Protocol
1 Préparation de milieux de culture, cytokines et plaques GELATINISE
- Préparer support de cellules ES en utilisant la modification de Dulbecco du milieu de Eagle (DMEM) avec l'hyperglycémie et du pyruvate de sodium. Ajouter 20% ESC Qualifié de sérum bovin fœtal (FBS), 1% pénicilline / streptomycine, 1% de L-glutamine, 1% tampon HEPES, acides aminés 1% non essentiels, 0,1% de gentamicine (50 mg / ml) et 0,1% ( 55 pM) β-mercaptoéthanol. Stériliser les médias de cellules ES par filtration.
- Préparation de supports en faisant OP9 1 L de milieu essentiel minimum alpha (α-MEM) de poudre selon les instructions du fabricant. Ajouter 20% de sérum bovin fœtal (FBS) et 1% de pénicilline / streptomycine. Mélanger par inversion. Stériliser par filtration en deux aliquotes de 500 ml.
NOTE: L'utilisation des médias à base de poudre est recommandé et susceptible de donner un meilleur entretien des cellules OP9 et dans les résultats de la différenciation in vitro. Cette approche est devenue notre procédure standard. Cependant, nous notons aussi that nous avons parfois utilisé liquides pré-faites α-MEM avec succès suffisant. - Préparation des milieux de congélation en ajoutant 10% de diméthylsulfoxyde (DMSO) à 90% de FBS. Agiter doucement et stériliser par filtration. Conserver à 4 ° C.
- Préparer 2,000x ligand Flt-3 (10 ng / ml) en dissolvant recombinant ligand Flt-3 humain (Flt-3L) dans des milieux de OP9 complète à 10 pg / ml. Aliquote de 1,5 ml dans des microtubes et conserver à -80 ° C. Suivez les recommandations du fournisseur en ce qui concerne la stabilité et le stockage.
REMARQUE: La stabilité de Flt-3L est court (1 mois à 4 ° C ou 3 mois à -80 ° C). - Préparer 1,000x IL-7 (1 ug / ml) en utilisant le support de OP9 complète. Aliquote de 1,5 ml dans des microtubes et conserver à -80 ° C. Suivre les recommandations du fournisseur sur la stabilité et le stockage (IL-7 est stable jusqu'à 12 mois à -80 ° C).
- Préparer facteur inhibiteur 1,000x leucémie (LIF) (10 pg / ml) par une dilution 1:10 de 10 7 unités de LIF in médias de cellules ES. aliquote de magasin à 4 ° C. N'oubliez pas de noter la date d'expiration prévue par le fabricant sur les flacons de parts.
NOTE: Ce produit est stable dans la forme concentrée ou diluée au moins 18 mois à compter de la date de fabrication. - Préparer des plaques de 6 puits par gélatinisé ajouter 1,5 ml de solution à 0,1% de gélatine dans chaque puits d'une plaque à 6 puits. Laisser la vaisselle dans la hotte stérile à température ambiante avec des couvercles sur les, ce qui permet au moins 30 min pour le revêtement. Les plats peuvent également être laissés dans un incubateur humidifié nuit. Éliminer toute solution de gélatine restes juste avant l'ensemencement des cellules. Ne laissez pas la solution de gélatine sécher complètement dans le puits.
2 Préparation et maintenance de cellules nourricières et de la souris de cellules souches embryonnaires (MESC)
Remarque: toutes les cellules à incuber dans un humidifié à 37 ° C incubateur avec 5% de CO 2.
- Décongélation fibroblastes embryonnaires de souris (MEF)
- Rapide décongeler un flacon congelé (~ 5 x 10 6
- Ajouter 8 ml de milieu de cellules ES à des cellules décongelées, dans un mode de goutte à goutte à diluer progressivement le DMSO du milieu de congélation.
- Centrifuger les cellules à 400 x g à 4 ° C pendant 5 min. Retirez délicatement le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 3 ml de milieu de cellules ES.
- Préparer un tube de centrifugation de 50 ml avec 33 ml de milieu préchauffé cellule ES. Ajouter 3 ml de MEF remis en suspension pour amener le volume final à 36 ml.
- Distribuer les 3 ml de MEF remis en suspension dans chaque puits de deux plaques de 6 puits gélatinisé. Placer les plaques dans l'incubateur pendant au moins six heures pour permettre aux cellules de se fixer et se propagent avant l'ensemencement des mESCs sur eux. Ces couches nourricières mitotiquement arrêtés peuvent être utilisables pendant plusieurs jours après l'ensemencement initial, si leurs médias sont changés tous les 2-3 jours.
NOTE: MEF fraîchement arrêtés peuvent également être utilisés. </ Ol>
- MESCs semis
- Quick-dégel d'un flacon avec un clone MESC congelé dans un bain d'eau à 37 C °, et de préparer les cellules comme décrit dans 2.1.1-2.1.3.
NOTE: Nous geler 2 flacons de MESC d'un puits confluent d'une plaque à 6 puits. - Retirez le support d'un puits (par MESC clone) de la plaque à 6 puits avec des monocouches arrêtées MEF (préparé dans l'étape 2.1.5) et ensemencer 3 ml de la mESCs au-dessus de la monocouche MEF. Ajouter 3 pi de 1,000x LIF (10 ng / ml). Retour plats dans l'incubateur.
- Quick-dégel d'un flacon avec un clone MESC congelé dans un bain d'eau à 37 C °, et de préparer les cellules comme décrit dans 2.1.1-2.1.3.
- L'entretien des cellules ES et de la trypsine médiation passage
REMARQUE: les médias changent tous les jours, ou division sur la base confluent de MESC. Idéalement, la récolte et intermédiaires / re-plaque les cellules tous les deux jours.- Retirez le support de cellules souches embryonnaires et laver mESCs avec 2 ml de PBS. Retirer du PBS. Ajouter 1 ml de trypsine à 0,25% et on incube à 37 ° C pendant 3-5 min.
- Recueillir les cellules traitées à la trypsine et les transférer dans un tube à centrifuger de 15 ml. Vigoureusement pipette la suspension de cellules pour briser les mottes de mCES. Ajouter 2 ml de milieu complet de cellules ES à la suspension de cellules de neutraliser la trypsine.
- cellules de tourner à 400 x g pendant 5 min à 4 ° C. Retirer le surnageant et remettre en suspension le culot dans 3 ml ES médias cellulaire.
- Retirez le support de plaques de 6 puits contenant des monocouches préparés MEF arrêtés. Ajouter la quantité appropriée de la suspension de cellules (sur la base du rapport de division souhaité) dans 3 ml de milieu de cellules ES à chaque puits pour ensemencer. Ajouter 3 pi de 1,000x FRV. Un confluent MESC bien divisé 1: 6 sera prêt pour le passage en 2 jours.
- OP9 / entretien des cellules OP9-DL1
- Décongeler une fiole de cellules OP9 (suivez les étapes 2.1.1-2.1.3 l'utilisation des médias OP9)
- Ajouter 7 ml de milieu de OP9 à boîte de 10 cm pour culture de tissus. Ajouter 3 ml de cellules remises en suspension d'une manière goutte à goutte, la distribution des cellules tout au long de la plaque. Placer les cellules dans l'incubateur pendant une nuit.
- Vérifiez la confluence des cellules OP9 le lendemain. Si le plat contient de nombreuses cellules flottantes morts, remove les médias et ajouter 10 ml de milieu de OP9 frais. Remettre le plat dans l'incubateur si presque pleine confluence n'est pas observée. Split (utilisant de la trypsine) 1: 4 la monocouche près de la confluence de OP9.
NOTE: Les plaques doivent encore atteindre un même niveau de confluence dans environ 2 jours. Prenez soin de ne pas laisser les cellules OP9 devenir plus confluentes. - Geler les premiers passages de cellules OP9 que les stocks d'expansion.
NOTE: Nous geler 2 flacons de cellules OP9 d'un proche confluence de 10 cm. Chaque flacon d'expansion stock peut être encore propagée à constituer des stocks de travail qui sont ensuite utilisés dans Mesc expériences de co-culture. Gardez tous les stocks de OP9 congelés dans l'azote liquide plutôt que dans le congélateur à -80 ° C, car les fluctuations de température peuvent influer négativement sur la qualité des gels.
3. OP9-DL1 Co-culture procédure
- Préparations de co-culture
- Environ une semaine avant le début d'une co-culture, décongeler MEF, mESCs et sto cellule OP9 travailcks. Comme les cellules OP9-DL1 ne sont pas nécessaires jusqu'au jour de co-culture 8, décongeler les cellules OP9-DL1 pendant les trois premiers jours après le début de co-culture. Maintenir ou geler toutes les cellules que nécessaire.
- Déterminer le nombre initial de plaques de 10 cm avec des monocouches de cellules OP9 préparés pour atteindre 80% de confluence sur la co-culture jour 0 fondé sur le barème de l'expérience (par exemple, le nombre de clones Mesc à être différencié et le nombre de co-culture des moments de analyser). Pour se préparer à une co-culture, diviser près plat de confluence des cellules OP9 entre 1: 4 et 1: 6, deux jours avant lorsque les monocouches seront nécessaires.
REMARQUE: Il faudra au moins une plaque par ESC clone. En règle générale, un seul clone ESC ensemencée sur une seule plaque (comme décrit ci-dessous) au jour 0 devrait donner suffisamment de cellules pour ensemencer six plaques à la journée 5 passage. Chaque plaque jour 5 permettra un ultérieur point de temps d'analyse. - Depuis monocouches OP9 seront continuellement nécessaires pour le passage de co-culture, prenez soin de toujours maintadans un nombre suffisant de plaques de culture de OP9 supplémentaires en parallèle avec la co-culture.
- Jour 0: Initiation de co-culture
- Recueillir MESC comme dans 2.3.1-2.3.4. Compter les cellules.
- Pour chaque clone MESC préparer 5 x 10 4 MESC dans 10 ml de milieu par boîte de OP9.
NOTE: Bien que nous n'avons pas utilisé, nous notons qu'un moyen alternatif consistant en α-MEM, 10% de FBS, et 5 x 10 -5 M β-mercaptoéthanol a également été signalé pour une utilisation dans la différenciation des co-cultures 10. - Enlevez le vieux médias de OP9 plats et ajouter les 10 ml de suspension MESC les plats en prenant soin de distribuer les cellules uniformément dans toute la plaque. Placez les plats à la 37 ° C incubateur.
- Jour 3: Changement de média
- Retirer les plats de l'incubateur et observer au microscope. Colonies devraient commencer à perdre brillance et semblent aplatie.
- Retirez le papier de plats et ajouter doucement 10 ml de frais OP9médias.
- Retour aux plats de co-culture de l'incubateur. Contrôler visuellement la formation de colonies mésoderme comme tous les jours pour informer le calendrier de préparation OP9 alimentation monocouche pour le prochain passage (jour 5), qui ne devrait pas être effectuée jusqu'à ~ 80-90% des colonies afficher visuellement mésoderme comme morphologie. Report maximum de cinq jours l'étape de transfert de cellule est de 2 jours.
- Jour 5: trypsine passage médiation avec pré-placage.
REMARQUE: Préparez à l'avance un nombre suffisant de boîtes de 10 cm avec des cellules OP9 optimale confluentes. Procédez aux étapes suivantes que si les co-cultures afficher visuellement les caractéristiques décrites à l'étape 3.3.3 (voir aussi résultats représentatifs).- Retirez le support de la vaisselle de co-culture. Ajouter 4 ml de PBS à laver. Agiter le PBS et l'enlever. Ajouter 4 ml de trypsine à 0,25% et placer les plats dans l'incubateur pour ~ 5 min.
- Perturber la couche de cellules traitées à la trypsine par pipetage vigoureux, en prenant soin de ne pas introduire de bulles d'air excessifs, jusqu'à unsuspension cellulaire homogène, la plupart du temps unique est obtenue.
- Ajouter 4 ml de milieu OP9 complètes et mélanger par pipetage. Transfert des cellules dans un nouveau, vide de 10 cm et les placer dans l'incubateur pendant 30 min pour permettre aux cellules OP9 à adhérer à l'antenne. Cette étape de «pré-placage" réduit le nombre de cellules transférées OP9 à la prochaine étape de co-culture.
- Préparer 50 ml tubes de centrifugeuse avec tamis de cellules de 40 um.
- Recueillir des cellules non-adhérentes de l'antenne pré-plaqué et de les transmettre à travers le tamis de cellules dans le tube. Laver la capsule doucement avec 6 ml de PBS et passer à travers le même filtre, laissant les cellules OP9 attachées derrière.
- Centrifuger les cellules à 400 x g 5 min à 4 ° C. Retirer le surnageant et remettre en suspension les cellules sédimentées dans 3 ml de milieu complet de OP9. Compter les cellules.
- Retirez le support de plaques de 10 cm avec des cellules OP9 optimale confluentes.
- Pour chaque point de temps d'analyse, de semences 5 x 10 5 cellules sur la OP9 monocouche dans un volume final de 10 ml.
- Ajouter 5 ng / ml recombinant Flt-3L humain et de placer les plats dans l'incubateur.
- Jour 8: de cellules souches hématopoïétiques (HPC) collection
REMARQUE: préparer à l'avance un nombre suffisant de plaques de 6 puits avec des monocouches ou OP9 OP9-DL1 cellules de sorte qu'elles seront ~ 80% de confluence dans le temps pour cette étape.- Préparer 50 ml tubes de centrifugation avec 40 um tamis.
- Retirez les plats de l'incubateur et observer au microscope. Grappes brillantes de BHP devraient être plus ou moins attachés à la monocouche OP9. Recueillir le plus grand nombre de ces cellules que possible par lavage (mais pas trop perturber) la monocouche OP9 avec une pipette et les médias existant sur le plat. Pour éviter la formation de mousse, laissez toujours au moins 1 ml de médias dans la pointe de la pipette au cours de cette collection de HPC / étape de lavage.
- Faire passer les cellules à travers le tamis de 40 um dans un tube. Ajouter 8 ml de PBS à la même plaque et vérifier sous le microscope si tous les CAH nousre recueillies. Répétez l'étape de lavage / de collection avec du PBS et (si nécessaire) avec un lavage plus énergique. Filtrer les cellules dans le tube contenant déjà les cellules provenant de la même plaque.
- Centrifuger les cellules à 400 g pendant 5 min à 4 ° C.
- Préparer un mélange de maître de 3 ml (par plaque ensemencée au jour 5) des médias OP9 avec 5 ng / ml Flt-3L et 1 ng / ml d'IL-7.
- Retirer le surnageant et remettre le culot dans les médias OP9 avec Flt-3L + IL-7 master mix (3 ml pour chaque boîte de 10 cm traitées). Transférer les cellules recueillies à partir de chaque plaque dans un puits d'une plaque à 6 puits avec des cellules OP9.
- Pour conduire les cellules vers monocytes, cellules B ou lignées érythroïdes, ensemencer les cellules prélevées sur des cellules OP9. Pour obtenir des cellules T, ensemencer les cellules sur des monocouches de cellules OP9-DL1.
- Placez les plaques de 6 puits en incubateur.
- Jour 10: Changement de média
- Préparer un tube à centrifuger de 15 ml pour chaque clone MESC-chargeur type de cellule distinct combination en co-culture.
- Préparer un mélange maître de supports de OP9 avec 5 ng / ml de Flt-3L et 1 ng / ml d'IL-7. Préparez 3 ml pour chaque puits.
- Recueillir délicatement les médias de chaque puits de la plaque de 6 puits combiner les médias à partir de plusieurs puits contenant le même clone-alimentation combinaison de type de cellule ESC.
- Ajouter 2 ml de mélange maître de médias OP9 (voir 3.6.2) dans chaque puits.
- Centrifuger la presse collectées à 400 x g pendant 5 min à 4 ° C. Retirer le surnageant et remettre en suspension chaque culot (très faible si visible) dans 1 ml de OP9 maître médiatique mélange (voir 3.6.2) par puits collectées à l'origine à l'étape 3.6.3.
- Distribuer 1 ml de cellules de nouveau dans chaque puits à partir de laquelle les médias ont été recueillis portant le volume dans chaque puits de 3 ml. Remettre les boîtes dans l'étuve.
- Jour 12: Pas de passage de la trypsine
REMARQUE: préparer à l'avance un nombre suffisant de boîtes à 6 puits avec des cellules OP9 ou OP9-DL1 afin qu'ils soient confluentes de façon optimale dans le temps pour ce step. Jour 12 est idéal pour la cytométrie en flux analyses de érythroïde en développement, monocytes et lymphocytes T à un stade précoce.- Préparer un mélange maître (3 ml pour chaque bien qui se poursuivra en co-culture) des médias OP9 avec 5 ng / ml de Flt-3L et 1 ng / ml d'IL-7.
- Préparer 50 ml tubes à centrifuger de 40 um tamis (un pour chaque clone-alimentation combinaison de type de cellule ESC en co-culture).
- Pipette vigoureusement les médias existants dans chaque puits de ventiler toutes les cellules (y compris la monocouche) dans le puits. Continuer avec pipetage vigoureux jusqu'à un état ressemblant à une suspension de cellule unique est obtenue.
- Passez les cellules recueillies à travers le tamis dans le tube. Ajouter 3 ml de PBS dans chaque puits pour laver et de recueillir toutes les cellules restantes. Passez cellules à travers le même filtre. Mélanger les cellules à partir de plusieurs puits contenant le même clone-alimentation combinaison de type de cellule ESC.
- Jeter le filtre cellulaire et retirer une aliquote l'équivalent d'un bien (~ 6 ml) pour toute désirécytométrie de flux (ou autre) des analyses à effectuer ce jour-là. Conserver les échantillons sur la glace avant utilisation.
- Centrifuger les cellules à 400 g pendant 5 min à 4 ° C. Retirer le surnageant. Reprendre le culot des tubes de 50 ml de centrifugeuses dans 3 ml de mélange maître par puits pour être re-graine. Ajouter 3 ml par puits de chaque suspension cellulaire sur le type de cellules nourricières appropriées et placer les boîtes dans l'incubateur.
- Jour 14: Changement de média
- Suivez les étapes décrites à la section 3.6.
- Jour 16: Pas de passage de la trypsine
REMARQUE: préparer à l'avance des boîtes de 6 puits de cellules OP9 ou OP9-DL1 confluentes de façon optimale pour cette étape.
REMARQUE: Jour 16 est idéal pour les analyses de flux cytométrie de lymphocytes B et les lymphocytes T de la scène centrale.- Suivez les étapes décrites dans la section 3.7.
- Jour 18: Changement de média
- Suivez les étapes décrites à la section 3.6.
- Jour 20: n passage de la trypsine
REMARQUE: Jour 20 is idéal pour la cytométrie en flux analyse de mi à fin phase de développement des cellules T.- Suivez les étapes décrites dans la section 3.7. Si vous le souhaitez, effectuer la différenciation des cellules passé 20 jours changement de support alternatif et pas trypsine passages tous les deux jours, avec un suivi quotidien du taux d'expansion des lymphocytes.
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Representative Results
Lorsqu'il est cultivé sur MEF en présence de LIF, mESCs peuvent être maintenues dans un état indifférencié. Dans des conditions idéales, ils apparaissent sous forme de colonies compactes de cellules entourées par un halo lumineux en microscopie à contraste de phase (figure 1). Ces cultures doivent être contrôlés quotidiennement. Selon la confluence des cellules, les médias peuvent être modifiés ou cellules peuvent être divisées. Voisins colonies de Mesc ne doivent pas venir au point de contact avec l'autre. Une culture saine et normale de mESCs indifférenciées est un point de départ essentiel pour la différenciation in vitro dans des cellules T. Lors du lancement de co-culture, il est recommandé que les cellules soient pleinement confluentes sans être surpeuplé. Il en est ainsi de la plupart des cellules récoltées pour l'ensemencement de cellules sur des monocouches de OP9 sont MESC (plutôt que des cellules nourricières). Si des différences majeures dans la confluence sont observées entre les différents clones Mesc être différenciées au jour 0, alors il serait préférable de supprimer MEF en pré-adhésion à tisdes boîtes de culture sue (comme à l'étape 3.4.3-3.4.6 l'utilisation des médias complet des cellules ES) avant de compter les mESCs pour co-culture ensemencement.
cellules OP9 doivent être bien entretenus avant le début de co-culture (comme décrit à la section 2.4). En outre, on pense que OP9 cellules perdent certaines de leurs propriétés avec la culture prolongée et / ou l'augmentation marquée de leur taux de prolifération 7 Éviter rapports cassés au-delà de 1:. 5 lors de l'entretien de OP9 cellules, et à rejeter les cultures OP9 continues après six semaines, permettra d'éviter ces écueils.
A l'ensemencement des cellules et de transfert de cellule étapes initiales de la co-culture (jours 0, 5, 8, 12, 16), des monocouches OP9 doivent se situer dans une plage optimale de confluence. Figure 2 montre le bas (figure 2A) et haute (Figure 2B) se termine de la gamme de OP9 cellules confluence recommandé pour une utilisation sous forme de monocouches de co-culture. Un exemple d'une plaque au-dessus de confluence est représenté sur la Figure 2C. Le non-respect confluence optimale peut induire la formation d'adipocytes (Figure 2D) qui, en grandes quantités, peuvent affecter négativement la co-culture.
Au jour 0, la co-culture est démarrée sur OP9 cellules plutôt que OP9-DL1 depuis la formation de cellules du mésoderme est favorisée sur OP9 cellules. Les cellules sont étalées sur OP9-DL1 cellules monocouches ouverts à compter du jour 8 pour induire la production de lymphocytes T. Alors que certains clones Mesc seront afficher visuellement (~ 90%) formation robuste et quantitative des colonies de mésoderme comme au jour 5 de co-culture (figure 3A-B), d'autres peuvent afficher des retards à cette étape (figure 3C-F). Sous le microscope, les colonies de mésoderme comme dérivés dans cet essai ont été variablement décrit comme ressemblant à roues de charrette ou de cratères (figure 4A) ou, starbursts ou fleurons (figure 4B).
Bien que le protocole OP9-DL1 publié reflétant une norme quantitative de mésoderme formation par jour 5 de co-culture, 7, nous trouvons que tous les clones ESC atteindre cette norme dans ce laps de temps. Dans ces cas, nous changeons le moyen le jour 5 et un délai supplémentaire de 1-2 jours avant de procéder à l'/ protocole de transfert "jour 5" récolte des cellules. Le but de ce retard est de permettre à ~ 80-90% des colonies de cellules souches embryonnaires à mésodermique devenir visuellement avant de transférer. Il est important de préciser que ce chiffre de 80-90% reflète un critère discernable strictement visuelle par simple contraste de phase inspection microscopique de la morphologie des colonies dans les plats de co-culture. Il se réfère uniquement à la proportion de colonies ESC qui ressemblent à ceux de la figure 4. Il est possible que certains clones ESC n'atteindront pas ce critère visuel, même après un délai de deux jours. Dans un tel cas, il est possible d'enrichir le sang pour former des précurseurs mésodermiques à l'aide de tri cellulaire par cytométrie en flux pour Flk-1 + cellules, comme cela a été décrit précédemment. 6,11 Dans tous les cas, pour la SAke de nomenclature commodité, nous «Réinitialisation de l'horloge» et se réfère à la date du transfert de la colonie mésoderme comme comme "jour 5"
Lorsque plusieurs clones ESC sont différenciés en parallèle, il est possible que certains des co-cultures seront prêts pour le jour 5 passage à l'heure, tandis que d'autres sont à la traîne. Dans ce cas, il est conseillé de retarder l'adoption de tous les co-cultures jusqu'à ce que les clones plus lents rattraper les autres. Le retard ne semble pas faire de mal aux «à temps» co-cultures, mais bénéficie de la différenciation ultérieure des clones plus lents un grand deal.
Jour 8 (soit trois jours après le transfert de la colonie du mésoderme) voit l'émergence et l'accumulation des CAH. CAH sont visibles comme des grappes brillantes de cellules qui sont plus ou moins respectées les cellules OP9 d'alimentation (figure 5). Une procédure de lavage soigneux, à l'aide d'une pipette et les médias sur le plat, se détacher et de recueillir les CAH tout en laissantla monocouche OP9 essentiellement intact (figure 6A-C). C'est peut-être l'étape la plus sensible à la technique du protocole. Il faut une certaine pratique pour trouver les mouvements appropriés et la pression d'éjection des médias pour atteindre l'équilibre souhaité de récolte maximale des CAH avec une perturbation minimale de la couche d'alimentation. Il est acceptable si une partie de la monocouche OP9 décolle, puisque la majorité d'une monocouche parasite sera capturé dans le 40 um filet de nylon après filtrage. Figure 6D représente une monocouche suivant l'ajout excessif conduisant à une plus grande désintégration de la monocouche que nécessaire. Au cours de cette étape de lavage, il est important de vérifier sous le microscope ou non tous les CAH ont été collectés, et ajuster la pression de lavage en conséquence.
Les progrès de la co-culture peut être surveillée par cytométrie de flux. Pour analyser spécifiquement la descendance hématopoïétiques non érythroïdes du CES, il est important de première porte sur CD45 + cellules direct.Cette étape écrans sur les cellules OP9 des analyses, tandis que l'utilisation de DAPI ou autre colorant de coloration nucléaire permet à l'exclusion des cellules non viables. Le jour 12, de nombreuses grappes de petites cellules rondes, brillantes doivent être visibles. Il n'est pas nécessaire de compter le nombre de cellules à ce stade. Mais nous avons constaté que vivre, le nombre d'événements de cytométrie de flux fermée sont généralement de l'ordre de 1-3 x 10 5 par jour 12 co-culture bien. La cytométrie en flux analyse de cellules vivantes-dépendants différenciés sur la monocouche OP9 donnera érythroïde (CD45 neg, Ter119 +) et les monocytes (CD45 +, CD11b salut) lignées (figure 7A). Les analyses de CD45 +, des cellules vivantes de différenciation sur OP9-DL1 monocouches devrait révéler des marqueurs caractéristiques des cellules CD4 / CD8 double négation (DN) -1 (CD44 +, CD25 neg, CD4 neg CD8 neg) et DN2 (CD44 +, CD25 +, CD4 neg CD8 neg) cellules de stade T (figure 7B ng>). Au jour 16, on observe une augmentation significative de la quantité de petites cellules rondes, brillantes dans les cultures. Sur OP9-DL1s, T produits de différenciation cellulaire progrès à l'(neg CD44, CD25 +, CD4 neg CD8 neg) DN3 et DN4 (CD44 neg, CD25 neg, CD4 neg, CD8 neg) étapes. Certains DP (CD4 +, CD8 +) des cellules T peuvent aussi commencer émergents par jour 16 (figure 7B). CAH ensemencée sur OP9 cellules produisent des cellules B (CD19 +) par jour 16 par jour 20 de OP9-DL1-MESC co-culture, il y aura de grandes quantités de cellules DP T et positif unique (SP) des cellules T CD8 + présents ( Figure 7B). Figure 8 fournit un schéma résumant les principales étapes de la procédure ci-dessus, et les points de temps d'analyse proposées au cours de co-culture.
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Figure image de microscopie à contraste de phase 1 de mESCs indifférenciées (colonies pointus ou tranchants) de plus en plus au-dessus d'une monocouche MEF (100X de grossissement).
Figure 2:.. Phase images de microscopie de contraste de OP9 monocouche confluence (A) (B) plus hauts niveaux de confluence conseillées pour la co-culture passage / semis (40X) (C) Exemple d'un sur-confluentes OP9 monocouche (40X plus bas et ). (D) Plus de confluence OP9 monocouche (200X) avec la formation d'adipocytes (grande, la vésicule contenant les cellules).
Figure 3: Microscope à contraste de phaseimages y de la formation de colonies mésoderme comme au "jour 5" de co-culture. (A) vues 40X et (B) 100X de plaques de co-culture avec la différenciation mésodermique colonie> 90%. Ces plaques sont prêtes pour le jour 5 passage. (FC) Des exemples de plaques Jour 5 de co-culture qui nécessitent 1-2 jours report avant le transfert (C & E, un grossissement de 40X, D & F, grossissement 100X).
Figure 4: Phase des images de microscopie de contraste de la variété des formations de colonies mésoderme comme au jour 5 de co-culture (A) La morphologie des colonies appelées «cratères» ou (B) La morphologie de la colonie référence. "Roue de chariot." comme «Starburst» ou «fleurons» (200X).
Figure image de microscopie à contraste de phase 5 du jour 8 plaque co-culture avec des grappes de petites rondes, CAH brillantes sur une monocouche de OP9 (40X de grossissement).
Figure 6:.. OP9 monocouche après la collecte des CAH le jour de co-culture 8 (AC) gamme appropriée de perturbation de OP9 monocouche après un lavage soigneux de récolter HPC (D) Un exemple d'une monocouche de OP9 qui a été plus perturbé par jour 8 HPC procédure de récolte.
Figure 7: Représentant cytométrie de flux (FACS) analyse à des points particuliers de temps pendantMESC différenciation in vitro. (A) Coloration pour érythroïde (à gauche), monocytaire (au milieu) et la cellule B (à droite) les produits de MESC-OP9 co-culture au jour 12 ou 16 comme indiqué. (B) Coloration pour le développement des cellules T aux moments indiqués de MESC-OP9-DL1 co-culture. S'il vous plaît voir le texte pour les descriptions détaillées des immunophénotypes.
Figure 8: Schéma des étapes de la procédure MESC-OP9 co-culture. (A) Les principales étapes de transfert de cellule des huit premiers jours de co-culture. Le nombre approximatif de cellules ensemencées sur des cellules OP9 à jour zéro et cinq sont indiquées. (B) L'étape de transfert jour 8 et les produits attendus de différenciation cellulaire détectés par cytométrie en flux à timepoints clés de co-culture. S'il vous plaît voir le texte pour les descriptions détaillées des immunophénotypes.
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Discussion
Le système OP9-DL1 co-culture a été utilisée pour étudier le rôle des différents produits de gènes au cours du développement de types de cellules sanguines à partir de cellules souches. 8,12,13 Il s'est également avéré un modèle efficace pour étudier la fonction de l'ADN de régulation de gènes cours de la différenciation cellulaire 9,14. Grâce à cette approche comme une alternative aux modèles entiers de la souris peut produire des économies considérables en temps et en coût d'expériences qui répondent à de nombreuses questions de base dans l'hématopoïèse. Cependant, l'adaptation de ce protocole à ces fins exige connaissance de la variabilité potentielle entre les clones Mesc qui seraient utilisés dans ces procédures. Le calendrier du protocole publié est prévisible à partir de la moyenne, bien entretenu, ligne MESC non manipulé. 7 En outre, les clones sélectionnés Mesc pour la génération de souris chimériques sont généralement de meilleure qualité et se produira très robuste en OP9 co-culture . D'autre part, les clones Mesc émergent directement de l'établetransfection avec un transgène ectopique intégré affiche des degrés divers de l'efficacité de la différenciation initiale allant de moyenne à moyenne-dessous. Le protocole décrit ici fournit une stratégie pour 1-2 jours de retard de l'étape 5 jours de passage pour égaliser les différences de potentiel avant l'induction de l'hématopoïèse in vitro.
Le passage jour 8 est l'étape au cours de laquelle l'exécution de ce protocole a le plus de risque d'erreur. Patience, la pratique et l'observation attentive permettra de développer une technique qui optimise la récolte de HPC tout en minimisant les perturbations OP9 monocouche. Au-delà des principaux jours 5 et 8 étapes, les paramètres critiques impliquent méticuleux entretien de culture cellulaire (cellules OP9 particulier, tel que décrit ci-dessus) et une attention particulière pour les réactifs utilisés dans le protocole. Le réactif le plus critique est le FBS. Lots distincts de FBS varient considérablement dans leur capacité à soutenir cette procédure. Plusieurs lots doivent être testés en oRDONNANCE pour déterminer ce qui donnera différenciation solide dans cet essai.
Ce système de co-culture a ses limites. Par exemple, ce modèle ne prend pas en charge la différenciation des cellules CD4 positives simples. Une raison à cela est l'absence d'expression du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) de classe II infrastructure de présentation de l'antigène dans les cellules OP9. Une cellule de présentation de surface des antigènes de MHC de classe II est nécessaire pour le bon développement des cellules CD4 SP. Les cellules CD8 SP qui font émerger représentent un mélange de phases de thymocytes CD8 SP matures et immatures. 1 En outre, une transplantation réussie de MESC dérivé progéniteurs des lymphocytes T dans une souris nécessite le passage préalable par la culture d'organes thymus fœtal. 1 Néanmoins, cette technologie a fait ses preuves promettre comme une démarche d'investigation puissant aux deux questions cellulaires et moléculaires dans le sang et le système immunitaire de développement qui étaient auparavant uniquement possible d'explorer en vIvo. Ainsi, en dehors de fournir une nouvelle façon de faire des progrès plus rapides sur ces questions, une plus large adoption du système de co-culture OP9-ESC aura le plus grand impact de la réduction de l'utilisation des animaux de laboratoire.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Corning | 15-013-CV | |
| Stem cell qualified FBS | Gemini | 100-125 | Heat inactivated |
| Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| L-alanyl L-glutamine | Corning | 25-015-CI | |
| HEPES buffer | Millipore | TMS-003-C | |
| Non-Essential Amino Acids | ThermoScientific | SH30853.01 | |
| Gentamicin Regent Solution (50 mg/ml) | Life Technologies | 15750-060 | |
| β-mercaptoethanol (55 mM) in DPBS | Life Technologies | 21985-023 | |
| Filter Unit | Millipore | SCGPU05RE | 0.22 μm PES membrane |
| Cell Culture Grade Water | Corning | 25-055-CM | |
| α-MEM | Life Technologies | 12000-022 | Powder, reconstitute per manufacture recommendation |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761-500G | |
| FBS | ThermoScientific | SH 30396.03 | Testing of individual lots required |
| Dimethyl Sulphoxide | Sigma | D2650 | |
| Recombinant Human Flt-3 Ligand | R&D Systems | 308-FK | |
| Recombinant Murine IL-7 | PeproTech | 217-17 | |
| LIF | Millipore | ESG1107 | |
| Utrapure water with 0.1% gelatin | Millipore | ES-006-B | |
| MEFs mitomycin C treated | Millipore | PMEF-CF | Any mitotically arresteded MEFs can be used |
| DPBS | Corning | 21-031-CV | |
| Cell strainer (40 μm) | Fisher | 22363547 | |
| Tissue culture dish 100 x 20 mm | BD Falcon | 353003 | |
| Multiwell 6-well | BD Falcon | 353046 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
| 15 ml centrifuge tubes | BD Falcon | 352096 | |
| 50 ml centrifuge tubes | BD Falcon | 352070 | |
| 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap | BD Falcon | 352235 | Tubes for FACS |
| ES R1 cells | ATCC | SCRC-1011 | |
| OP9 cells | Cells can be obtained from the Riken Laboratory Cell Repository (Japan). | ||
| OP9-DL1 cells | Cells can be requested from the Zúñiga-Pflücker laboratory. | ||
| FlowJo software | Tree Star | FACS data analyses | |
| Flow Cytometer | BD | FACScan, FACSCalibur and FACSVantage have been used in our lab |
References
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