkamrene, med celler som vender mot blod. Feste den ved å plassere en klemme rundt blod endotelceller kammeret. Bruk en plastsklie for ekstra støtte for å unngå brudd i cellekultur glass lysbilde når du plasserer klemmen.
- Rett blod endotelial cellekammeret på et roterende hjul (40 cm i diameter) sted i et 37 ° C vannbad. Rotere hvert kammer på hjulet ved 0,5 x g i 30 min.
- Etter inkubasjon demontere blod endotelial cellekammeret. Vask cellekultur lysbilder i PBS pH 7,4 og fikse cellene i iskald 1% paraformaldehyde (PFA) feller 10 min. Overføring 1 ml blod fra hvert kammer til mikrosentrifugerør inneholdende 30 ul 0,34 MK 3-EDTA for å nå en sluttkonsentrasjon på 3 10 mM K-EDTA og bland forsiktig rørene. Hold rørene på is.
- Sentrifugere rørene ved 4560 x g i 10 minutter i 4 ° C. Overfør blodplasma til nye mikrosentrifugerør og butikk i -70 ° C inntil videre analyse.
4. Analyse av Blood Endothelial Interaksjoner
- Utfør immunofluorescerende farging med muse-anti-human CD16, etterfulgt av sekundær geit anti-mus Alexa 488 og phalloidin-TexasRed. Utfør hver fargingstrinnet i 1 time ved romtemperatur og vaske objektglassene i PBS pH 7,4 mellom hvert trinn. Counterstain kjernene med DAPI i 10 minutter ved romtemperatur. Analysere blodkomponenter bundet til endotelceller ved fluorescens mikroskopi i kombinasjon med bildeanalyse ved hjelp av egnet programvare for bildeanalyse som CellProfiler.
- Quantify reaksjonene i blodet rommet med trombin-antitrombin (TAT) ELISA som per produsentens instruksjoner av plasmaprøvene.
- Bruk egnede statistiske verktøy, f.eks., En uparet t-test, for å analysere dataene.
Representative Results
Nødvendigheten av CHS Coating
For å måle reaksjoner i fullblod som er spesifikke for de som er fremkalt ved de endoteliale cellene, må alle materialer som brukes for blodet endotelial cellekammer være utstyrt med et belegg CHS før bruk. Figur 2A (til venstre) viser en ubelagt kammer etter 30 min blod kontakt med en godt synlig blodpropp stede. Behandling av kammeret med CHS (figur 2A, til høyre) på den annen side beskytter blod fra ukontrollert aktivering, slik at resultatene er på grunn av de endoteliale celle-interaksjoner blod.
Effekten av blodvolum i Chamber
Aktivering av koagulasjon er mer sannsynlig i stillestående blod som sannsynligheten for vekselvirkning mellom aktiverte koagulasjonsfaktorer økes. I blodet endotelial cellekammeret modellen, blir blodet holdes i bevegelse på grunn av sirkulasjonen av en luftboble inne i kammeret. I order å bestemme effekten av endringer i blodvolum, og dermed også luftboble størrelse, ble en CHS belagt kammer koblet til en CHS belagt glass lysbilde som ble testet med 1,5 ml eller 1,75 ml fullblod for 30 min. Volumet av blod uten enhver bevegelse av luftboblen er 2,5 ganger større når 1,75 ml blod ble tilsatt til kammeret i forhold til når 1,5 ml av blodet blir benyttet (Figur 2B). De målte TAT-verdier foreslått økt TAT-formasjonen med økt blodvolum (figur 2D). Når HUVEC (figur 2C) ble inkubert med enten 1,5 eller 1,75 ml av helt blod ble det bemerket noen forskjell mellom de to gruppene, noe som tyder på at endotelcellene kan modulere aktivering av koagulasjon (figur 2D).
Effekten av TNFa på Blood Cell rekruttering og aktivering av koagulasjon
For å studere effekten av TNFa på leukocytt-rekruttering, HUVEC var behandlered med 20 ng / ml TNFa 4 timer før blod kontakt. Blod kontakt - med enten 1,5 ml eller 1,75 ml blod - ble fortsatt i 30 minutter hvoretter kulturglass ble farget for CD16 (figur 2F), avbildes og antallet CD16 + celler ble kvantifisert. Rekrutteringen av CD16 + celler økte signifikant med TNFa-behandling (figur 2E) 100-256 CD16 + celler / mm 2 (p <0,0001) med 1,5 ml blod og 172-378 (P <0,0001) med 1,75 ml blod. Dannelsen av TAT-kompleksene ble målt i de tilsvarende plasmaprøver av blod inkubert med enten TNFa behandlede eller ubehandlede celler (figur 2G). TNFa-stimulerte celler indusert en omtrentlig fordobling av TAT-kompleksene sammenlignet med ubehandlede celler.
Figure 2: Funksjonen til blod endotelceller kammer modell. (A) kamre med eller uten CHS ble inkubert med helt blod. Uten CHS, ble en blodpropp dannet etter 30 min. Måling av trombin-antitrombin (TAT) komplekser, en indirekte markør for koagulering, i blod inkubert uten CHS var> 6000 ug / ml. (B) Den mengde blod ikke holdes i bevegelse av den roterende luftboble vil variere med forskjellige blodvolum. Med tilsetning av 1,5 ml blod, vil dette volum være 0,3 ml, mens den vil øke til 0,74 ml med tilsetning av 1,75 ml. (C) HUVEC avbildes med fasekontrastmikroskopi viser typiske endotelcelle morfologien til et konfluent monolag før blod kontakt. (D) TAT verdier for helt CHS belagte kamre viser en liten forskjell når ulike blodvolum er lagt til. Tilsetning av 1,5 ml blod 35 resulterte i ± 11 ug / ml (n = 7) i forhold til 1,75 ml, noe som resulterte i 8577; 70 ug / ml TAT (n = 8). Denne forskjellen er ikke lenger er til stede når HUVEC ble inkubert med de samme blodvolum; 66 ± 55 pg / ml i 1,5 ml (n = 5) og 66 ± 29 pg / ml til 1,75 ml (n = 7). (E) Kvantifisering av antall CD16 + celler er tilstede på enten ustimulert eller stimulert TNFa HUVECs etter blod kontakt. Antallet CD16 + celler er betydelig økt med TNFa-stimulerte celler inkubert med enten 1,5 ml (basale: 100 ± 40 celler / mm; TNFa: 256 ± 121 celler / mm) eller 1,75 ml (basale: 172 ± 67 celler / mm; TNFa: 378 ± 185 celler / mm) av helblod (F) Representative bilder av ustimulerte og TNFa-stimulerte HUVEC farget for phalloidin (rød), CD16 (grønn) og DAPI (blå).. Skala bar = 250 nm (G) Dannelsen av TAT-komplekser blir omtrent doblet ved TNFa-stimulerte celler sammenlignet med ubehandlede celler inkubert med blod (1,5 ml:. 2.1 ± 0,1 ganger mer TAT, n = 3; 1,75 ml: 1,7 ± 1,0 ganger mer TAT, n = 4). Alle verdier er presentert som gjennomsnitt ± standardavvik; p-verdiene ble beregnet ved uparede t-tester. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Flere interaksjoner mellom blodet og beholderveggen er normalt holdes i en hviletilstand på grunn av ikke-klebende og anti-trombotisk natur av endotel. 7 Under patologiske tilstander som involverer inflammasjon, blir den aktivert endotel med en resulterende økning i adhesjon reseptor ekspresjon og 8 en redusert evne til å inhibere hemostase. 9 Aktivering av kaskadesystemene i blodet i sin tur forsterker trombogenisiteten av endotelet forårsaker ytterligere trombose og leukocytt-rekruttering. 10 For å få en bedre forståelse av denne delikate interaksjoner mellom endotelceller og fullblod, har vi utviklet en ny metode for in vitro hvor dyrkede endotelceller blir plassert i kontakt med helt blod. Så vidt vi vet, er vårt oppsett den første til å vise endotelceller inkubert med hele menneskeblod med ingen eller svært lite antikoagulant for lengre tidsperioder.
nt "> Følsomheten av dette systemet blir aktivert ved å åpent system venepunksjon i kombinasjon med et beskyttende lag av immobilisert heparin på alle overflater som er plassert i kontakt med blod. Bruken av et åpent system under blod anskaffelse reduserer aktivering av kaskadesystemene under venepunksjon mens tillater bruken av en selvbestemt mengde antikoagulant. Kommersielt tilgjengelige evakuert blodprøverør kan imidlertid anvendes, avhengig av den tiltenkte sluttpunktene av studien. Den endelige konsentrasjonen av antikoagulant tilsatt til de fleste kommersielt tilgjengelige lukket system rør kan hemme følsomme og ellers er vanskelig å studere, interaksjoner i oppsettet. 6 En beskyttende heparin overflate eliminerer ytterligere aktivering av blod gjennom overflatekontakt på andre måter enn de endotelceller overflater. 5 Faktisk inkubasjon av fullblod supplert med en liten mengde av ufraksjonert heparin kammeret uten beskyttelse av CHS resulterte i klumpdannelse.Videre var det en to-fold økning i rekruttering av blodceller mot TNFa aktivert HUVEC i kombinasjon med en doblet dannelsen av TAT uavhengig av blodvolum. Dette bekrefter stabiliteten av modellsystemet, og viser også muligheten for å bruke et aktivert endotel i kombinasjon med helt blod. Fremtid på, kan blod endotelial cellekammer brukes til å undersøke blodcellerekruttering mot aktiverte endotelceller ved en rekke forskjellige markører som blir uttrykt på celler under forskjellige betingelser og stadier av aktiveringen. Videre kan modellen brukes i kombinasjon med farmakologiske midler for å vurdere effektene på inflammatoriske tilstander.
Oppsummert viser vi den store fordelen av å kombinere et kammermodell med humane blod og vaskulære celler for å skape et helt menneske in vitro system for å utføre relevante undersøkelser av vaskulær sykdom.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet med tilskudd fra Vetenskapsrådet (90293501, A0290401, A0290402), EU syvende rammeprogram henhold tilskuddsavtalen n ° 602699 (DIREKT), den NovoNordisk Foundation, Gurli og Edward Brunnberg Foundation, Stem Therapy, Vleugel Foundation og Åke Wiberg Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human Umbilican Vein Endothelial Cells (HUVEC) | PromoCell | C-12200 | Any other type of primary human endothelial cell may be used. |
| Endothelial Cell Growth Medium MV (ECGM MV) | PromoCell | C-22120 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G-2500 | Prepare 1% gelatin in PBS, incubate 5 ml in a T75 for 15 min and remove before culturing cells. |
| TAT ELISA | Enzyme Research Lab. | TAT-EIA-C | |
| Mouse anti-human CD16 | DAKO | F7011 | Dilution 1:100 |
| Goat anti-mouse Alexa 488 | Molecular Probes | A11001 | Dilution 1:500 |
| Phalloidin-Texas Red | Molecular Probes | A22287 | Dilution 1:200 |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | Dilution 10 μg/ml |
| EDTA | Sigma | E-6758 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco Life Tecnologies | 25200-056 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco Life Technologies | 10437 | |
| 1 well cell culture slides | BD Falcon | 354101 | |
| Blood Chambers | NA | NA | Blood Chamber may be manufactured in PMMA or any other plastic able to bind CHS |
| Clamps | Office Depot | 2052204 | |
| Corline Heparin Surface (CHS) | Corline Systems AB | 945-00 | |
| Hypodermic needle | Terumo | NN-1850R | Size: 18 G x 5 mm |
| Unfractionated Heparin (UFH) | Leo Pharma | 585679 | |
| K3EDTA | Alfa Aesar | 1709958 | Prepare a 0.34 M stock solution in milliQ H2O |
| PFA | Sigma-Aldrich | P-6148 | |
| Fluorescence microscope | Nikon | 80i | |
| Light microscope | Nikon | TS100 | |
| Image analysis software | Broad Institute | CellProfiler | Available for free at www.cellprofiler.org |
References
- Mestas, J., Hughes, C. C. W. Of Mice and Not Men: Differences between Mouse and Human Immunology. J Immunol. 172 (2), 2731-2738 (2004).
- Seok, J., et al. Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (9), 3507-3512 (2013).
- Hong, J., Ekdahl, K. N., Reynolds, H., Larsson, R., Nilsson, B. A new in vitro model to study interaction between whole blood and biomaterials. Studies of platelet and coagulation activation acid the effect of aspirin. Biomaterials. 20 (7), 603-611 (1999).
- Doctor, A., Spinella, P. Effect of Processing and Storage on Red Blood Cell Function In. Vivo. Semin Perinatol. 36 (4), 248-259 (2012).
- Andersson, J., et al. Optimal heparin surface concentration and antithrombin binding capacity as evaluated with human non-anticoagulated blood in vitro. J Biomed Mater Res A. 67 (2), 458-466 (2003).
- Ekdahl, K. N., Hong, J., Hamad, O. A., Larsson, R., Nilsson, B. Evaluation of the blood compatibility of materials, cells, and tissues: basic concepts, test models, and practical guidelines. Adv Exp Med Biol. 735, 257-270 (2013).
- Aird, W. C. Spatial and temporal dynamics of the endothelium. J Thromb Haemost. 3 (7), 1392-1406 (2005).
- Cines, D. B., et al. Endothelial cells in physiology and in the pathophysiology of vascular disorders. Blood. 91 (10), 3527-3561 (1998).
- Kirchhofer, D., Tschopp, T. B., Hadvary, P., Baumgartner, H. R. Endothelial cells stimulated with tumor necrosis factor-alpha express varying amounts of tissue factor resulting in inhomogenous fibrin deposition in a native blood flow system. Effects of thrombin inhibitors. J Clin Invest. (5), 2073-2083 (1994).
- Esmon, C. T. Molecular circuits in thrombosis and inflammation. Thromb Haemost. 109 (3), 416-420 (2013).
- Rosenberg, R. D., Aird, W. C. Vascular-Bed–Specific Hemostasis and Hypercoagulable States. N Engl J Med. 340 (20), 1555-1564 (1999).
