Summary
Из-за резкого и отрицательной связи между ожирением и другими сопутствующими заболеваниями, исследование о роли жировой играет в болезни и общее состояние здоровья является оправданным. Мы приводим протокол для выделения и удаления жировых депо, позволяющих проводить исследования жировой помощью на месте и в лабораторных методов.
Introduction
Жировая внесли заметный внешний вид в центре внимания средств массовой информации, в связи с резким увеличением ожирения в течение последних нескольких десятилетий 20-го века. Ожирение в настоящее время затрагивает более чем одну треть взрослых и 17% детей и подростков в Соединенных Штатах Америки (США) 1. Spanning всех этнических групп, статистическое исследование вокруг эпидемии ожирения показали, что не испаноязычные чернокожие имеют самый высокий уровень с поправкой на возраст ожирения (49,5%) по сравнению с американцев мексиканского происхождения (40,4%), все выходцы из Латинской Америки (39,1%), и не- Испанец белые (34,3%) 2. Экономический эффект ожирения также растущее беспокойство для системы здравоохранения. В 2012 году было подсчитано, что ежегодные медицинские затраты на лечение от ожирения в США в 2005 составил $ 190,2, почти 21% от общего медицинского расходов бюджета. К сожалению, детское ожирение, по оценкам, будет отвечать за $ 14 млрд в прямые медицинские расходы в одиночку. Статистически, было установлено, что в среднем медицинской стоимостилюди с ожирением составила $ 2741 выше году, чем те, без этого заболеваемости 3-5.
Ожирение является основным фактором риска для различных условий, таких как: сахарный диабет типа 2, дислипидемии, сердечно-сосудистых заболеваний, рака, мышечных скелетных расстройств и хронического воспаления. Ожирение глубоко связаны с патогенезом метаболического синдрома и других хронических заболеваний 6-8. С таким решительным и отрицательных связей между ожирением и другими сопутствующими заболеваниями, научные исследования обратили внимание, чтобы лучше понять текущей эпидемии и разнообразные и основные роли, которую играют жировой.
Исторически сложилось так, жировой ткани считалось несущественным, и рассматривалось просто как простой заполнения ткани. В настоящее время, жировая как было показано, играют многие важные роли в функции организма в: обмена веществ, гормональной регуляции, воспаление, защиты и изоляции 9. Жировая ткань состоит в основном изадипоциты, но также содержит перицитов, эндотелиальные клетки, моноциты, макрофаги и плюрипотентных стволовых клеток 8. Жировая ткань распределяется по всему телу в разных депо. Основные депо могут быть найдены подкожно, подкожно, внутримышечно и интуитивно 10. Жировые депо, как было показано, чтобы иметь депо конкретные метаболические профили, которые показали депо конкретную восприимчивость к ожирению расстройств, связанных и 8.
Традиционно, жировая ткань была классифицирована на два основных типа: белая жировая ткань (WAT) и бурая жировая ткань (BAT); хотя в последнее время литература указывает Присутствия третьей группы окрестили Brite или бежевый жировой 11. Жировая ткань как было показано, имеют различные цвета, морфологию, метаболические функции, биохимические свойства и генетические паттерны экспрессии 10. Адипоциты в Ват есть один большой липидов капли и различное количество митохондрий. WATв преимущественно находятся в подкожной и висцеральной местах тела. WAT функционирует в первую очередь как место хранения энергии и защиты органа. Адипоциты в городе Бат есть многоячеистую морфологию и обильные митохондрии. ВАТ расположен в основном в области шеи и крупных кровеносных сосудов грудной клетки, а также лопатками 12. BAT в первую очередь функции в энергетических расходовать поведения, которые регулируют термогенез 7. Brite или бежевого жировая было показано, что разделяют аналогичную морфологии и экспрессии на биту, но было установлено, что возник из белых адипоцитов 11.
Описаны хирургический метод в этой рукописи предоставляет исследователям с возможностью анализировать различные эффекты, что такие факторы, как: окружающая среда, фармацевтика, и генетики, имеющие на жировой; а также выгодно или вредно роль жировой играет в болезни и общего состояния здоровья. Кроме того, предоставляя возможность для идентификации и выделения различных типов жировой тканипозволяют лучше понять биохимические отношений и различий между депо. Это может помочь в определении отношения между местоположением, функции и виды жира в организме. Описанный метод решает эту задачу, обеспечивая средства для валового визуализации, анализа экспрессии генов, анализа экспрессии белка, гистологического исследования и изоляции линий первичных клеточных для изучения в лабораторных условиях. В настоящее время существует много статей, которые дают представление о метаболической поведения различных жировых депо, а также их анатомических местах; но не предоставляют метод углубленного о том, как конкретно локализовать, идентифицировать и изолировать эти склады. Это хирургический метод обеспечивает точное метод, который позволяет для выделения нескольких депо с минимальным количеством вскрытия и загрязнение по сравнению с другими методами, предназначенных для изолята из одного или двух депо 13-14.
Цель этого протокола заключается в обеспеченииточный метод для выявления и изоляции различных типов жировых депо из нескольких анатомических мест.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры на животных были проведены с одобрения уходу и использованию комитета Институциональная животных (IACUC) из Университета Цинциннати и в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных от Национальных Институтов Здоровья (NIH Издание № . 85-23, пересмотренное в 1996 г.).
1. Эвтаназии и стерилизовать мыши
- Наведите в раздаточной коробке, содержащей supratheraputic дозу ИФ и позволяют вдыхать эффект. После того, как мышь эвтаназии, снять с коробки.
- Цервикально вывихнуть в качестве второго средства эвтаназии.
- Стерилизация внешней поверхности мыши, очищая животное с 70% этанола.
2. Выявление и изоляция трех различных жировой депо
- Бурая жировая ткань (BAT) Изоляция:
- Убедитесь, что мех мокрые от чистки алкоголя, чтобы помочь в проходящем через эпидермальный и дермальный ЛеRS.
- Наведите указатель мыши в лежачем положении с его спиной к столу.
- Возьмите кожу чуть ниже диафрагмы щипцами, лифт и надрезать ножницами.
- Вырезать поперек по окружности мыши, чтобы выставить брюшины.
- Выявить в форме бабочки BAT депо по degloving верхнюю половину мыши. Удерживайте нижнюю придатки и живота в одной руке и вытягивать кожу вверх, к голове.
- Ориентируйте мыши, таким образом, что он расположен склонны на столе. Будьте осторожны, чтобы не загрязнять подвергаются депо с волосами.
- Чистые хирургические инструменты и изменения в новую пару перчаток.
- Найдите лопатки и соответствующий склад. Осторожно удалите поверхностную белой жировой вершине бабочки, а затем рассекают бабочку межлопаточной бурого жира. Будьте осторожны, чтобы избежать мышцы тесно связана с бурого жира.
ПРИМЕЧАНИЕ: использование рассечение микроскопом рекомендуется для удаления WХайт жировая, а также в разделении бурой жировой от лопатками. - Удалить жировые депо и перенести в 2 мл микроцентрифужных трубки.
- Если РНК или белок должны быть извлечены, заморозить ткань погружением в жидкий азот и хранить при -80 ° С. Замораживание образца сразу, чтобы предотвратить деградацию. Если культивирования, покрывают ткань в DMEF-12 и установить на льду, пока все образцы собираются в культуре (дополнительного информации).
- Выделение подкожной жировой ткани (SQ), белой жировой ткани Depot (WAT):
- Положите на новую пару перчаток, чтобы не заражать между жировых депо.
- Выявить паховые, треугольные SQ склады де-перчаток нижнюю половину мыши. Держите верхний придатки и грудной клетки в одной руке и вытягивать кожу вниз, к ногам с другой стороны.
- Расположите курсор в положении лежа на спине, стараясь при этом, чтобы не загрязнить подвергаются депо с волосами.
- Чистый surgicaл инструменты и поменять на новую пару перчаток.
- Осторожно рассекают треугольники SQ жира. Будьте осторожны, чтобы не загрязнить образец с мышц, соседние жира, молочных желез или резки любые суда и загрязнять образец с кровью.
ПРИМЕЧАНИЕ: использование рассечение микроскопом рекомендуется, если границы четко не определены. - Удалить жировые отложения и трансфер в 2 мл микропробирок.
- Если РНК или белок должны быть извлечены, заморозить ткань погружением в жидкий азот и хранить при -80 ° С. Замораживание образца сразу, чтобы предотвратить деградацию.
- Для окрашивания исправить или вставлять в октябре Если культивирования, покрывают ткань в DMEF-12 и установить на льду, пока все образцы собираются в культуре (дополнительного информации).
- Выделение половых желез жира висцеральной жировой ткани (НДС) и белой жировой ткани (WAT) Depot:
- Положите на новую пару перчаток, чтобы не заражать между жировых депо.
- С научноssors, вырезать брюшины в поперечном направлении, непосредственно под диафрагмой. Вырезать брюшины от диафрагмы до прямой кишки середине коронки, чтобы разоблачить органов брюшной полости.
- Найдите яички или яичники и определить прилагаемый белой жировой ткани, известный как придатка жировой у мужчин или половых жировой у женщин.
- Чистые хирургические инструменты и изменения к свежим пару перчаток
- Осторожно рассекают как придатка яичка жировые отложения из яичек, придатков и семявыносящих протоков. Или если женщина, тщательно анализировать как гонадных жировые из яичников.
- Удалить жировые отложения и передавать их на 2 мл микропробирок.
- Если РНК или белок должны быть извлечены, заморозить ткань погружением в жидкий азот и хранить при -80 ° С. Замораживание образца сразу, чтобы предотвратить деградацию.
- Для окрашивания исправить или вставлять в октябре Если культивирования, покрывают ткань в DMEF-12 и установить на льду, пока все образцы собираются в культуре (дополнительного информации).
3. Выделение Периваскулярный жировой ткани (PVAT)
- Выделение сердца:
- Положите мышь в положении лежа на спине с верхней и нижней конечностей, предоставленных наружу.
- Безопасные придатки с помощью хирургической лентой.
- После размещения мыши, как указано выше, создают напряженность, поднимая мечевидного отростка с щипцами. Вырезать горизонтально через мембрану, подвергая нижнюю часть грудной полости.
- Сохраняя напряжение, поднимая на мечевидного отростка, прорезать грудной клетки сверху к голове, только в сторону грудины.
- Поднимите грудную клетку только, ниже ключицы, и разрезать вдоль нижней длины ключицы из к подмышечной впадине в обоих направлениях. Грудной полости и его содержимое (сердце, легкие и т.д.) теперь должны быть четко видны.
- Очистите грудной полости постороннего крови и жидкости с помощью стерильного гаUZE поглощать жидкость. Если сбор органов или судов убедитесь, что обильная (дополнительный данные).
- После того, как область очищены от жидкости, разрезать бронхов и присоединение сосуды, чтобы удалить легкие, что позволяет лучше воздействие на сердце.
- Локализация и Удаление аорты Периваскулярный жировой ткани (PVAT):
- Удалите следующие органы, чтобы лучше определить низшие части аорты: печень, желудок, селезенка, поджелудочная железа, кишечник и толстой кишки.
- Начать с идентификации желудка и пищевода. Вырезать пищевода при желудочно-пищеводного перехода, чтобы освободить желудок от тела.
- Затем определите кишечника и окружающий брыжейки. Вырезать поверхностно через брыжейки, как он лежит очень близко к почечной части аорты, затем "работать кишечник."
- Вырезать толстой кишки освободить как можно ближе к прямой кишке, как это возможно. Таким образом, освобождение желудка, кишечника и толстой кишки с помощью мыши.
- Репереместить желудка, кишечника, толстой кишки, поджелудочной железы и селезенки путем перерезания примыкающим брыжейки и сосудов. Поджелудочная железа и селезенка должны прийти бесплатно с желудка, кишечника и толстой кишки.
- Удалить печени путем перерезания печеночных вен и присоединение брыжейки, удалите все лепестки.
- Срежьте висцерального слой и жир окружает почки. Оставьте почки, прикрепленные к аорте в естественных условиях в качестве географических маркеров для различных сегментов аорты.
- Промыть области с стерильной 1x PBS и удалить всю жидкость за счет поглощения с стерильную марлю.
- Использование микро-ножницы и микро-щипцы, разделите аорты от ее привязанности спинной к позвоночнику и его вентральной привязанности к пищевода.
- Изолировать аорты, следуя и снятие аорты длину нисходящей аорты от происхождения в центре бифуркации в подвздошной области.
- Идентифицировать и изолировать подключичной сосуды. Изолировать эти судаот шеи до корня аорты лучше выставить аорты переход и корень в сердце.
- Удалить тимус затем вырезать брахиоцефальных артерий, левой общей сонной артерии, и левой подключичной артерии, позволяя при этом движение сердца.
- С помощью рассечения микроскопом, просмотр периваскулярной жировой ткани (PVAT) слой, окружающий аорты.
- Принимая большую осторожность, чтобы не прищемить или выжать PVAT, осторожно потяните PVAT путь от аорты с микро-щипцами. Осторожно разрезать прикрепление PVAT в аорте с микро-ножниц, начиная с грудного отдела просто превосходной, где диафрагма расположена.
ПРИМЕЧАНИЕ: рассечение микроскоп рекомендуется. - Повторите эту процедуру на всю длину аорты, заканчивая инфраренальной аорты области, который находится всего выше подвздошной бифуркации аорты судна.
- Если дуга аорты PVAT желательно, использовали тот же метод для удаления PVAT от меньшей Curvature арки.
- Поместите образцы PVAT в 2 мл микроцентрифужных трубки (ов).
- Если РНК или белок должны быть извлечены, заморозить ткань погружением в жидкий азот и хранить при -80 ° С. Замораживание образца сразу, чтобы предотвратить деградацию. Если культивирования, покрывают ткань в DMEF-12 и установить на льду, пока все образцы собираются в культуре (дополнительного информации).
ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительные склады жировой рассмотреть, если заинтересованы в комплексном анализе жировой депо включают в себя: забрюшинных, брыжеечных, сальника, перикарда и подколенных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Идентификация и локализация паховой подкожной жировой, межлопаточной бурой жировой, висцеральной придатка жировой (рисунок 1), а также дуги аорты периваскулярной жировой, грудного отдела аорты жировой, надпочечников аорты жировой и инфраренальной аорты жировой (Рисунок 2) была достигнута успешно используют описаны хирургический метод. Гистологическое исследование и дифференциация между НИМ и Ват образцов были положительно оценены с использованием гематоксилином и эозином (H & E) окрашиванием (рис 3). Анализ уровней адипонектина РНК (AdipoQ), активатора пролиферации пероксисом гамма-рецептор (PPAR-γ), гибель клеток, индуцирующего DFFA-эффектора, как (CIDEA), и другие жиры специфических маркеров были измерены для всех вышеуказанных выделенных и вырезанных депо (данные не показаны).
Первичные клеточные линии подкожных жировых клеток и периваскулярных адипоцитов культивировали и отличается от преадипоцитов с в адипоциты успешно для анализа микрочипов. Культивируемые преадипоциты преобразованы в адипоциты были подтверждены Нефть Red O окрашивания (рис 4). Успешное изоляция, культура и дифференцировку адипоцитов была достигнута для использования в исследованиях в пробирке, и активность белка был успешно измерены. Ферментативной активности матричной metaloprotease-2 (MMP2) была измерена в группе лечения по сравнению с контролем. Деятельность ММР2 измеряли на месте в первичной периваскулярной адипоцитов линии с помощью зимографии (рисунок 5).
Рисунок 1. Анатомические расположение C57BL / 6 самца мыши жировых депо. () Межлопаточной бурой жировой жировых депо. (B) Паховая подкожной жировой жировых депо. (C) Visceral придатка жировой жировых депо.w.jove.com/files/ftp_upload/52174/52174fig1highres.jpg "TARGET =" _ пустое "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 2. Анатомические расположение PVAT складах в самца мыши C57BL / 6. () Дуга аорты периваскулярное жировой депо. (B) грудного отдела аорты периваскулярное жировой депо. (C) надпочечников аорты периваскулярное жировой депо. (D) ИНФРАРЕНАЛЬНОГО аорты периваскулярное жировой депо. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 3. H & E окрашивание НИМ и WAT жировой. (А) Н 8; E окрашивание параформальдегиде парафиновых C57BL / 6 мужских образец мышь WAT жировой при увеличении 40Х (B) H & E окрашивание параформальдегиде парафиновых C57BL / 6 мужских образец мыши НИМ при увеличении 40Х.. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 4. Нефть Red O окрашивание культивируемых PVAT преадипоцитов и адипоциты. (А) Масло Красный вывода окрашивание культивируемых аортальных околососудистых преадипоцитов исходно дифференциации в 20Х увеличении с фазовым контрастом. (В) Масло Красный вывода окрашивание культивируемых адипоцитов аорты околососудистых после 5 дней дифференциации в 20Х увеличении с фазовым контрастом.ES / ftp_upload / 52174 / 52174fig3highres.jpg "TARGET =" _ пустое "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 5. зимографии дифференцированных адипоцитов, выделенных из жировой ткани периваскулярного, продемонстрировали снижение активности MMP2 после очистки по сравнению с необработанных (контрольных) клеток, * p <0,01 по сравнению с контролем.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ожирение может привести к большому целому ряду заболеваний и полном понимании той роли, которую жировой играет до конца не изучен; Поэтому продолжение исследований в области жировой необходимо. Модели на животных, в частности, мышиные модели идеально подходят для начального исследования в прогрессии заболевания и тестирования потенциальных фармацевтических процедур. При использовании этих моделей, точное выделение и иссечение жировых депо является чрезвычайно важным и необходимым инструментом при изучении патологии жировых влияние заболеваний.
В современной литературе о жировых депо, есть значительное количество литературы по метаболической поведения и различия между жировой складах, а также их анатомических местах. Тем не менее, есть несколько, которые предоставляют метод углубленного о том, как конкретно локализовать, идентифицировать и изолировать эти склады. На основании обзора существующих методов изоляции жировой, есть небольшое подмножество протоколов Tшлем обеспечить методику, как для выделения одного или двух депо за один раз. Тем не менее, точное метод, который позволяет для выделения нескольких депо с минимальным количеством вскрытия и загрязнения, а также рассматриваются различные методы изучения образцов, собранных является отличительным в этом протоколе 13-14.
В этой методике, есть несколько шагов, которые жизненно важны для выделения и чистоту образца. Очистка инструментов, перчатки и поверхности часто для удаления волос и загрязняющих веществ является обязательным шагом на пути к предотвращения загрязнения депо. При резке кожу поперек по окружности мыши, чтобы разоблачить брюшины для degloving, жизненно важно, чтобы избежать сокращения слишком глубоко. Резка брюшины сделает degloving очень трудно и повысит потенциал для загрязнения образца. Когда иссечения SQ жировой склады важно определить треугольные границы депо до иссечения любой из объявлениемipose. Кроме того, тщательные сокращения должны быть сделаны, чтобы избежать мышцы, и рядом сосуды, железы и жировой. Это позволит предотвратить загрязнение образца от альтернативного жировой, железистой ткани, мышцы или крови.
Основным ограничением для изоляции и удаления жировых депо, в этом способе и других аналогичных методов можно найти в Определение границ некоторых депо. Из-за нечетко определенных границ в депо, например, подкожных депо, изоляция не хватает небольшое количество загрязнения из соседнего жировой может быть сложной задачей. Другим ограничением могут быть найдены в обеспечении достаточно ткани собирают для дополнительного эксперимента в сосудистых связаны депо. Это ограничение иногда требуется объединение образцов, хотя это зависит от места выделения и диеты, связанного с животным.
После того, как жировые депо изолированы, они могут быть использованы для различных анализов. Жировая может быть использованиед для молекулярных исследований, таких как экспрессии белка, ферментативной активности и анализа экспрессии генов. Кроме того, можно выделить адипоциты для линии первичной ячейки в пробирке исследования. Иммортализованных клеток линии также могут быть использованы для исследований в пробирке, однако бессмертные клетки не заслуживающими доверия в качестве первичных клеточных линий изолированных. И, наконец, жировая может быть фиксированной или замораживают в октябре для гистологического исследования, чтобы определить инфильтрацию лейкоцитов, локализацию белка, а также характеристику адипоцитов морфологию.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Med-Vet International | #RXISO-250 | |
| 70% Ethanol | Fisher | 07-678-001 | |
| DMEF-12 | Sigma Aldrich | D-6421 | Warm in waterbath before putting on tissue. |
| 2 ml Microcentrifuge tubes | Midsci | MCT-200-C-S | |
| Phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P5368-10PAK |
References
- Ogden, C. L., Carroll, M. D., Kit, B. K., Flegal, K. M. Prevalence of obesity in the United States, 2009-2010. NCHS Data Brief. 82, 1-8 (2012).
- Flegal, K. M., Carroll, M. D., Kit, B. K., Ogden, C. L. Prevalence of obesity and trends in the distribution of body mass index among US adults, 1999-2010. 307 (5), 491-497 (2012).
- Cawley, J., Meyerhoefer, C. The medical care costs of obesity: an instrumental variables approach. Journal of Health Economics. 31 (1), 219-230 (2012).
- Obesity accounts for 21 percent of U.S. health care costs, study finds. , Cornell University. Available from: http://www.sciencedaily.com/releases/2012/04/120409103247.htm (2012).
- Marder, W., Chang, S. Childhood Obesity: Costs, Treatment Patterns, Disparities in Care, and Prevalent Medical Conditions. Thomson Medstat Research Brief. , (2006).
- Cortez, M., Carmo, L. S., Rogero, M. M., Borelli, P., Fock, R. A. A high-fat diet increases IL-1, IL-6, and TNF-α production by increasing NF-κB and attenuating PPAR-γ expression in bone marrow mesenchymal stem cells. Inflammation. 36 (2), 379-386 (2013).
- Sanchez-Gurmaches, J., Hung, C. M., Sparks, C. A., Tang, Y., Li, H., Guertin, D. A. PTEN loss in the Myf5 lineage redistributes body fat and reveals subsets of white adipocytes that arise from Myf5 precursors. Cell Metab. 16 (3), 348-362 (2012).
- Sethi, J. K., Vidal-Puig, A. J. Thematic review series: adipocyte biology. Adipose tissue function and plasticity orchestrate nutritional adaptation. J Lipid Res. 48 (6), 1253-1262 (2007).
- Aarsland, A., Chinkes, D., Wolfe, R. R. Hepatic and whole-body fat synthesis in humans during carbohydrate overfeeding. Am J Clin Nutr. 65 (6), 1774-1782 (1997).
- Park, A., Kim, W. K., Bae, K. H. Distinction of white, beige and brown adipocytes derived from mesenchymal stem cells. World J. Stem Cells. 6 (1), 33-42 (2014).
- Wu, J., et al. Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and. 150 (2), 366-376 (2012).
- Giralt, M., Villarroya, F. White, brown, beige/brite: different adipose cells for different functions. Endocrinology. 154 (9), 2992-3000 (2013).
- Casteilla, L., Pénicaud, L., Cousin, B., Calise, D. Choosing an adipose tissue depot for sampling: factors in selection and depot specificity. Methods Mol. Biol. 456, 23-38 (2008).
- Grant, R., Youm, Y. H., Ravussin, A., Dixit, V. D. Quantification of adipose tissue leukocytosis in obesity. Methods Mol. Biol. 1040, 195-209 (2013).
