Summary
原因肥満や他の併存疾患の間で抜本的なと負の接続に、ロールの脂肪の研究は、病気で再生し、全体的な健康が保証されています。私たちは、 その場で、そしてインビトロ方法で使用して脂肪の研究を可能に脂肪デポの単離および切除するためのプロトコルを提示する。
Introduction
脂肪は、20世紀の最後の数十年の間、肥満の劇的な増加に起因するメディアのスポットライトで注目すべきな外観を作った。肥満は現在、成人の三分の一以上と米国の小児および青年の17％（米国）1に影響を与えます。すべての民族グループにまたがる、肥満のまん延を取り巻く統計調査は、メキシコ系アメリカ人（40.4％）、すべてのヒスパニック（39.1％）、及び非と比較して非ヒスパニック系黒人は肥満（49.5％）の最高年齢調整率を持っていることが示されているヒスパニック系白人（34.3％）2。肥満の経済効果も医療制度への高まる懸念である。 2012年では、2005年の米国における肥満のためのケアの年間医療費は1902億ドル、全体の医療費の予算の約21％と推定された。悲しいことに、小児肥満は単独で、直接医療費140億ドルの原因であると推定された。統計的に、それは、平均医療費が決定された肥満を持つ個人は、この罹患率3-5ないものより年間2741ドル高かった。
2型糖尿病、脂質異常症、心血管疾患、癌、筋骨格障害および慢性炎症：肥満のような、様々な条件のための主要な危険因子である。肥満は深くメタボリックシンドロームと他の慢性疾患6-8の病因に関連付けられています。肥満や他の併存疾患との間のこのような抜本的なと負の接続では、科学的研究は、より良い現在の流行と脂肪で演奏多様で重要な役割を理解するために注意を集中している。
歴史的に、脂肪組織は取るに足らないと考えられていたとシンプルな充填組織としてのみ観察した。代謝、ホルモン調節、炎症、保護絶縁9：現在、脂肪は、身体の機能の多くの重要な役割を果たしていることが示されている。脂肪組織は、主に構成されている脂肪細胞だけでなく、周皮細胞、内皮細胞、単球、マクロファージおよび多能性幹細胞8が含まれています。脂肪組織は、個別のデポで体全体に分布している。主なデポは皮下、筋肉内、皮下発見し、直感的に10することができます。脂肪デポは、肥満症および関連障害8にデポ特定の感受性を示したデポ特定の代謝プロファイルを有することが示されている。
伝統的に、脂肪組織は、2つの主要なタイプに分類された：白色脂肪組織（WAT）および褐色脂肪組織（BAT）。最近の文献が示すものの、第3グループのプレゼンスは、ブライトまたはベージュ脂肪11洗礼 。脂肪組織は、異なる色、形態、代謝機能、生化学的特徴および表現10の遺伝的パターンを有することが示されている。 WATでの脂肪細胞は、単一の大きな脂肪滴とミトコンドリアの可変量を持っている。 WAT支配的身体の皮下および内臓の地域に含まれています。主に、エネルギー貯蔵および器官保護の部位としてWAT機能する。 BATでの脂肪細胞は多房形態と豊富なミトコンドリアを持っている。 BATは、胸部の首および大血管、ならびに肩甲骨12に主に位置している。熱発生7を制御するエネルギー消費する行動のBATは主に機能している。ブライトまたはベージュ脂肪は、BATと類似の形態および表現を共有することが示されているが、白色脂肪細胞11から発信されることが見出されている。
この原稿で説明した外科的方法は、以下のような要因に、異なる効果を分析する能力と研究者を提供します。環境、医薬品、遺伝学は、脂肪に持っている。だけでなく、有益なまたは有害な役割の脂肪は、病気と全体的な健康状態で再生されます。また、への脂肪組織の異なる種類を同定および単離するための方法を提供より良いデポ間の生化学的関係との違いの理解を可能にします。これは、場所、機能、および身体内の脂肪のタイプ間の関係を決定するのを助けることができる。この記載の方法は、総視覚化、遺伝子発現解析、タンパク質発現解析、組織学的検査、およびin vitro試験のための主要な細胞株を単離するための手段を提供することによって、これを達成する。現在、別の脂肪デポ、並びにそれらの解剖学的位置の代謝挙動への洞察を提供する多くの記事があります。しかし具体的には、ローカライズ特定し、これらのデポを分離する方法についての詳細な方法を提供しない。この外科的方法は、1つまたは2つのデポ13~14の単離物のために設計され、他の方法と比較して切開および汚染の最小量を有する複数のデポの単離を可能にする正確な技術を提供する。
このプロトコルの目的は、提供することである複数の解剖学的位置から貯蔵脂肪の異なるタイプの同定および単離のための正確な方法。
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Protocol
注：すべての動物の手順はシンシナティ大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）の承認を得て、および国立衛生研究所から実験動物の管理と使用に関する指針に従って行った（NIH公開番号。85から23、）1996年改訂。
1.マウスを安楽死させると滅菌
- イソフルランのsupratheraputic投与量を含むドロップボックスにマウスを置き、効果に吸い込むことができます。マウスを安楽死された後、箱から取り出します。
- Cervically安楽死の第二の手段として脱臼。
- 70％エタノールで動物を洗浄することにより、マウスの外面を滅菌する。
2.識別3つの異なる脂肪デポの単離
- 褐色脂肪組織（BAT）単離：
- 表皮と真皮のレーを切断を支援するために、アルコールクレンジングから毛皮が濡れていることを確認してくださいRS。
- テーブルに対するその背中に仰臥位でマウスを置きます。
- ちょうど鉗子、リフト付きダイアフラム下の皮膚をつかみ、ハサミで切開。
- 腹膜を露出させ、マウスの周囲に横方向に切断。
- マウスの上半分をdeglovingことで蝶形のBATデポを明らかにする。片手で下の付属と腹部を押さえ、頭の方に肌を引き上げる。
- それはテーブルの上に発生しやすい位置するように、マウスの向き。髪で露光デポを汚染しないように注意してください。
- 手術器具を清掃し、手袋の新鮮なペアに変更します。
- 肩甲骨とそれに対応するデポの位置を確認します。慎重に蝶の上の任意の表面的な白色脂肪を削除してから間褐色脂肪の蝶を解剖。密接に褐色脂肪に関連した筋肉を避けるように注意してください。
注：解剖顕微鏡の使用は、Wの除去のために推奨されますハイト脂肪、ならびに肩甲骨から褐色脂肪の分離。 - 脂肪デポを削除し、2ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移す。
- RNA又はタンパク質が抽出される場合、-80℃の液体窒素とストアに浸漬することにより、組織を凍結する。劣化を防ぐために、一度にサンプルをフリーズします。培養の場合は、DMEF-12で組織をカバーし、すべてのサンプルが培養（補足情報）のために収集されてまで、氷上に設定してください。
- 皮下脂肪組織（SQ）の単離、白色脂肪組織デポ（WAT）：
- 脂肪デポ間のクロス汚染しないよう手袋の新鮮なペアに置く。
- マウスの下半分をデglovingにより鼠径部、三角SQデポを明らかにした。片手で上部の付属と胸部を持ち、もう一方の手で足の方に肌をプルダウンする。
- 髪で露光デポを汚染しないように注意しながら仰臥位でマウスを向けます。
- クリーンsurgicaLの楽器や手袋のフレッシュに変更します。
- 慎重にSQ脂肪の三角形を解剖。すべての血管を切断することによって、脂肪、乳腺や隣国、筋肉試料を汚染し、血液試料を汚染しないように注意してください。
注：境界線が明確に定義されていない場合は、解剖顕微鏡の使用が推奨されます。 - 脂肪デポを削除し、2ミリリットルのマイクロチューブに移す。
- RNA又はタンパク質が抽出される場合、-80℃の液体窒素とストアに浸漬することにより、組織を凍結する。劣化を防ぐために、一度にサンプルをフリーズします。
- 染色のために、修正するか、OCTに埋め込む。培養の場合は、DMEF-12で組織をカバーし、すべてのサンプルが培養（補足情報）のために収集されてまで、氷上に設定してください。
- 生殖腺脂肪内臓脂肪組織（VAT）と白色脂肪組織（WAT）デポの単離：
- 脂肪デポ間のクロス汚染しないよう手袋の新鮮なペアに置く。
- 脊損ssors、直接横隔膜の下に、横方向に腹膜をカット。腹部の臓器を露出させるために直腸半ば冠状にダイアフラムから腹膜をカット。
- 精巣や卵巣の位置を確認し、精巣上体、男性における脂肪または雌の生殖腺脂肪として知られている添付の白色脂肪組織を、特定する。
- 手術器具を清掃し、手袋の新鮮なペアに変更する
- 慎重に精巣、精巣上体、およびヴァーサ輸精管から精巣上体の脂肪デポの両方を分析。女性の場合は、慎重に卵巣から両方の生殖腺脂肪パッドを解剖。
- 脂肪デポを削除し、2ミリリットルマイクロチューブに転送。
- RNA又はタンパク質が抽出される場合、-80℃の液体窒素とストアに浸漬することにより、組織を凍結する。劣化を防ぐために、一度にサンプルをフリーズします。
- 染色のために、修正するか、OCTに埋め込む。培養の場合は、DMEF-12で組織をカバーし、すべてのサンプルが培養（補足情報）のために収集されてまで、氷上に設定してください。
血管周囲脂肪組織の3分離（PVAt系）
- ハートの単離：
- 外側へ延長上下の付属と仰臥位でマウスをレイアウト。
- サージカルテープを使用してセキュアな付属。
- 上記のようにマウスを配置した後、ピンセットで剣状突起上に持ち上げて緊張を作成します。胸腔の下部を露出させ、振動板を水平に切断した。
- 剣状突起上に持ち上げて、テンションを維持しながら、ちょうど胸骨の側に、頭に向かって上方に胸郭を切断。
- 鎖骨のすぐ下胸郭をピックアップし、両方向に腋窩に向かって鎖骨の劣る長さに沿って切り出した。胸腔とその内容（心臓、肺、 など ） が 、今はっきりと見えるはずです。
- 無菌GAを使用して余分な血液や体液の胸腔を清掃してください流体を吸収するuze。収集臓器や血管が（補足情報）おびただしいしてください場合。
- 領域は、流体のクリアされると、心のよりよい露出を可能にし、肺を除去して気管支および添付血管をカット。
- ローカライズと切除大動脈の血管周囲脂肪組織（PVAt系）：
- 肝臓、胃、脾臓、膵臓、腸、およびコロン：より良い大動脈の劣る部分を識別するように、以下の臓器を削除します。
- まず胃と食道の同定で始まる。身体から胃を解放するために胃食道接合部で食道をカット。
- 次に、腸と周囲の腸間膜を識別します。それは大動脈の腎部分に非常に密接に位置するように腸間膜を通じて表面的にカットし、その後「腸を実行します。」
- できるだけ直腸の近くに無料のコロンをカット。このように、マウスから胃、小腸および結腸を解放。
- リ取付腸間膜と血管を切断することにより胃、小腸、大腸、膵臓、脾臓を移動します。膵臓、脾臓、胃、小腸および結腸に無料で来る必要があります。
- 肝静脈を切断し、腸間膜を取り付けることによって、肝臓を削除し、すべてのローブを削除します。
- 内臓層と脂肪サラウンド腎臓を切り取る。大動脈の異なるセグメントのための地理的なマーカーとして機能するように、in vivoで大動脈に添付腎臓のままにしておきます。
- 無菌1X PBSでエリアをすすぎ、滅菌ガーゼで吸収して、すべての流体を除去。
- マイクロはさみとマイクロ鉗子を使用して、背骨にその背側アタッチメントと食道への腹側添付ファイルから大動脈を分離する。
- 腸骨領域での分岐に心臓内の原点から下行大動脈の長さを以下の大動脈を取り外して大動脈を分離します。
- 鎖骨下血管を同定し、単離。これらの血管を分離大動脈基部に首からより良い心臓大動脈ジャンクションと根を露出させる。
- 心臓の動きを可能にする、腕頭動脈、左総頚動脈、および左鎖骨下動脈を切断し、胸腺を除去する。
- 解剖顕微鏡の助けを借りて、大動脈の周囲の血管周囲脂肪組織（PVAt系）層を表示します。
- マイクロピンセットで大動脈からPVAt系の道を引っ張る優しく、PVAt系を挟んだり、圧迫しないように細心の注意を取る。静かにダイアフラムが置かれている場所だけに優れた胸部から始まるマイクロハサミで大動脈にPVAt系の添付ファイルをカット。
注：解剖顕微鏡をお勧めします。 - 大動脈血管の腸骨分岐の直前に優れ位置して大動脈大動脈地域、で仕上げ、このプロセスを大動脈の全長を繰り返します。
- 大動脈弓PVAt系が望まれる場合、より低いCからのPVAt系を除去するために、同じ方法を使用アーチのurvature。
- 2ミリリットルのマイクロ遠心チューブ（S）にPVAt系サンプルを置きます。
- RNA又はタンパク質が抽出される場合、-80℃の液体窒素とストアに浸漬することにより、組織を凍結する。劣化を防ぐために、一度にサンプルをフリーズします。培養の場合は、DMEF-12で組織をカバーし、すべてのサンプルが培養（補足情報）のために収集されてまで、氷上に設定してください。
注：追加の脂肪デポ興味を持っている場合包括的な脂肪デポ分析する際に考慮すべきは、次のとおりです。後腹膜、腸間膜、大網、心膜と膝窩動脈を。
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Representative Results
識別、および鼠径部皮下脂肪、肩甲骨間褐色脂肪、内臓副睾丸脂肪（ 図1）と同様に、大動脈弓の血管周囲脂肪、胸部大動脈脂肪、副腎大動脈脂肪と大動脈大動脈脂肪のローカライズ（ 図2）を使用して成功裏に達成された記載され手術方法。 BAT及びWAT試料間の組織学的検査および分化を陽性に染色（ 図3）をヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）を用いて評価した。細胞死誘導DFFA様エフェクター（CIDEA）、および他の脂肪特異的マーカーは、上記のすべての単離および切除さデポを測定したアディポネクチン（ADIPOQ）、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ（PPAR-γ）のRNAレベルの分析（データ示さず）。
皮下脂肪細胞および血管周囲脂肪細胞の初代細胞株を培養し、前脂肪細胞から分化したマイクロアレイ分析のために正常脂肪細胞への。脂肪細胞に転換培養前脂肪細胞をオイルレッドO染色（ 図4）で確認した。成功した単離、培養および脂肪細胞の分化をin vitro試験で使用するために達成され、タンパク質活性を正常に測定した。マトリックスmetaloprotease-2（MMP2）の酵素活性は、対照と比較して治療群で測定した。 MMP2の活性は、ザイモグラフィー（ 図5）を介して、一次血管周囲脂肪細胞株においてin situで測定した。
図C57BL / 6雄マウスの脂肪デポの1解剖学的位置。 （A）間褐色脂肪脂肪デポ。（B）鼠径皮下脂肪脂肪デポ。（C）内臓副睾丸脂肪脂肪デポ。w.jove.com/files/ftp_upload/52174/52174fig1highres.jpg「ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
C57BL / 6雄マウスにおけるPVAt系デポの図2.解剖の場所。 （A）大動脈弓の血管周囲脂肪デポ。（B）胸部大動脈の血管周囲脂肪デポ。（C）副腎大動脈の血管周囲脂肪デポ。（D）大動脈、大動脈の血管周囲脂肪デポ。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
BATとWAT脂肪の図3. H＆E染色。 （A）H 8; 40倍の倍率でWATの脂肪の、パラフィン埋め込 まれたC57BL / 6雄マウスのサンプル固定ホルムアルデヒドのE染色固定ホルムアルデヒドの（B）H＆E染色、40Xの倍率でBATのパラフィン埋め込 まれたC57BL / 6雄マウスのサンプル。。 クリックしてくださいここで、この図の拡大版を表示します。
培養されたPVAt系の前駆脂肪細胞と脂肪細胞の4オイルレッドO染色図。位相コントラスト20X倍率での分化のベースラインで培養した大動脈血管周囲の前脂肪細胞の（A）オイルレッドO染色（B）は、位相コントラストの20X倍率での分化の5日後の培養大動脈血管周囲脂肪細胞のオイルレッドO染色。ES / ftp_upload / 52174 / 52174fig3highres.jpg「ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
血管周囲の脂肪組織から単離された分化した脂肪細胞の図5ザイモグラフィーは 、* P <0.01、対照と比較して、未処理（対照）細胞と比較して治療後に放出MMP2活性の低下を示した。
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Discussion
肥満は罹患率の大ホストと脂肪が完全に理解されていないが果たす役割の完全な理解につながることができます。脂肪の分野において、したがって継続的な研究が必要である。動物モデルは、特にマウスモデルは、病気や潜在的な製薬治療のテストの進行に初期の研究に最適です。これらのモデルを使用して、脂肪デポの正確な分離および切除は、脂肪の影響を受ける疾患の病理の研究において非常に重要かつ必要なツールです。
脂肪デポに関する現在の文献では、脂肪貯蔵物、ならびにそれらの解剖学的位置の間の代謝挙動および変化に関する文献のかなりの量が存在する。しかし、具体的には、ローカライズ特定し、これらのデポを単離する方法についての詳細な方法を提供するいくつか存在する。脂肪の現在の単離方法の見直しに基づき、プロトコルtの小さなサブセットがあります帽子は、一度に1つまたは2つのデポを単離する方法の方法論を提供する。しかし、正確な解剖、汚染の最小量の複数のデポの単離を可能にする技術と同様に、アドレスが収集されたサンプルを研究する様々な方法がこのプロトコル13-14に特徴的である。
この方法論の中で、サンプルの単離及び純度にとって極めて重要ないくつかのステップがあります。多くの場合、髪や汚染物質を除去するためのツール、手袋、表面を洗浄すると、デポ汚染を回避することが不可欠なステップである。 deglovingのために腹膜を露出させ、マウスの周囲に横方向に皮膚をカットすると、それはあまりにも深く切断を避けるために不可欠です。腹膜をカットすることは非常に困難deglovingようになりますし、試料の汚染の可能性が高くなります。 SQの脂肪デポを切除するとき、それは広告のいずれかを切り出す前に、デポの三角形の境界を特定するために不可欠であるipose。また、慎重なカットが筋肉を回避するためになされたものであり、血管、腺および脂肪隣接する必要があります。これは別の脂肪、腺組織、筋肉や血液から試料の汚染を防ぐことができます。
この方法で脂肪デポの単離および切除への主な制限、および他の類似の方法は、特定のデポの境界の定義に記載されています。により、皮下デポなどのデポ、難定義された境界線に隣接脂肪からの汚染の少量を欠いたアイソレーションが挑戦することができます。別の制限は、血管に関連デポに補足的な実験のために収集された十分な組織を確保する上で見つけることができます。これは孤立のサイトや動物に関連した食事療法に依存しているが、この制限は、時々、サンプルのプーリングを必要とします。
脂肪デポが単離された後、それらは、種々のアッセイに利用することができる。脂肪を使用することができますそのようなタンパク質の発現、酵素活性および遺伝子発現解析などの分子的研究のためにdを。さらに、一インビトロ研究における主要な細胞株のための脂肪細胞を単離することができる。不死化細胞株も、しかし不死細胞が原発単離された細胞株のように信頼できるものではなく、in vitro試験のために使用することができる。最後に、脂肪は、固定または白血球浸潤、タンパク質の局在化、並びに脂肪細胞形態の特徴を識別するために、組織学的検査のためにOCTで凍結することができる。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Med-Vet International | #RXISO-250 | |
| 70% Ethanol | Fisher | 07-678-001 | |
| DMEF-12 | Sigma Aldrich | D-6421 | Warm in waterbath before putting on tissue. |
| 2 ml Microcentrifuge tubes | Midsci | MCT-200-C-S | |
| Phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P5368-10PAK |
References
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