Abstract
Processi di sviluppo inerenti pupa Drosophila possono spostare e distorcere l'epitelio occhio in modo tale da rendere il comportamento delle cellule individuali difficili da rintracciare durante l'imaging cellulare dal vivo. Questi processi comprendono: la rotazione della retina, la crescita cellulare e la circolazione organismal. Inoltre, irregolarità nella topologia dell'epitelio, compresi urti sottili e pieghe spesso introdotti come la pupa è preparato per l'imaging, rendono impegnativo per acquisire immagini in-fuoco di più di qualche ommatidi in un unico piano focale. Il flusso di lavoro delineato qui rimedi questi problemi, consentendo un facile analisi dei processi cellulari durante lo sviluppo di Drosophila pupa occhio. Pupe Opportunamente-messa in scena sono disposti in una piattaforma di imaging che può essere facilmente montato nella maggior parte dei laboratori Ubiquitin-DE-caderina. GFP e GMR-GAL4 -driven UAS-α-catenina: GFP sono utilizzati per visualizzare i bordi delle celle nell'epitelio dell'occhio 1 -3. Dopo deconvoluzione èapplicata alle immagini catturate fluorescenti a più piani focali, immagini massimi proiezione vengono generate per ogni punto di tempo e migliorate utilizzando un software di editing delle immagini. Algoritmi di allineamento vengono utilizzati per stabilizzare rapidamente il movimento superfluo, rendendo il comportamento delle cellule individuali più facile tenere traccia.
Introduction
Il composto Drosophila occhio è caratterizzato dalla disposizione dei suoi stereotipo ~ 750 ommatidi separati da un reticolo a nido d'ape di cellule pigmentate accessorie 4,5. Queste cellule del pigmento sono modellati da una combinazione coordinata di eventi: i movimenti delle cellule locali, la crescita delle cellule, cambiamenti di forma delle cellule e l'apoptosi. Visualizzazione diretta di questo epitelio permette di studiare i meccanismi molecolari alla base di questi eventi in un contesto tridimensionale fisiologicamente rilevanti e imperturbabile.
Diversamente dai precedenti protocolli 6,7, la tecnica qui delineato incorpora un metodo efficace per stabilizzare il movimento del tessuto estraneo che non può essere disaccoppiato dal processo di imaging. Questo metodo migliora studi di comportamento delle cellule in via di sviluppo Drosophila pupa occhio epitelio - un tessuto che cresce, ruota e si sposta nel corso di imaging. Inoltre, il movimento di stabilizzazione technique dedescritto qui sarà utile per studiare le cellule in altri contesti in cui si verifica il movimento estraneo.
Per visualizzare i bordi delle celle nel campo della retina Drosophila, linee mosca transgenici sono stati generati che esprimono ubi-DE-caderina: GFP e UAS-α-catenina: GFP sotto il controllo del driver specifico-eye GMR-GAL4 1-3. L'uso di due marcatori di membrana GFP-tag permette la visualizzazione dei bordi delle celle a luce minore intensità. Questo riduce al minimo i danni ai tessuti e photobleaching esposizione ripetuta a lunghezze d'onda ad alta energia, che consente una maggiore frame rate e la durata del filmato. Per migliorare l'efficacia dei transgeni RNAi, UAS-DCR-2 è stato anche inserito in una seconda linea di volo 8.
In un terzo aggiornamento da protocolli precedenti, un impianto di imaging semplice che può essere facilmente montato in maggior parte dei laboratori è descritto. Questo apparecchio evita la necessità di avere un dell'imaging r specializzataig generato da 'officina' di un'università o di un servizio simile. Questo impianto di imaging è simile a quella utilizzata per immagine altri tessuti pupa 9,10.
Presentato qui è un semplice protocollo live-cell imaging che può essere utilizzato per valutare direttamente gli eventi morfogenetici che contribuiscono a patterning occhio da ~ 17-42 ore dopo la formazione puparium (hr APF). In particolare, questo protocollo permette di determinare le conseguenze di modificare l'espressione genica durante lo sviluppo pupa.
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Protocol
La figura 3 mostra una sintesi della procedura sperimentale.
1. Preparazione del tessuto
- Per determinare le conseguenze di espressione modificata di un gene di interesse, impostare il seguente croce in duplice copia e mantenere a 25 ° C: UAS-transgene (maschi) X GMR-GAL4; UAS-α-cat: GFP, ubi-DE-Cad: GFP; + / SM5-TM6b (femmine vergini) NOTA: Per ottenere il controllo incrociati tessuto UAS-lacZ maschi a GMR-GAL4; UAS-α-cat: GFP, ubi-DE-Cad: femmine GFP. β-galattosidasi genera difetti nel comportamento cellulare nella retina.
- Per migliorare l'efficacia dei transgeni RNAi, croce UAS-RNAi maschi a GMR-GAL4, UAS-DCR-2; UAS-α-cat: GFP, ubi-DE-Cad: GFP; + / SM5-TM6b femmine vergini.
NOTA: i difetti occasionali nel comportamento delle cellule in retine esprimono ectopica DCR-2 sono stati osservati (dati non riportati). La vigilanza è consigliata se si utilizza questo metodo. - Seletto bianco pre-pupe di genotipi appropriati e posto in provette da 1,5 ml microcentrifuga. Se le pupe esprimere DCR-2, selezionare pupe maschio o femmina: espressione di UAS-DCR-2, un inserto sul cromosoma X, è più forte nei maschi. Pupe dovrebbe essere sessuato a 0 hr APF prima pigmentazione caso pupa - gonadi di maschi sono visibili come grossi globi trasparenti ai lati laterali della pupa (circa un terzo del posteriore).
- Incubare microprovette contenenti pupe, in una plastica tip-box pulito a 25 ° C. Per prevenire l'essiccamento del luogo pupe a 10 cm 2 pezzo di tessuto, imbevuto di acqua distillata, nella punta-box.
NOTA: se l'umidità nella punta-box diventa troppo alto il caso pupa può diventare molliccia e difficile da sezionare in fasi successive. - Incubare per momento opportuno. Per catturare i comportamenti cellulari associati con patterning l'occhio, preparare pupe per l'imaging a circa 17 ore APF, 20 hr APF o 24 ore APF. Vedi Rappresentante Risultati per ulteriori discussioni su quando i comportamenti di cellule specifiche sono meglio rispettati.
- Posizionare un pezzo di nastro biadesivo fresco su un piatto dissezione sylgard nero. Posizionare un lato pupa, dorsale in su, con la testa della pupa aderito al nastro biadesivo (Figura 1A) .Try a non aderire toracica e addominale regioni della pupa al nastro biadesivo. Con una pinza con attenzione sollevare e rimuovere il opercolo per esporre la testa pupa. Strappo lungo il lato del caso pupa per esporre l'area intorno a un occhio.
- Rimuovere delicatamente la pupa del nastro adesivo. Se la pupa rimane aderente, applicare una piccola quantità di acqua distillata alla giunzione tra il caso pupa e il nastro di indebolire l'adesione.
2. Montaggio
- Costruire un piccolo 15 millimetri 2 telaio da carta assorbente e un buco nel middlethat 5,5 mm di diametro (Figura 1B). Immergere in acqua distillata e posto inil centro di un vetrino da microscopio. Usando una siringa da 30 cc, spremere un anello uniforme di vaselina per circondare la cornice di carta assorbente. Assicurarsi che l'anello vaselina è marginalmente superiore alla larghezza della pupa e che il diametro dell'anello è leggermente inferiore alla larghezza di un vetrino.
- Aggiungere una piccola goccia di vaselina direttamente sul vetrino, nel foro punzonato nella carta assorbente (Figura 1C) Accuratamente organizzare la pupa, sul suo lato, sostenuto dal tallone vaselina (Figura 1D).
- Posizionare un coprioggetto sulla parte superiore dell'anello di vaselina in modo che viene a contatto con l'epitelio sopra neuroepitelio occhio (Figura 1D). Comprimere delicatamente la preparazione per sigillare il vetrino contro la vaselina e generare una piccola superficie di contatto piatta tra la regione occhio pupa e il vetrino.
3. imaging di fluorescenza
- Immagine preparazione pupa con unmicroscopio a fluorescenza. Ogni 7 min cattura sezioni seriali attraverso il dominio apicale neuroepitelio dell'occhio, nella regione delle giunzioni adherens.
NOTA: a) sezioni seriali appropriati sono di solito 4-5 per z-stack composto da 0,2 micron z-passi. b) Irregolarità nella topologia dell'epitelio, compresi urti lievi e pieghe, può rendere difficile per acquisire immagini a fuoco di grandi regioni di tessuto. Mentre l'imaging, si può trovare una parte di una zona di interesse per essere a fuoco, e una regione confinante di essere out-of-focus. Tra cui una piccola goccia di acqua distillata tra l'occhio e la pupa coprioggetto può eliminare alcune pieghe del tessuto acuti ma non la topologia caratteristico leggermente irregolare delle prime fasi della pupa morfogenesi dell'occhio. In questi casi sovracampionamento tessuto estendendo la z-stack fino a fuoco fette vengono acquisiti per l'intero settore. c) Acquisizione di sezioni seriali ogni 7 minuti dovrebbe consentire vivo imaging per 3 a 4 ore, senza una significativa reduction nell'intensità di fluorescenza GFP che possono compromettere la qualità dell'immagine. Intervalli di tempo più brevi possono ridurre il tempo totale di imaging. - Proseguire l'imaging per 3 a 4 ore. Non utilizzare un messa a fuoco automatica e funzione di tempo che è disponibile su molti microscopi a fluorescenza in quanto la crescita pupa e pompaggio del emolinfa sposta la posizione della retina e vigile rifocalizzazione è necessaria ogni 14-21 min. NOTA che l'imaging più di 4 ore può rallentare o stallo morfogenesi dell'occhio.
- Utilizzare software appropriato deconvoluzione per ridurre sfondo e migliorare il contrasto delle immagini della sezione seriale. Per ogni file z-stack, eseguire il seguente in software LAS AF (vedi Tabella dei Materiali): Selezionare il pannello Strumenti, selezionare 3D Deconvoluzione e fare clic su Applica.
- Generare immagini un massimo di proiezione (MP) per ogni file di stack deconvoluto: Selezionare il pannello Strumenti, selezionare Proiezione 3D e fare clic su Applica.
NOTA: L'algoritmo Maximum Projection potrebbe non riuscire a generare un uniformely immagine in-focus per il tessuto che è stato sovracampionato. Una tecnica per affilare le regioni out-of-focus è descritto al punto 5.2.
4. Post-Imaging pupa Rescue e fenotipo di verifica
- Per affrontare se artefatti sono stati introdotti o la pupa danneggiato durante l'imaging, rimuovere con attenzione la pupa del rig immagini: con pinze rimuovere il vetrino e trasferire la pupa di una fiala pulita di cibo. Conservare a temperatura ambiente o 25 ° C fino a quando la mosca adulta emerge.
- Esaminare attentamente il fenotipo dell'occhio adulti e confrontare agli occhi di mosche adulte emergono dalla mosca croce originale.
Elaborazione 5. Immagine
- Automatico Allineamento Immagine:
NOTA: Il tessuto vivo Drosophila si sposterà e crescere durante tutto il processo di imaging. Di conseguenza, i centri di immagini riuniti in momenti successivi non possono corrispondere allo stesso punto nel tessuto Drosophila. Inoltre laintero disco retina ruota di circa 30 ° tra ~ 21 e 23 hr APF. Per evidenziare i comportamenti delle singole celle e ridurre le distrazioni causate dalla crescita organismal, allineare ogni deputato image.While questo può essere eseguito manualmente, il software di editing delle immagini qui utilizzato (vedi Tabella dei Materiali) ha algoritmi incorporati che possono accelerare il processo.- Dalla scheda File del menu principale, script aperti e selezionare i file di carico in Stack.
- Importare i file immagine MP nel pannello Livelli di carico e selezionare OK. Assicurarsi che il tentativo di allineare automaticamente l'opzione Images non è selezionata.
NOTA: Se questa opzione è selezionata, il software può utilizzare un algoritmo di allineamento che distorce i dati di immagine. - Una volta che tutti i file MP hanno caricato nel riquadro Layers, assicurarsi che tutte le immagini sono in ordine cronologico tale che il punto di tempo prima è in cima alla pila dei livelli. Se i livelli non sono nell'ordine corretto, trascinarli fino a quando non sono ordinatecorrettamente.
- Selezionare Allineamento automatico livelli dalla scheda Modifica del menu principale. Scegli riposizionare e fare clic su OK.
- Se l'algoritmo Auto-Align non orientare i fotogrammi di un punto di riferimento rilevante, apportare piccole modifiche utilizzando lo strumento Sposta.
- Affilatura Composite:
NOTA: Out-of-focus regioni di un'immagine iniziale MP possono essere affilate da 'coltivazione' della corrispondente pila deconvoluto nel software LAS AF. Ritaglio di un file di stack permette di limitare manualmente l'intervallo di un z-stack che viene sottoposta all'algoritmo massima proiezione.- Individuare la funzione Ritaglia nel pannello Strumenti (nella scheda Process). Limitare manualmente le fette iniziali e finali tale da colpire solo la cinghia aderenza all'interno della regione inizialmente fuori fuoco. Fare clic su Applica per generare un nuovo file di stack che è ottimizzato per questa regione.
- Generare un nuovo proiezione massima per lo stack ottimizzato a livello locale e l'esportazione come file TIFF.
- In the software di editing delle immagini (vedi Tabella dei Materiali), script aperti (situati nella scheda File del menu principale) e selezionare Carica file in Stack.
- Importare il file immagine MP iniziale e file MP ottimizzato localmente per un particolare punto di tempo nel pannello Livelli di carico e selezionare OK. Assicurarsi che il tentativo di allineare automaticamente l'opzione Images non è selezionata.
- Selezionare entrambi gli strati negli strati riquadro e quindi selezionare Fusione automatica livelli (che si trova nella scheda Modifica del menu principale) per mascherare automaticamente le regioni competenti delle due immagini, ottenendo una uniforme a fuoco campo retinico. Salva questa immagine composita come file TIFF.
- Ripetere i passaggi 5.2.1 tramite 5.2.5 per tutte le immagini non ottimali MP.
- Ulteriori Regolazioni: ruotare, ritagliare e regolare i livelli dei Livelli Movie:
- Con tutti i livelli selezionati, utilizzare lo strumento Trasforma (Modifica> Trasformazione libera) per ruotare le immagini in modo che l'asse dorso-ventrale della retina è allineatoper l'asse y del telaio filmato.
- Se necessario, utilizzare lo strumento Ritaglia per ridurre il campo visivo di una dimensione e forma desiderata.
- Utilizzare la regolazione del livello (di singoli fotogrammi) per contribuire a migliorare il contrasto tra la membrana cellulare e corpo cellulare.
- Per ragioni stilistiche e per sottolineare comportamenti cellulari specifici, introdurre falsi colori per evidenziare i punti di interesse in ogni fotogramma.
- Animazione: convertire le immagini in un filmato:
- Aprire il pannello Animazione dalla scheda di Windows del menu principale. Selezionare Crea fotogrammi dai livelli dal menu che si trova nell'angolo in alto a destra del riquadro Animazione.
- Si noti che gli strati vengono aggiunti al riquadro di animazione in ordine sequenziale a partire dal fondo della pila. Per invertire l'ordine dei fotogrammi, prima selezionare tutti i fotogrammi e selezionare Inverti fotogrammi dal menu del riquadro Animazione.
- Selezionare un tempo di ritardo fotogramma per ciascun fotogramma utilizzando il menu a discesa sotto il pollice telaiochiodo.
NOTA: Il ritardo cornice per Film da 1 a 4 presentato in questo articolo è di 0,8 sec. - Dalla scheda File del menu principale, aperto Esporta e selezionare rendering video. Scegli QuickTime Export in Opzioni file e selezionare un formato video desiderato. Sotto rendering Opzioni impostare Frame Rate di ordinazione, inserire un frame rate di 15, e fare clic su Render.
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Representative Results
Live-imaging dell'occhio pupa è una strategia di successo per osservare comportamenti delle cellule che contribuiscono al patterning del neuroepitelio. Il ruolo di specifiche proteine può essere facilmente valutata esprimendo transgeni che modificano i livelli di proteina durante lo sviluppo degli occhi. Per fare questo GMR-GAL4 è usato per guidare l'espressione del transgene dietro il solco morfogenetica. Questo offre il vantaggio di non perturbare eventi precedenti che stabiliscono il campo oculare durante i primi due stadi larvali. Inoltre molti transgeni RNAi richiedono tempo significativo per ridurre efficacemente i livelli di proteine (dati ora mostrati). Quindi guida transgeni RNAi con la linea guida GMR-GAL4 spesso permette terzo larvale instar sviluppo degli occhi e eversione dei dischi occhio durante la metamorfosi di procedere indenne e riduce significativamente i livelli di proteina solo più tardi, durante la pupa morfogenesi occhio. Se lo sviluppo larvale è però turbato da un altamente efficiente transgene RNAi, volare croci puòessere mantenuta a 18 ° C per ridurre l'espressione del transgene e pupe trasferiti a 25 ° C a 0 ore APF. Per affrontare l'efficacia di RNAi espressione del transgene, trascrizione o proteine livelli dovrebbero essere valutati in fase pupe-abbinato con tecniche standard (ad esempio quantitativa-PCR, immunofluorescenza, immunoblotting).
Durante lo sviluppo larvale, i nuclei dei fotorecettori di ogni ommatidium vengono reclutati come un'onda che viaggia dal posteriore al lato anteriore del disco occhio 11. Questo gradiente di sviluppo è stata mantenuta negli occhi pupa. In effetti, quando ripreso a 22,5 ore APF, patterning di GMR-GAL4, UAS-DCR-2; UAS-α-cat: GFP, ubi-DE-Cad: GFP; + / SM5-TM6b retina era decisamente più maturo nella regione posteriore (Figura 2). Il fenotipo di queste retine era paragonabile a quella di ceppi fly wild-type (dati non mostrati). Tradizionalmente morfogenesi occhio pupa è descritto in base al tempo di sviluppo (ad esempio,hr APF). Tuttavia, a causa del gradiente di sviluppo pronunciato proponiamo descrivere patterning occhio secondo i seguenti eventi:
1 ° avvolgimento (Figura 2 e Movie 1): Inizialmente ben otto cellule direttamente in contatto con i fasci fotorecettori. Due cellule - di solito le cellule anteriore e posteriore - sono stati reclutati come primari (1 ° s). Questi 1s rapidamente circondato i fasci fotorecettori, collegando tra loro per formare giunzioni stabili. Cellule interommatidial indifferenziate (CI) contemplano in modo disorganizzato tra ciascuna classe ommatidial. Concomitante con 1 ° reclutamento cellulare, apoptosi potati circa il 5% del pool IC come descritto in precedenza (non annotati in Movie 1) 12.
IC intercalazione (Figura 2 e Movie 2): come il 1 ° s confezionati e sigillati su ogni fascio fotorecettori, ce localemovimenti ll riorganizzati gli integrati raggruppati ai lati dorsale e ventrale di ogni ommatidium. I circuiti integrati intercalate da più (di solito due) file in una sola riga. La posizione di destinazione di circuiti integrati in movimento potrebbe essere fiduciosamente previsto in tessuto tipo selvatico osservando la proiezione direzionale delle grandi "estensioni cellulari '. La crescita delle cellule 1 ° accompagnato e probabilmente ha contribuito a IC intercalazione 13. Molti CI continueranno a differenziarsi come cellule secondario (2 ° i) (non mostrate).
3 ° concorso (Figura 2 e Movie 3): A seguito di intercalazione, tre circuiti integrati a gara per occupare il terziario (3 °) di nicchia. In questa battaglia dinamico, le cellule spesso occupato il 3 ° posto adatto per un minimo di 5 a 10 minuti prima di essere spostato. Alla fine una singola cellula ha istituito una stabile 3 ° nicchia.
Potatura finale (Figura 2 e Movie 4)Un aumento di apoptosi 3,15-18 ridotto il numero di circuiti integrati al minimo necessario per generare in modo efficiente un pulito esagonale IC reticolo attraverso l'occhio composto di 5,14: tre 3 ° s e sei 2 ° s intorno ad ogni ommatidium. Come notato in precedenza, di solito tali CI eccesso giace più vicino alle setole sono stati eliminati per apoptosi 7. Abbiamo osservato cellule morte concomitante con IC intercalazione e 3 ° stabilimento di nicchia e proponiamo che la potatura delle cellule in eccesso contribuito l'efficienza di questi eventi. Inoltre, sottile riposizionamento di organuli setole è stata spesso osservata come circuiti integrati sono stati potati.
Figura 1:. Pupa dissezione e di imaging (A) L'opercolo viene rimosso da una pupa Drosophila (qui a 23 ore APF) per esporre la testa del unNimal. La linea tratteggiata rappresenta un pezzo di nastro biadesivo. (B) Illustrazione del semplice rig live-imaging. (C e D) con la testa esposta, la pupa è posizionato a circa 35 ° riposo sul tallone vaselina. (D) immagine di ingrandimento superiore di una pupa posizionata in cima al tallone vaselina. La posizione del vetrino e l'obiettivo sono illustrati (non in scala). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: un gradiente di sviluppo attraverso l'occhio di pupa. (A) Un unico immagine di un occhio pupa ripreso a 22,5 ore APF. Giunzioni adherens sono etichettati da DE-Cad: GFP e αCat: GFP. Regione Boxed è annotato in (C). (B) Illustrazioni di mid-stage e ommatidi completamente fantasia, a 24 e 41 ore rispettivamente APF. Due 1 ° s (blu) circondano un gruppo centrale di quattro coni (bianchi). Con 41 hr APF il patterning di cellule interommatidial (grigio chiaro) è completa: tre 3 ° s occupano i vertici alternativi e una piazza 2 ° forme ogni lato dell'esagono. Tre setola organuli (grigio scuro) circondano ogni ommatidium. (C) Annotazione di una piccola regione dell'occhio (da A). Due 1 ° cellule (esempi pseudo-color azzurro) si espandono per circondare ogni fascio fotorecettori. Circuiti integrati (verde, giallo, rosso e blu scuro) intercalate in singoli file. Ad ogni vertice alternativo tre celle competere (descritto in rosa) ad occupare il 3 ° di nicchia (di colore arancione). Vedere Movies 1-4 per osservare questi eventi dispiegarsi. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questo figure.
Figura 3:. Sintesi della procedura sperimentale Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Movie 1 :. avvolgimento primario 1 ° cellule vengono selezionati dal pool di cellule che circondano ogni ommatidium nascente. Come due 1 ° s circondano ogni ommatidium e collegare, giunzioni aderenti rapidamente forma (linee rosa). Le rette 1 °: 1 ° giunzioni cellulari espandono e 1 ° s cominciano a crescere, isolanti fotorecettori fasci dai circuiti integrati circostanti. Inizialmente i fotorecettori bagliore luminoso, denso GFP marcatura elaborati giunzioni adherens. Morfologica cambia gradoppiamente disegnare queste giunzioni fotorecettori di sotto del piano di imaging e giunzioni a forma di X tra ogni serie di quattro coni apicali cima ogni ommatidium diventata più chiara. Immagini originali su di sinistra; pseudo-colorazione e annotazioni introdotte in pannelli a destra. Eye ripreso da 21 hr APF.
Movie 2 :. intercalaction cell Interommatidial Le cellule interommatidial (CI) evidenziata in rosso, blu, giallo e verde inizialmente formare un quadrante che separa una dorsale (in alto) e ventrale (basso) ommatidium da una distanza di due celle. I circuiti integrati rossi e gialli allungano ventrale e dorsale, rispettivamente (da t = 42 min), il contatto con l'obiettivo 1 ° s da 56 min. I circuiti integrati blu e verde in modo simile si estendono a bersaglio ommatidium opposto. 'Nuovi' 1 °: incroci IC rapidamente espandere lateralmente. Al 112 min quadrante originale di circuiti integrati ha pienamente intercalate a generate una sola fila di celle. Immagini originali su di sinistra; pseudo-colorazione e annotazioni introdotte in pannelli a destra. Eye ripreso da 23 hr APF.
Movie 3 :. concorrenza Terziario A vertici si alternano due o tre celle (descritto in rosa) competono per occupare la nicchia 3 °. Apparendo a 'spingere' i loro vicini a parte, le cellule producono grandi estensioni che raggiungono verso ommatidi opposto. Occupando il 3 ° di nicchia (di colore arancione) è spesso fugace e cellule sia ritrattare o sono spinto fuori posizione dai loro vicini. Entro la fine di questo 217 min di film, molti 3 ° nicchie appaiono stabiliti. Immagini originali su di sinistra; pseudo-colorazione e annotazioni introdotte in pannelli a destra. Eye ripreso da 23 hr APF.
Momentovie. 4: finale potatura celle nelle vicinanze di organuli setole vengono rimossi per apoptosi. Gli esempi sono evidenziati in viola, rosso, giallo e blu. Nel corso delle immagini, rimozione delle cellule lasciato solo una 2 ° lungo ciascun braccio orizzontale dell'esagono IC. La potatura delle cellule in eccesso sui lati diagonali dell'esagono IC non è stato catturato in questo film. In questo genotipo erano spesso osservati piccoli errori nel posizionamento dei gruppi di setole (confrontare con la Figura 2B). Due dei tre gruppi di setola manovrato in nicchie d'angolo durante l'imaging: riposizionamento sembrava essere facilitato dalla rimozione e il movimento di circuiti integrati vicini. Immagini originali su di sinistra; pseudo-colorazione e annotazioni introdotte in pannelli a destra. Eye ripreso da 26 hr APF.
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Discussion
La descrizione di wild-type sviluppo (sopra) costituisce la base per il confronto di eventi patterning in RNAi o genotipi iperespressione. Confronti di sviluppo del tessuto vivo hanno un valore inestimabile per determinare con precisione quali comportamenti cellulari sono regolati da una proteina di interesse. Inoltre, e non qui descritte, l'imaging cellulare dal vivo permette di fare descrizioni qualitative e / o quantitative del ruolo di un gene di interesse negli eventi che motivo l'occhio. In 30-32 ore APF maggior parte delle cellule del pigmento hanno acquisito posizioni stabili e apoptosi ha potato le cellule in eccesso dal campo della retina. A seguito di questo, solo piccoli cambiamenti sono stati osservati in cellule del pigmento adottano le loro forme caratteristiche: il 3 ° S diventano esagonale e, come 1 ° s sottilmente espandere, la larghezza dei vicini rettangolari 2 ° cellule diminuisce. Generazione successiva di pigmento e materiale ottico probabilmente ostacola con successo l'imaging di giunzioni aderenti.
Anche se una valstrategia uable, diverse insidie deve essere tenuto presente quando l'imaging l'occhio pupa vivo. In primo luogo, rimuovere la custodia pupa anteriore rende l'animale particolarmente vulnerabili a disidratazione, il surriscaldamento, e lesioni durante il montaggio e l'imaging. Insulti come questi possono confondere i dati inducendo lo sviluppo del tessuto atipico che non è rilevante per il genotipo in esame. In secondo luogo, il protocollo qui descritto richiede che un vetrino di vetro entrare in contatto diretto con la testa epitelio pupa. Abbiamo osservato che lo sviluppo della retina bancarelle se eccessiva pressione viene applicata quando si spinge il vetrino contro l'occhio. Infatti esogeno forze meccaniche sono state esposte in altri sistemi di influenzare i processi di sviluppo tra cui l'architettura tissutale 19,20. Per questi motivi è importante posizionare molto delicatamente il vetrino contro l'occhio. Inoltre, pupe ripreso deve essere salvato dalla piattaforma di imaging e ha permesso di emergere come gli adulti: artefatti introdotti durante l'imaging in grado dispesso essere rilevata confrontando l'occhio imaged di questi adulti con gli occhi di mosche pari età della croce originale. Inoltre, i dati provenienti da più sessioni di imaging devono essere confrontati per verificare comportamenti delle cellule. Infine, immunofluorescenza standard deve essere utilizzata per determinare se la disposizione, dimensione e numero di cellule in fase tessuti accoppiati sono uguali.
Ectopica DCR-2 è spesso utilizzato per migliorare l'efficacia di RNAi. Tuttavia, in presenza di ectopica DCR-2, IC intercalazione, stabilizzazione della nicchia e apoptosi 3 ° state occasionalmente interrotto (dati non mostrati). Così Dcr-2 deve essere usato con cautela.
Il protocollo descritto qui utilizza GFP all'etichetta giunzioni aderenti e valutare morfogenesi delle cellule del pigmento negli occhi pupa. Questa strategia potrebbe essere facilmente modificato per altri scopi (ad esempio, per valutare fotorecettori morfogenesi). Per un approccio a doppia etichettatura, ulteriore UATransgeni S che etichettano gli altri componenti cellulari di interesse (ad esempio vescicole segretaria, reticolo endoplasmatico, nucleo) con tag non GFP potrebbero essere incorporati. Tuttavia l'intensità e la longevità di questi transgeni richiederanno valutazione: RFP, DsRed e mCherry, per esempio, hanno dimostrato di essere le etichette poveri per l'imaging l'occhio pupa per i periodi prolungati necessarie per catturare patterning cellule del pigmento (dati non riportati). Se indagare comportamenti cellulari veloci (ad esempio, secrezione) il protocollo qui descritto potrebbe essere facilmente modificato per microscopia confocale di proteine fluorescenti idonei.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GMR-GAL4; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP ; + / SM5-TM6b | Available on request from authors | ||
| UAS-dcr-2; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP; + / SM5-TM6b | Available on request from authors | ||
| Scotch double stick tape | 3M | 665 | |
| Black Sylgard dissection dish | Fill glass petri dish to rim with Sylgard (colored black with finely-ground charcoal powder) or Sylgard 170; leave at room temperature for 24-48 hr to polymerize | ||
| Sylgard | Dow Corning | SYLG184 | |
| Sylgard (Black) | Dow Corning | SYLG170 | |
| Glass petri dish | Corning | 7220-85 | |
| 25 x 75 x 1 mm glass microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-413 | |
| 22 x 40 mm glass coverslip | VWR | 48393-172 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Whatman 3mm Chromatography Paper | Fisher Scientific | 05-713-336 | |
| Vaseline | Fisher Scientific | 19-086-291 | Or purchase at local pharmacy. |
| 30 ml syringe | Fisher Scientific | S7510-30 | |
| Leica TCS SP5 DM microscope | Leica Microsystems | ||
| LAS AF Version 2.6.0.7266 microscope software | Leica Microsystems |
References
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