Summary
Devido à conexão drástica e negativa entre a obesidade e outras comorbidades, a investigação sobre o papel adiposo desempenha na doença e na saúde global é garantido. Apresenta-se um protocolo para o isolamento e a excisão de depósitos adiposos que permitam o estudo de tecido adiposo usando in situ e in vitro.
Introduction
Adiposo fez uma aparição notável nos holofotes da mídia, devido ao aumento dramático da obesidade durante as últimas décadas do século 20. Obesidade afeta atualmente mais de um terço dos adultos e 17% das crianças e adolescentes nos Estados Unidos (EUA) 1. Abrangendo todos os grupos étnicos, a pesquisa estatística em torno da epidemia de obesidade tem mostrado que os negros não-hispânicos têm a maior taxa ajustada por idade de obesidade (49,5%) em comparação com os mexicanos-americanos (40,4%), todos os hispânicos (39,1%) e não- hispânicos (34,3%) 2. O efeito econômico da obesidade também é uma preocupação crescente para o sistema de saúde. Em 2012, estima-se que o custo médico anual de cuidados para a obesidade em os EUA em 2005 foi de 190,2 bilhões dólares, quase 21% do orçamento global da despesa médica. Infelizmente, a obesidade infantil foi estimada a ser responsável por US $ 14 bilhões em custos médicos diretos sozinho. Estatisticamente, determinou-se que a média de custo médico deindivíduos com obesidade foi de $ 2741 mais elevado de um ano do que aqueles sem esta morbidade 3-5.
A obesidade é um importante fator de risco para uma variedade de condições, tais como: diabetes tipo 2, dislipidemia, doenças cardiovasculares, câncer, distúrbios osteo-musculares e inflamação crônica. A obesidade está profundamente ligada à patogênese da síndrome metabólica e outras doenças crônicas 6-8. Com tais conexões drásticas e negativas entre a obesidade e outras comorbidades, a investigação científica tem concentrado a atenção para entender melhor a atual epidemia e os papéis diversos e central desempenhado pelas adiposo.
Historicamente, o tecido adiposo foi considerada irrelevante e foi visto apenas como um tecido de enchimento simples. Atualmente, adiposo foi mostrado para desempenhar vários papéis essenciais em função do corpo em: metabolismo, a regulação hormonal, inflamação, proteção e isolamento 9. O tecido adiposo é composto principalmente deadipócitos, mas também contém pericitos, células endoteliais, macrófagos e monócitos, células estaminais pluripotentes 8. O tecido adiposo é distribuído por todo o corpo em depósitos distintos. Os principais depósitos podem ser encontrados subdermicamente, por via subcutânea, intramuscular, e visceral 10. Depósitos adiposos demonstraram possuir perfis metabólicos específicos de depósito, os quais mostraram uma susceptibilidade específica depósito de obesidade e distúrbios relacionados 8.
Tradicionalmente, o tecido adiposo foi classificado em dois tipos principais: o tecido adiposo branco (WAT) e tecido adiposo marrom (BAT); embora a literatura recente indica as presenças de um terceiro grupo batizado brite ou bege adiposo 11. O tecido adiposo foi mostrado para ter cores diferentes, as morfologias, funções metabólicas, características bioquímicas e padrões de expressão genética 10. Os adipócitos em WAT ter um único, grande gota lipídica e quantidades variáveis de mitocôndrias. WATé predominantemente encontrado em localidades subcutâneas e viscerais do corpo. Funções WAT principalmente como um local de armazenamento de energia e proteção de órgãos. Os adipócitos em BAT têm uma morfologia multilocular e mitocôndrias abundantes. MTD está localizada principalmente no pescoço e grandes vasos sanguíneos do tórax, bem como as escápulas 12. MTD principalmente funções em comportamentos de gasto de energia que regulam a termogênese 7. Brite adiposo ou bege foi mostrado para partilhar uma morfologia e expressão análoga à MTD, mas foi encontrado para ser originado a partir de adipócitos brancos 11.
O método cirúrgico descrito neste manuscrito fornece aos pesquisadores com a capacidade de analisar os diferentes efeitos que os fatores tais como: ambiente, produtos farmacêuticos, e genética, têm no tecido adiposo; bem como o adiposo papel benéfico ou prejudicial desempenha na doença e na saúde em geral. Além disso, proporcionar uma forma de identificar e isolar diferentes tipos de tecido adiposo parapermitir uma melhor compreensão das relações bioquímicas e diferenças entre depósitos. Isto pode ajudar a determinar a relação entre a localização, a função, e tipos de gordura dentro do corpo. Este método descrito faz isso, fornecendo os meios para visualização bruta, a análise de expressão gênica, análise de expressão de proteínas, exame histológico, e isolamento de linhas de células primárias para estudos in vitro. Atualmente, existem muitos artigos que fornecem insights sobre o comportamento metabólico dos diferentes depósitos adiposos, bem como suas localizações anatômicas; mas não fornecem um método em profundidade sobre como localizar especificamente, identificar e isolar esses depósitos. Este método fornece uma técnica cirúrgica precisa que permite o isolamento de vários depósitos, com uma quantidade mínima de dissecção e a contaminação em comparação com outros métodos concebidos para o isolado de um ou dois depósitos 13-14.
O objetivo deste protocolo é o de proporcionarum método de precisão para a identificação e isolamento de diferentes tipos de depósitos de gordura a partir de várias localizações anatómicas.
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Protocol
NOTA: Todos os procedimentos com animais foram realizados com a aprovação do Comitê de Cuidados e Uso Animal Institucional (IACUC) da Universidade de Cincinnati, e de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do National Institutes of Health (NIH Publication Nenhum . 85-23, revista em 1996).
1. Eutanásia e esterilizar o mouse
- Posicione o mouse em um dropbox contendo uma dose supratheraputic de isoflurano e permitir a inalar para o efeito. Uma vez que o rato é sacrificado, retirar da caixa.
- Cervicalmente deslocar como um segundo meio de eutanásia.
- Esteriliza-se a superfície externa do rato, pela limpeza do animal com etanol a 70%.
2. Identificação e isolamento de três Depots adiposo Diferentes
- Brown tecido adiposo (BAT) Isolamento:
- Certifique-se que a pele está molhada do álcool de limpeza para ajudar na corte através da epiderme e da derme Layers.
- Posicione o mouse em decúbito dorsal, com as costas contra a mesa.
- Agarre a pele logo abaixo do diafragma com uma pinça, elevador e inciso com uma tesoura.
- Cortado transversalmente em torno da circunferência do rato para expor o peritoneu.
- Revele a BAT depósito em forma de borboleta por degloving a metade superior do mouse. Segure os apêndices inferiores e abdômen em uma mão e puxar a pele para cima em direção à cabeça.
- Orientar o rato, de modo que fique posicionado em pronação na tabela. Tenha cuidado para não contaminar o depósito exposto com o cabelo.
- Instrumentos cirúrgicos limpos e mudança para um novo par de luvas.
- Localize as escápulas e depósito correspondente. Remova cuidadosamente qualquer adiposo branco superficial sobre a borboleta e depois dissecar a borboleta da gordura marrom interescapular. Tenha cuidado para evitar o músculo intimamente associada com a gordura marrom.
NOTA: O uso de um microscópio de dissecação é recomendado para a remoção do white adiposo, bem como na separação do tecido adiposo castanho de as escápulas. - Remover depósito de gordura e transferir para um tubo de microcentrífuga de 2 ml.
- Se o ARN ou proteína está a ser extraída, congelar o tecido por imersão em azoto líquido e armazenar a -80 ° C. Congelar a amostra ao mesmo tempo para evitar a degradação. Se a cultura, cobrir o tecido em DMEF-12 e definir sobre o gelo até que todas as amostras são coletadas para a cultura (informação suplementar).
- Isolamento de tecido adiposo subcutâneo (SQ), um branco tecido adiposo Depot (WAT):
- Coloque em um novo par de luvas para não contaminar entre depósitos de gordura.
- Revelar o inguinal, depósitos SQ triangulares por De-gloving a metade inferior do mouse. Segure os apêndices superiores e tórax em uma mão e puxar a pele para baixo em direção aos pés com a outra mão.
- Orientar o mouse em decúbito dorsal, tomando cuidado para não contaminar o depósito exposto com o cabelo.
- Limpe surgicainstrumentos L e mudança para um novo par de luvas.
- Dissecar cuidadosamente os triângulos de gordura SQ. Tenha cuidado para não contaminar a amostra com o músculo, vizinha de gordura, glândulas mamárias ou cortando os navios e contaminar a amostra de sangue.
NOTA: O uso de um microscópio de dissecção é recomendado se as fronteiras não estão claramente definidos. - Remover os depósitos de gordura e transferir para tubos de microcentrífuga de 2 ml.
- Se o ARN ou proteína está a ser extraída, congelar o tecido por imersão em azoto líquido e armazenar a -80 ° C. Congelar a amostra ao mesmo tempo para evitar a degradação.
- Para a coloração, corrigir ou incorporar em outubro Se a cultura, cobrir o tecido em DMEF-12 e definir sobre o gelo até que todas as amostras são coletadas para a cultura (informação suplementar).
- Isolamento de gonadal Fat um Tissue Visceral adiposo (IVA) e branco tecido adiposo (WAT) Depot:
- Coloque em um novo par de luvas para não contaminar entre depósitos de gordura.
- Com scissors, cortar transversalmente o peritoneu, directamente abaixo do diafragma. Corte o peritônio do diafragma até meados reto coronally para expor órgãos abdominais.
- Localizar os testículos ou ovários e identificar o tecido adiposo branco em anexo, conhecido como o adiposo epididimal em machos ou fêmeas em adiposo gonadal.
- Instrumentos cirúrgicos limpos e mudar para um novo par de luvas
- Dissecar cuidadosamente ambos os depósitos de gordura do epidídimo dos testículos, epidídimos, e canais deferentes. Ou, se do sexo feminino, dissecar cuidadosamente ambas as pastilhas de gordura gonadal dos ovários.
- Remover depósitos de gordura e transferi-los para 2 tubos ml de microcentrífuga.
- Se o ARN ou proteína está a ser extraída, congelar o tecido por imersão em azoto líquido e armazenar a -80 ° C. Congelar a amostra ao mesmo tempo para evitar a degradação.
- Para a coloração, corrigir ou incorporar em outubro Se a cultura, cobrir o tecido em DMEF-12 e definir sobre o gelo até que todas as amostras são coletadas para a cultura (informação suplementar).
3. Isolamento de tecido adiposo perivascular (PVAT)
- O isolamento do coração:
- Coloque o mouse em uma posição supina com apêndices superiores e inferiores estendidos para fora.
- Apêndices seguros usando fita cirúrgica.
- Depois de posicionar o mouse como listado acima, criar tensão, levantando-se no apêndice xifóide com uma pinça. Corte horizontal através do diafragma, expondo a porção inferior da cavidade torácica.
- Apesar de manter a tensão, levantando-a do apêndice xifóide, cortar a caixa torácica superiormente para a cabeça, apenas para o lado do esterno.
- Pegue a caixa torácica apenas inferior à clavícula, e corte ao longo do comprimento inferior da clavícula em direção a axila em ambas as direções. A cavidade torácica e seu conteúdo (coração, pulmões, etc.) agora deve ser claramente visível.
- Limpe a cavidade torácica do sangue alheio e fluido usando ga estérilUze para absorver o fluido. Se coleta órgãos ou vasos não se esqueça de profusa (informação suplementar).
- Uma vez que a área está limpa de fluido, o corte dos vasos e brônquios correspondentes a remoção dos pulmões, o que permite uma melhor exposição do coração.
- Localização e Excisão da aorta perivascular tecido adiposo (PVAT):
- Remova os seguintes órgãos para melhor identificar as partes inferiores da aorta: fígado, estômago, baço, pâncreas, intestinos e cólon.
- Primeiro começa com a identificação do estômago e do esôfago. Cortar o esófago na junção gastro-esofágica para libertar o estômago do corpo.
- Em seguida, identificar os intestinos e do mesentério circundante. Cortar superficialmente através de mesentério, já que fica muito perto da porção renal da aorta, em seguida, "executar o intestino."
- Cortar o cólon libertar o mais próximo do recto quanto possível. Deste modo, libertando o estômago, intestino e cólon do rato.
- Remover-se o estômago, intestino, cólon, pâncreas e baço, cortando através do mesentério de fixação e navios. O pâncreas e baço deve vir livre com o estômago, intestino e cólon.
- Retire o fígado cortando as veias hepáticas e anexando mesentério, remova todos os lobos.
- Cortar a camada visceral e gordura cercam os rins. Deixar os rins ligados à aorta in vivo para servir como marcadores geográficos para diferentes segmentos da aorta.
- Lavar a área com 1x PBS estéril e remover todo o fluido por absorção com uma gaze estéril.
- Usando micro-tesouras e micro-fórceps, separar a aorta do seu apego à espinha dorsal e ventral a sua fixação para o esôfago.
- Isolar a aorta, seguindo e destacando a aorta do comprimento da aorta descendente a partir da origem no coração até a bifurcação na região ilíaca.
- Identificar e isolar os vasos subclávia. Isolar esses naviosdesde o pescoço até a raiz aórtica para melhor expor a junção da raiz aórtica e no coração.
- Remover o timo, em seguida, cortado a artéria inominada, a artéria carótida comum esquerda, e a artéria subclávia esquerda, permitindo o movimento do coração.
- Com o auxílio de um microscópio de dissecação, visualizar o tecido adiposo (PVAT) camada perivascular ao redor da aorta.
- Tomar muito cuidado para não beliscar ou apertar o PVAT, retire com cuidado o caminho PVAT da aorta com micro-fórceps. Suavemente cortar a ligação do PVAT à aorta com micro-tesouras começando na região torácica logo acima, onde o diafragma está localizado.
NOTA: Um microscópio de dissecção é recomendada. - Repetir este processo de todo o comprimento da aorta, terminando na região da aorta infra-renal, a qual está localizada logo acima da bifurcação ilíaca do vaso aórtico.
- Se arco aórtico PVAT é desejada, usou o mesmo método para remover o PVAT do menor curvature do arco.
- Coloque as amostras PVAT em 2 ml de tubo (s) de microcentrífuga.
- Se o ARN ou proteína está a ser extraída, congelar o tecido por imersão em azoto líquido e armazenar a -80 ° C. Congelar a amostra ao mesmo tempo para evitar a degradação. Se a cultura, cobrir o tecido em DMEF-12 e definir sobre o gelo até que todas as amostras são coletadas para a cultura (informação suplementar).
NOTA: depósitos adiposos adicionais a considerar se estiver interessado em uma análise abrangente depósito adiposo incluem: retroperitoneal, mesentérica, omental, pericárdio e poplítea.
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Representative Results
Identificação e localização de tecido adiposo subcutâneo inguinal, adiposo castanho interescapular, adiposo epididimal visceral (Figura 1), bem como o tecido adiposo arco aórtico perivascular, adiposo da aorta torácica, adiposo supra-renal da aorta e do tecido adiposo da aorta infra-renal (Figura 2) foi alcançada com sucesso usando o método cirúrgico descrito. O exame histológico e diferenciação entre amostras MTD e Wat foram avaliados positivamente com Hematoxilina e Eosina (H & E) coloração (Figura 3). A análise dos níveis de ARN de adiponectina (AdipoQ), receptor gama activado pelo proliferador de peroxissoma (PPAR-γ), foram medidos morte celular induzindo-DFFA como um efector (CIDEA), e outras gorduras de marcadores específicos para todos os depósitos acima isolados e excisadas (dados não apresentados).
Linhagens de células primárias de adipócitos subcutâneos e adipócitos perivasculares foram cultivadas e diferenciada de pr�adip�ito s a adipócitos com êxito para a análise de microarray. Os pré-adipócitos em cultura convertidos em adipócitos foram confirmados com Oil Red O coloração (Figura 4). Bem sucedida isolamento, cultivo e diferenciação de adipócitos foi conseguida para utilização em estudos in vitro, e a actividade da proteína foi medida com êxito. A actividade enzimática da metaloprotease de matriz-2 (MMP2) foi medida num grupo de tratamento comparado com o controlo. A actividade de MMP2 foi medido in situ em uma linha de adipócitos perivascular primário através zimografia (Figura 5).
Figura 1. localizações anatômicas de C57BL / 6 machos rato adiposo depósitos. Depot (A) Interscapular adiposo marrom de gordura. (B) depósito de gordura adiposo subcutâneo inguinal. (C) epididymal Visceral depósito de gordura adiposa."target =" _ w.jove.com/files/ftp_upload/52174/52174fig1highres.jpg blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. localizações anatômicas de depósitos PVAT em um C57BL / 6 do sexo masculino mouse. (A) da aorta depósito adiposo arco perivascular. (B) Thoracic depósito adiposo perivascular aórtica. (C) Suprarenal depósito adiposo perivascular aórtica. (D) Infrarrenal depósito adiposo perivascular aórtica. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. H & E coloração da BAT e WAT adiposo. (A) H 8; E coloração de paraformaldeído fixo, embebido em parafina C57BL / 6 do sexo masculino amostra rato de adiposo WAT em um aumento de 40 vezes (B) H & E coloração de paraformaldeído fixo, parafina C57BL incorporado / 6 masculino amostra do rato da BAT em um aumento de 40 vezes.. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Oil Red O coloração dos pré-adipócitos em cultura PVAT e adipócitos. (A) Oil Red O coloração dos pré-adipócitos perivasculares aórticas cultivadas na linha de base de diferenciação com ampliação de 20x, com contraste de fase. (B) Oil Red O coloração de adipócitos perivasculares aórticas em cultura após 5 dias de diferenciação com ampliação de 20x, com contraste de fase.es / ftp_upload / 52174 / "target =" _ 52174fig3highres.jpg blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. zimografia de adipócitos diferenciados, isoladas de tecido adiposo perivascular, demonstrou uma diminuição da atividade MMP2 liberado após o tratamento em comparação com células não tratadas (controle), * P <0,01 em relação ao controle.
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Discussion
A obesidade pode levar a uma grande série de morbidades e o pleno entendimento do papel que desempenha adiposo não é totalmente compreendido; Por conseguinte, continua a pesquisa no campo da adiposo é necessário. Os modelos animais, especificamente modelos murinos são ideais para a pesquisa inicial na progressão de doenças e ensaios de tratamentos farmacêuticos potenciais. Na utilização destes modelos, o isolamento e a excisão precisa de depósitos de tecido adiposo é uma ferramenta extremamente importante e necessário no estudo da patologia de doenças afectadas adiposos.
Na literatura atual sobre depósitos adiposos, há uma quantidade considerável de literatura sobre o comportamento metabólico e variação entre depósitos adiposos, bem como suas localizações anatômicas. No entanto, são poucos os que oferecem um método em profundidade sobre como localizar especificamente, identificar e isolar esses depósitos. Com base na revisão de métodos de isolamento atuais de adiposo, há um pequeno subconjunto de protocolos de tchapéu fornecer metodologia sobre como isolar um ou dois depósitos de cada vez. No entanto, uma técnica precisa que permite o isolamento de vários depósitos com uma quantidade mínima de dissecção e contaminação, bem como endereços de vários métodos de estudo das amostras coletadas é distintivo para este protocolo 13-14.
Dentro desta metodologia, existem vários passos que são de importância vital para o isolamento e a pureza da amostra. Limpeza ferramentas, luvas e superfícies frequentemente para remover pêlos e contaminantes é um passo imprescindível para evitar a contaminação de depósito. Ao cortar a pele de forma transversal em torno da circunferência do mouse para expor o peritônio para degloving, é vital para evitar o corte muito profundamente. Cortando o peritônio fará degloving muito difícil e vai elevar o potencial de contaminação da amostra. Quando extirpando os depósitos adiposos SQ é fundamental para identificar os limites triangulares do depósito antes extirpando qualquer do anúncioipose. Além disso, os cortes cuidadosos devem ser feitos para evitar muscular, e ao lado vasos, glândulas e adiposo. Isto irá evitar a contaminação da amostra de tecido adiposo alternativo, tecido glandular, músculo ou sangue.
A maior limitação ao isolamento e à excisão de depósitos adiposos, neste método e outros métodos comparáveis podem ser encontrados na definição dos limites de determinados depósitos. Devido aos limites indefinidos em depósitos, como os depósitos subcutâneos, faltando o isolamento de uma pequena quantidade de contaminação a partir de tecido adiposo vizinho pode ser um desafio. Outra limitação pode ser encontrado na garantia bastante tecido é recolhida para a experimentação suplementar em depósitos vasculares associados. Esta limitação às vezes requer mistura de amostras, embora isto seja dependente do local de isolamento e a dieta associados com o animal.
Depois de os depósitos adiposos são isolados, eles podem ser utilizados para uma variedade de ensaios. O tecido adiposo pode ser usadod para estudos moleculares, tais como a expressão de proteínas, actividade enzimática e análise de expressão génica. Além disso, pode-se isolar adipócitos para a linha de células primárias em estudos in vitro. Imortalizadas linhas de células podem também ser utilizados para estudos in vitro, no entanto as células imortais não são tão credível como linhas de células primárias isoladas. Finalmente, o tecido adiposo pode ser fixo ou congelada em OCT para exame histológico para identificar a infiltração de leucócitos, a localização da proteína, assim como a caracterização da morfologia dos adipócitos.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Med-Vet International | #RXISO-250 | |
| 70% Ethanol | Fisher | 07-678-001 | |
| DMEF-12 | Sigma Aldrich | D-6421 | Warm in waterbath before putting on tissue. |
| 2 ml Microcentrifuge tubes | Midsci | MCT-200-C-S | |
| Phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P5368-10PAK |
References
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