Abstract
Mukozal patojenlere karşı savunma Erken bir epitel bariyer ve doğuştan gelen bağışıklık hücreleri, hem oluşur. Her iki immunocompetency ve bunların interkom, enfeksiyonlara karşı korunması için çok önemlidir. Bir patojen ile epitel ve doğuştan gelen bağışıklık hücreleri etkileşimleri en karmaşık davranış zaman ve mekan içinde izlerken vivo, incelenmiştir. Ancak, mevcut modeller mukozal düzeyinde patojenler ile savaş kolay uzay-zamansal görüntüleme için izin vermez.
Burada geliştirilen model çocuk zebrabalıkları statik taşıma içine mantar patojeni, Candida albicans, doğrudan enjeksiyon sureti ile bir mukozal infeksiyonu oluşturur. Ortaya çıkan enfeksiyon mukozal hastalık gelişimi boyunca epitel ve doğuştan gelen bağışıklık hücre davranışının yüksek çözünürlüklü görüntüleme sağlar. Bu yöntemin çok yönlülük ph yol açan bağışıklık olaylar ayrıntılı dizisini prob konağın sorgulama için izin veriragocyte işe özel hücre tipleri ve koruma moleküler yolların rollerini incelemek ve. Buna ek olarak, immün bir fonksiyonu olarak patojen davranışı floresan protein ifade C ile eş zamanlı olarak görüntülenebilir albicans arasından seçilir. Konak-patojen etkileşimi artmış uzaysal çözünürlüğü açıklanan hızlı swimbladder diseksiyon tekniği kullanılarak da mümkündür.
Burada anlatılan mukozal enfeksiyonu modeli mukozal kandidiazis çalışma için değerli bir araç yapma, basit ve son derece tekrarlanabilir. Bu sistem, aynı zamanda, normal epitel yüzeyleri boyunca enfekte mikobakteriyel bakteriyel veya viral mikropların gibi diğer mukozal patojenlerin geniş çapta çevrilebilir olabilir.
Protocol
NOT: Tüm Zebra balığı bakım protokolleri ve deneyler Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) protokolü A2012-11-03 altında NIH kurallarına uygun olarak yapıldı.
4 Gün Post Döllenme 1. Zebra balığı Yetiştirme
- Başka bir video 34 'de gösterildiği gibi, ilk 3 saat sonra döllenme içinde, AB zebrafish veya başka bir transjenik çizgiler toplayın.
- (0.17 mM KCI, 0.33 mM CaCl2, 0,33 mM MgCl2, 2 mM HEPES, pH 6.8, 5 mM NaCl) metilen mavisi ile (0.3 ug / ml nihai E3 ortam 150 ml içeren 15 cm'lik bir petri tabaklarında 120 yumurta inkübe 12/12 açık / koyu fotoperiyodun ile 33 ° C inkübatör konsantrasyon).
- E3 + propiltiyourasil'i (1-fenil-2-tioüre, 10 ug / ml nihai konsantrasyon) ile 6 saat sonra ortam yerine ve ölü yumurta çıkarın.
- 2 gün sonra, taze E3 + propiltiyourasil'i Ortamı alışverişi, 33 ° C'de 4 gün boyunca inkübe edilir.
2. içindejection mikro-iğne hazırlanması
- Aşağıdaki ayarlarla bir iğne çektirmenin kullanarak bir mikro-iğne içine; borosilikat kılcal (ID 0.69 mm OD 1.2 mm) çekin (550 Heat, 0 çekin, 130 Velocity 110 Saat).
NOT: Ayarlar filamanın değişecektir (Şekil 1) benzer şekilli mikro-iğneler elde etmek filament ve yeni bir filaman takıldığında yeniden ayarlanması gerekir. - 0.4 um filtreden fosfat tamponlu salin 3 ul mikro-iğne ile doldurun (; 137 mM NaCI; 2.7 mM KCI, PBS, 10 mM, Na 2 HPO 4; 1,8 mM KH 2 PO 4, 7.4 pH) 20 ul Microloader pipet kullanılarak ucu.
- Bir basınçlı enjeksiyon sistemine bağlı bir micromanipulator bir mikropipet tutucu mikro-iğne ayarlayın. 30 PSI enjeksiyon basıncını ve 30 msn de darbe süresini ayarlayın.
- Iğne 1/5 su içinde olana kadar damıtılmış su ile bir petri kabı kullanarak, mikro iğne düşük. Mikro-iğne, wi Klipsu seviyesinin hemen altında ince cımbız th. Sudan mikro-iğne getir ve bir bolus görünene kadar pedalına birkaç kez itin.
- Çeşidi bir damla bir daldırma yağı ile katmanlı bir hemositometrede mikro-iğne düşürerek bolus çapını ölçün. İstenilen hacim elde etmek için darbe süresi ayarlayın (Tablo 1).
- Yağda stabil kalır (bolus hacmini artırır eğer basıncı düşürmek ve Kapsül hacmi azalırsa backpressure artırmak) için bolus için backpressure ayarlayın. Her mikro-iğne darbe süresini kaydedin.
- Bir Microloader pipet kullanarak aspire mikro-iğne PBS çıkarın ve enjektör geri yerleştirerek ve sürekli darbe anahtarı çevirerek sol-over PBS sınırdışı. Her mikro-iğne Rezervasyon.
3. Candida Hazırlık
- Streak Candida albicans kodon-optimize dTomato, GFP, BFP, EOS veya Far ile transformeBir maya peptine dekstroz (YPD) agar (10 g / L maya ekstresi, 20 g / L pepton üzerine steril ahşap takoz kullanılarak donmuş stoktan (-80 ° C hazır% 25 gliserol), kırmızı, 20 g / L dekstroz , 20 g / L ağar; otoklava Petri kapları içinde 25 ml boşaltılmıştır) ve 30 ° C de bir gece boyunca inkübe edilir.
- Steril bir ahşap takoz kullanılarak bir koloni almak ve YPD bir sıvı (10 g / L maya ekstresi, 20 g / L pepton, 20 g / L dekstroz, 5 ml kadar inoküle, Otoklavdan geçirilen ve aseptik 16 x 150 mm cam kültürü, 5 ml bölünebilir borular).
- 60 rpm'de bir silindir tambur içinde 30 ° C'de gece boyunca inkübe edin.
- C. 1 ml toplayın 1.7 ml steril santrifüj tüpü içine albicans kültürü ve transferi.
- Sn bir çift için 5.000 xg'de santrifüj. Süpernatant boşaltın ve iyice steril PBS, girdap 1 ml ekleyin. Iki kez bu işlemi tekrarlayın.
- Steril PBS içinde 1000: 1 ml stok 1 seyreltilmesi ile bir hemositometre kullanılarak kolonileri sayın.
4. Zebra balığı EnjekteSwimbladder
- Bir 33 ° C kuluçka makinesi içinde, 30 dakika için bir enjeksiyon çanak (% 2 agaroz) ısıtın.
- İstenen zaman, herhangi bir zebrafish aspire olmadan 25 mi pipet kullanılarak enjekte balık içeren 15 cm Petri için E3 + propiltiyourasil'i, 150 ml, 100 çıkarın.
- Geri kalan, 50 ml ortam (nihai konsantrasyon 200 mg / ml) bir 4 mg / ml tampon tricaine metan sülfonat stok (TR) 2 ml ekleyerek zebrabalıkları dpf 4 anestezisi ve 15 dakika boyunca bekleyin.
- Bir mikroskop altında, şişirilmiş bir statik taşıma ile balık seçin. Balık aynı zamanda MPO nötrofil dağıtımı, homojen fenotip için o anda taranabilir: GFP çizgi mikroskop diseksiyon bir Epifloresans kullanarak.
- C seyreltin orijinal konsantrasyon albicans stok 1.5 x 10 7 koloni PBS ml (cfu / ml) oluşturan üniteler için (adım 3.8).
- Plastik bir transfer borusu kullanılarak enjeksiyon çanak üzerine 30 zebrafish aktarıntte ve aşırı ortamı çıkarın.
- Bir balıkçı tel aracı (0.012 inç çaplı olta borosilikat kılcal içine süper yapıştırılmış) kullanarak, dikey enjeksiyon çanak tutarak 10 balık, 3 çizgiler yapmak ve dikey balık yönlendirmek.
- Fazla ortamı çıkarın.
- İyice 1.5 x 10 7 cfu ile tüp vorteks / mL C albicans arasından seçilir.
- C 3 ul bir mikro-iğne doldurun albicans, yeni bir Microloader pipet kullanarak ve uygun ayara darbe süresini ayarlamak (adım 2.9 bakınız).
- Swimbladder (Şekil 3A) arkasına doğru amaçlayan, mikro-iğne ve balık kafası arasındaki 20 ° lik bir açı yapmak için enjeksiyon çanak döndürün.
- , Statik taşıma içine mikro-iğne itin iğne deliği lümen olduğundan emin yapma, ve bir kez pedalına basın.
- Her balık için tekrarlayın ve E3 bir çanak sel bir kurtarma çanak (25 ml E3 + PTU) transferd kurtarma çanak içine boşalma.
- Enjeksiyon çanak başka 30 balık aktarın.
- İyice ile dolu yeni bir mikro-iğne ile enjeksiyon tekrarlayın C vortekslendi albicans arasından seçilir.
- Gerekirse kirlenmesini önlemek ve ayrı bir kurtarma çanak (adım 4.10) aktarmak için farklı bir enjeksiyon çanak kullanarak, PBS kontrol enjekte edilerek bitirin.
5. İstenilen İnokulum için Balık tarama
- Çözülene kadar mikrodalga ve 37 ° C'ye kadar soğutularak kaynatma, E3 40 ml 0.4% agaroz çözeltisi (LMA) düşük eriyik 160 mg ekleyerek, düşük erime sıcaklığı olan agaroz için 40 mi hazırlayın. Bir kez soğutulduğunda TR (nihai konsantrasyon 200 mg / ml) 400 ul ekle.
- (25 mL, E3 + propiltiyourasil'i, nihai konsantrasyon 200 mg / ml içine TR sadece 1 ml ile adım 4.3) de anlatıldığı gibi, 30 dakika sonrası nekahattan sonra, balık uyuşturan.
- Bir kilo tekne LMA 2 ml (mümkün olduğunca az medya ile) Transfer 30 balık.
- Aspire ayrı bir transfer pipeti ile balık ve sadece 10 x 6 merkez kuyu kullanılarak, 96 çukurlu bir görüntüleme plaka içine LMA'nın 1 damla balık plaka.
- Ekranın tüm balık görüntüleme plakasına yüklenir kadar tekrarlayın.
- Ortam, 5 dakika boyunca oda sıcaklığında katılaşmaya edelim.
- Onlar cam alt ile temas halinde emin, kendi tarafında balık yerleştirin.
- Bir ters Epifloresans / konfokal mikroskop ve uygun filtre üzerinde 20X objektif kullanılarak, C sayısını kaydetmek Her balığın statik taşıma albicans maya hücreleri.
- , Statik taşıma 15-25 maya hücreleri ile balık (veya arzu edilen inokulum) Select ötenazi seçili olmayan balık (E3 TR 800 ug / ml) tarafından E3 + propiltiyourasil'i 50 ml derin Petri kabı seçilen balık dönüş görüntüleme plaka seçilen kuyulara E3 3 damla ekleyerek ve plastik transfer pipet ile balık aspire.
- İstenen süre için 33 ° C'de inkübe edin.
6. Balık Sonrası tarama Görüntüleme
- İstediğiniz anda, görüntü balık içeren derin Petri kabı E3 + PTU medya 50 ml 25 kaldırın.
- (25 mi, E3 + propiltiyourasil'i kalan, nihai konsantrasyon 200 mg / ml içine TR sadece 1 ml ile adım 4.3) de anlatıldığı gibi balık anestezi uygulayın.
- Uygun bir şekilde 96 oyuklu görüntüleme levhasının ve yerine balık Plate (5,3-5,7 adım).
- Uygun lazerler ve emisyon filtreleri kullanarak konfokal mikroskobu ile görüntü. İlk diferansiyel girişim kontrast (DIC) kapsamında 4X objektif kullanarak balık odaklama ve 2 mikro saniye / piksel hızı ve 1024 x 600 piksel en boy oranı ile tarama modunda konfokal lazerler ile 20X objektif kullanarak ilgi bölgenin görüntülerini elde. 3 kare Kalman filtresi modunu uygulayarak, 1 mikron adım boyutu ile Z-yığınlar edinin.
- 50 ml E3 + PTU veya individua içine derin bir Petri kabı dönl kuyuları (24 bölümlü kültür çanağı, 3 mi E3 + PTU) ile 33 ° C'de inkübe edin.
7. swimbladder Dissecting
- Yüksek vakum yağ ile bir 10 ml şırınga doldurun.
- % 2'lik bir LMA (agaroz E3 8 ml düşük erime 160 mg adım 5.3) hazırlayın.
- İstediğiniz anda, balık (adım 5.2) uyuşturan.
- Transferi 10 E3, 1 ml ile 1.7 ml santrifüj tüpüne balık ve santrifüj tüpüne 4 mg / ml 'Tricaine (nihai konsantrasyon 800 mg / ml) 200 ul ilave edildi ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edilerek euthanize.
- Bir mikroslayd (75 x 25 mm, Şekil 2) 1 cm arayla, bir meydanda vakum gres 4 damla koyarak bir görüntüleme cam slayt hazırlayın.
- Meydanın ortasında% 2 LMA 2 damla yerleştirin.
- Bir mikroskop altında ayrı bir cam slayt bir balık yerleştirin ve kalp atışlarımı durduğundan emin olun, aşırı su çıkarmak.
- Sindirim sisteminden ayıran, sol cımbız ile pnömatik kanal tarafından swimbladder Pick up ve katılaşır önce% 2 LMA merkezine yerleştirin.
- Görüntüleme cam slayt üstüne bir kapak kayma (18 x 18 mm) yerleştirin ve vakum gres yanı sıra, LMA (Şekil 2) dokunana kadar itin.
- Diseksiyon 10 dakika içinde Resim aşama 6.4'te tarif edildiği gibi. Adımı tekrarlayın 7,7-7,11 diğer balık.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Posterior statik taşıma içinde Mikroenjeksiyon
Burada sunulan deneysel yöntem C tutarlı bir doz enjeksiyon açıklar zebrabalıkları dpf 4 statik taşıma albicans maya hücreleri. Daldırma modeli ile Önceki iş önerdiği C swimbladder immün yanıt Candida albicans, memeli mukozal kandidiyazis 32 benzerdir. Burada daha basit, tekrarlanabilir ve hızlı bir modifiye enfeksiyon yöntemi göstermektedir; zebrabalıkları bir kaç yüz enjekte edilmiş ve bir kaç saat içinde taranabilir.
Statik taşıma doğru ve tekrarlanabilir bir enfeksiyon mikroenjeksiyon organın arka bölgeyi hedef tarafından gerçekleştirilir. Statik taşıma içine enjeksiyon larva veya embriyonik zebrafish (örneğin, intravenöz veya Beyin ventrikül) için diğer birçok mikroenjeksiyon yolları öğrenmekten daha kolaydır. enjeksiyondan önce balık hazırlanması simi olanBalık eski böylece swimbladder ihtiyacı olduğunu hariç diğer enjeksiyon siteleri için buna lar, şişirilmiş edilecek. 33 ° C'de yükseltilmiş balık yaklaşık% 75 4 dpf ile şişirilmiş bir swimbladder var (veriler gösterilmemiştir). swimbladder balık enjekte etmek için kullanılan bir epidermal yanı sıra ince kas tabakası ve mikro-iğne altında bulunan eğimli olması gerekir. Balık enjekte edildiği açı (Şekil 3A) da büyük ölçüde işlemin hızı ve kolaylığını da iyileştirir. Bu tarama, tüm maya hücrelerinin görselleştirme sağlar ve seçim aralığı saptıracaktır statik taşıma her iki tarafında maya hücrelerinin varlığını önler olarak statik taşıma arka bolus enjeksiyon önemlidir. Statik taşıma arkasına doğru enjekte da pnömatik kanal boyunca ve daha sonra sindirim sistemi aşağı inokulum olası kaybını önler. Bolus hava kabarcığı ve yerinden olarak enjekte edilmiştir balık doğrulanıyor nispeten kolaydırLütfen statik taşıma ve daha sonra ortam (Şekil 3C) ile doldurulur. Bu enjekte ederken görselleştirme kolaylaştıracak olan, fenol kırmızı kullanmak da mümkündür. Çünkü C büyüklüğü albicans maya hücreleri (3-4 um), aşılama dozu bağlı olarak mikro-iğne tıkanması mi, 5 x 10 7 cfu / altındaki konsantrasyonlarda sınırlıdır. Bu 5 nl kapsül içinde bir ila 250 maya hücrelerinin enjeksiyonu sağlar. Bizim ellerde, 1-1.5 x 10 7 cfu 4 nl enjekte / ml, en tutarlı sonuçlar vermiştir. Bu balık başına 10-50 maya hücrelerinin bir dizi elde edilmiştir. 15-25 maya hücreleri (Şekil 3B) için inokulum Narrowing sıkı fenotip ve tepki verir. Bu koşullar kullanılarak, enjekte balık yaklaşık olarak% 50 (verileri gösterilmemiş olan)% 95 yaşam, 24 saat sonra, enjeksiyon ile, uygun inokulum aralığı vardır. Bu üzerinde patojen yükünün etkisini araştırmak amacıyla bir düşük / yüksek inokulum ile balık tutmak da mümkündürHastalık gelişme.
swimbladder (400 x 200 x 200 mm, L x Y x G, bir elips hacmi için formül kullanılarak) yani yüksek hacimli enjeksiyon da mümkündür yaklaşık 100 nl toplam hacmi (4 nl 3 bakliyat kadar olmuştur balık hayatta kalma üzerinde önemli bir etkisi olmaksızın kullanılabilir; veriler gösterilmemiştir).
Bireysel balık Boyuna intravital görüntüleme host ve patojen davranışı hem de takip
ev ve hem de patojen davranışı bu model kullanılarak birkaç gün boyunca non-invazif takip edilebilir. Görüntünün yeteneği in vivo yüksek çözünürlükte enfeksiyon gelişimi ve mukozal kandidiyazis patogenezini incelemek için kullanılır olmuştur yapabilirsiniz. Nötrofiller farelerde ve insanlarda 35-38 olarak kandidoz karşı dirençte önemli bir rol oynamaktadır. Kullanma MPO GFP zebra balığı 39 (nötrofiller, yeşil floresan proteini ifade), ve C. albicans dTom ifadekırmızı floresan proteini 32 ato, biz erken enfeksiyon (Şekil 4) sırasında nötrofil Candida dinamikleri gözlemledik.
Nötrofiller mukozal enfeksiyon sitesine işe ilk doğuştan hücre tipi ve canlı C ile statik taşıma enfeksiyonu olan albicans nötrofillerin (Şekil 4A, B), bir hızlı ve sürekli bir işe yol açar. Isı-ölümlü maya hücreleri (Şekil 4A, B) enjekte edildiğinde İlginç bir şekilde, nötrofil esas olarak statik taşıma işe değildir.
Filamentler maya hücreleri ve C enjeksiyonundan sonra hızla geliştirmek albicans ilk 48 saat sonrası enjeksiyon (hpi) için çimlenmeye devam ediyor. Bununla birlikte, filamanların sayısı azalır Bu noktada (Şekil 4D) ve maya oranı artarken daha sonra (gösterilmemiş olan). yetenek, bireysel balık, non-invaziv bu uzunlamasına çalışmaları olanak takip etmek (24-plakadoku kültürü yemekleri) ve hastalığın ilerlemesi ve ev sahibi yanıtları (Şekil 4C) bireysel farklılıkları vurgular. Birkaç gün boyunca enfeksiyon yerinde mantar ve bağışıklık hücreleri numaralandırma Bu ayrıntılı çalışmalar farede pratik kalır.
Hızlı bir swimbladder diseksiyon tekniği görüntüleme artırmak için
C ile bağışıklık veya epitel hücrelerinin etkileşimi görüntüleme Candida albicans, burada sunulan modelinde görece kolaydır. Ancak, bazı durumlarda, hava kabarcığı varlığı ve swimbladder, cilt ve kasların çevreleyen doku kalınlığı, ayrıntılı uzaysal çözünürlüğü uzlaşma. Görüntü kalitesini artırmak için biz konfokal mikroskobu (Şekil 5A) tarafından (10 dakika içinde) Zebra balığı ve hızla görüntünün onu dışarı swimbladder incelemek için bir yöntem geliştirdik. Floresan yayg ifade transgenik balık hatları görüntüleme Bu özellikle yararlıdırGFP 40 veya α-katenin: sitrin hatları 41,42 (Şekil 5B, C) ve NF-KB gibi çevre dokularda yabancı floresan vardır. tekniği hızla gerçekleştirmek için maharet ve pratik gerektirir, ama teşebbüs tüm balık tamamen görüntü% 95 ile mümkündür.
Şekil 1: swimbladder enjeksiyon için Mikro-iğne şekli. Mikro-iğne, şekil ve ölçü (A), genel bir bakış. A. mikro iğne ucu (B) Büyütme b her biri büyük dikey çizgi dışında 0,2 mm arasındadır.
Şekil 2: slayt Görüntüleme. % 2 LMA açılan bir cam slayt 1 cm aralıklı vakum gres, 4 nokta ortasına yerleştirilir. disseCTED swimbladder LMA ortasına yerleştirilir ve LMA ve vakum gres ile temas edinceye kadar bir kapak kayma üstüne indirilir.
Şekil 3: statik taşıma C. albicans enjeksiyonu enjeksiyon yerinde lokalize kalır. (A), zebra balığı larvası dpf 4'te statik taşıma arkasına C albicans enjekte mikro iğne yönlenme ve konumdan şematik. (B) epifloresans mikroskobu ile 15-25 maya hücrelerinin enjeksiyonu bolus seçildikten sonra Örnek aşılama balık 3 farklı gruplar için. C, n = grup, A, B, ve sırasıyla C sıcaklıkta 17, 17 ve 20. (C), Örnek görüntüler, ortalama ve standart ortalama hatası temsil edilir albicans enjeksiyonundan hemen sonra AB çocuk zebrabalıkları enfeksiyonu (CaF2-dTom, kırmızı floresan Candida ifade)ction. Görüntüler (sırasıyla sol ve sağ paneller) 10X ve 20X hedefleri ile edinilen ve DIC kanal tek bir dilim kırmızı kanal (12 ve 19 dilim, sırasıyla) maksimum projeksiyonlar bileşiklerdir edildi. Hava kabarcığı (sarı) ve epitel astar (beyaz) Anahat sol panelde temsil edilmektedir. Ölçek çubukları 250 ve 50 mikron temsil sırasıyla. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4: swimbladder enjeksiyon konak patojen dinamikleri uzay-zamansal diseksiyon için izin verir. (A) mpo Temsilcisi görüntüleri: 4 dpf'e statik taşıma canlı veya ısı öldürüldü (HK) CaF2-dTom enjekte ve GFP balık hattı 48 HPI görüntülenmiş. Görüntüler yeşil a maksimum projeksiyon bileşiklerdirnd kırmızı kanalları (20 dilim) ve DIC kanal tek bir dilim. Ölçek çubukları 100 um temsil eder. (B, C). C yanıtı ev sahipliği albicans enfeksiyonu. Nötrofiller gibi erken 6 HPI olarak enfeksiyon (SOI) sitesine işe ve 48 saat boyunca sayısında artış devam edilir. görüntü imkanı ve (24-plaka) ayrılmış bireysel balık tutmak detaylı bağışıklık dinamikleri görüntülenmiştir için izin verir. (D) Patojen yanıtı. C albicans maya hücreleri ilk 24 HPI için çimlenme ama 24 HPI maya hücrelerine dönmek vardır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5: ince detaylar yansıması için statik taşıma diseksiyonu izin verir. T (A) şematik temsiliO 4-5 dpf zebrafish statik taşıma diseksiyonu müdahil adımları. Mavi oklar cımbız (Hakkı Sol için L ve R) ile çekerek yönünü gösterir. (B, C). Α-katenin disseke statik taşıma Temsilcisi görüntüleri: sitrin misina 41,42 (yeşil sıkı kavşaklar) C. albicans ile 4 dpf (CaF2-dTom) enjekte ve konfokal mikroskopi 2 HPI tarafından görüntülendi. Paneller, kırmızı ve yeşil kanallar maksimum projeksiyonlar kompozitler (B 25 dilim ve C için 3 dilim) ve paneli B. Ölçeği barlarda DIC için tek bir dilim olan B 100 mikron ve 100 mikron ve C 10 mikron Lütfen Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
| Hacim (nl) | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| Çap (mm) | 0.124 | 0.156 | 0.179 | 0.197 | 0.212 |
Tablo 1: çap ilişkisi Bolus hacmi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Swimbladder mikroenjeksiyon hastalığı modeli Gelişmeler ve sınırlamaları
Burada sunulan model Gratacap et al mukozal kandidiyaz daldırma modelinin bir uzantısıdır (2013).; Bu kontrollü bir enfeksiyon zaman avantaj, yüksek ölçüde tekrarlanabilir enfeksiyon dozu ve bu nedenle geliştirilmiş verimlilik ekler. Biz burada non-invaziv ayrıntılı olarak enfeksiyon dinamikleri zamansal belgeleri yanı sıra statik taşıma yüksek çözünürlük ex vivo görüntüleme izin yeni yöntemler göstermektedir. Bu prosedürler C çalışma kolaylaştırmalıdır albicans mukozada bağışıklık sistemi etkileşim dinamikleri -innate. Mukozal enfeksiyon modellerinde sınırlı sayıda zebrabalıkları tarif edilmiştir, tüm sindirim sistemi bozukluğu / enfeksiyon 24,43 sınırlayıcı. Burada sunulan swimbladder modeli akciğere bazı benzerlikler paylaşan ve sınırlı bir siteyi sunan bir organa enfeksiyon siteleri uzanırpatojenin az imkanı ile enfeksiyon, bir uzak yıkanacak.
Bu teknikleri mastering dikkate alınması gereken birkaç kritik faktörler vardır. En önemli nokta şişirilmiş bir statik taşıma için gerekliliktir. Bu 33 ° C'de 28 ° C veya 4 dpf'e yetiştirilen zaman 5 dpf'lik yaş için balık gerektirir Bu yüksek sıcaklık balık gelişimini hızlandırmak ve daha iyi memeli epitel sıcaklıklarda (fare deri sıcaklığı ° C 44 33.1 °) fizyolojik aralığını tahmin etmek için kullanılır. Ancak, bu sıcaklık aralığı bu modelin sınır akılda tutulmalıdır ve gözlenen fenotipleri daha tam yorumlanması için bir memeli sistemi içinde kontrol edilmesi gerekir gerekmektedir. pnömatik kanal physostomous balık açık kalır (zebrafish içerir) ve enjeksiyon sitesi (posterior swimbladder), aynı zamanda kritik, yüksek basınçlı enjstatik taşıma geçmiş ve sindirim sistemi içine patojen zorlayabilir organda başka ection. Gövde balık kalınlığı zor statik taşıma her iki tarafını da görselleştirmek için hale getirir, çünkü, maya hücreleri, statik taşıma arka tüm ise aşı miktarının belirlenmesi, aynı zamanda daha az hassastır. Statik taşıma diseksiyonu maharet gerektirir ve görüntüleme usulüne fiziksel travma eserler önlemek için hemen sonra gerçekleşmesi gerekiyor.
tekniğin sınırlamaları balık gelişim aşamasında esas ilişkilidir. Bu çalışmanın bir kaç gün morfolino teknoloji kullanımını sınırlayan, ve demonte etkinliği dikkatle tam veya kısmi etkinlik arasında ayrım için test edilmelidir. Morfolino etkinlik geliştirme bu geç daha önce rapor edilmiştir, ve biz de başarılı 5 dpf'e yine etkili geldi doğrulanmış bağlayıcı engelleme ile, bu modelde morpholinos kullandık. Pharm kullanımıbalık yaş için herhangi bir kısıtlama olmadığı için acological ilaçlar bu modelle iyi bir alternatif olabilir. 72 saat sonra döllenme geçmiş balık kullanımı bazen, larva zebrafish ile çalışan kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı komiteleri bağlı daha fazla gözetim gerektirir. Zebra balığı statik laboratuvar koşullarında 45 fazla 10 gün yüksek oranlarda hayatta yok gibi çalışmanın uzunluğu da, sınırlıdır. Diğer taraftan, bunun yerine daha küçük embriyolar ya da larva gelişimi dpf 5 çocuk balık kullanılarak örneğin böbrek, karaciğer ve pankreas gibi organların her biri 46-49 tamamen fonksiyonel çalışmalar için izin verir. In vitro hücre kültüründe ya da in vivo murin modellerinde karşılaştırıldığında, (antikorlar ve kimyasal antagonistleri-agonistler) reaktif maddelerin sayısı zebrabalıkları sınırlıdır; Bununla birlikte, ortam doğrudan kimyasal ekleme imkanı bir avantajdır. nakavt ve knock-in Zebra balığı sayısı hala sınırlı ama ris olanhedeflenen genom düzenleme e mutantlar nesil için heyecan verici olanaklar açar. göreceli olarak kolay kombinasyonu flüoresan raportör hatları (hücre tipi özel ya da yola özel sinyalleme) çocuk zebrabalıkları saydamlığı, bu sistemin primer ve benzersiz avantajlar kalır oluşturmak için yerleştirildi.
Ileriye dönük
Zebra balığı swimbladder enfeksiyon modeli epiteli ile istila diğer patojenlerin enfeksiyon yeni bir rota sunan ve omurgalı hastalığı tarama için bu organın programı vurgulayarak, omurgalı mukozal epitel de konak-patojen etkileşimi hakkında sorular olabilir soru yelpazesini genişletiyor .
Mukoza düzeyinde epitel enfeksiyon balığı modelleri ilaçlar ya da patojen 24,43 intestinal sistem girişim etkilerini araştırmak olduğu yayınlanmıştır. Ancak, bu mukozal kandidiyazis modeli swimb kullanan ilkmerdiven ve bu nedenle sindirim sistemi dışında zebrabalıkları araştırılabilir enfeksiyon bölgelerinde aralığını genişletir. Swimbladder mukoza yüzeyi ve memeli akciğer arasındaki farklar tam olarak aydınlatılamamıştır ve daha yüksek bir omurgalıyı Bu modelde elde edilen verilerin yorumlanması / için dikkatli bir şekilde yapılmalıdır.
swimbladder enfeksiyonu omurgalı enfeksiyon modellerinde geçerli bir boşluğu doldurur ve bir patojen ile doğuştan gelen bağışıklık / epitel hücreleri etkileşimlerini görüntülenmesi için bir pencere açılır. Şimdi daha önce yasak sorular, çeşitli bir yelpazede, keşfetmek mümkündür. Biz birbirleri ile ve epitel hücreler, kendi uzay-zamansal işe farklı doğuştan gelen bağışıklık hücreleri etkileşimlerini belirlemek ve C doğası olabilir albicans çoğalması olmayan bir bağışıklık sisteminde bir konakçıdaki bağışıklık saldırıları ve hastalığın ilerlemesine göre morfolojik değiştirme. görüntü imkanı gre gün için bir kaç saat için bir dokunulmamış konukçudetay bu sistemin açık ve büyük bir avantaj sağlar.
Son olarak, statik taşıma ve memeli akciğer arasında ontolojik ve gen sentezleme benzerlikler, gen devirme veya kimyasal ilaçlar ile bu organı hedef mikrobiyal akciğer etkileşim ve immünoloji 50-52'nin korunmuş sırlarını olabileceğini düşündürmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Yazarlar cömertçe α-katenin sağlamak için Dr. Le Trinh ve Dr. Tobin teşekkür: sitrin balık hattı ve Bill Jackman bize onun laboratuarında filme yapmak için izin için. Yazarlar fon kaynaklarını Ulusal Sağlık Enstitüleri (Hibeler 5P20RR016463, 8P20GM103423 ve R15AI094406) ve USDA kabul (Proje # ME0-H-1-00517-13). Bu yazının ana Tarım ve Ormancılık Deney İstasyonu yayın sayısı 3371 olarak yayınlanmıştır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 ml tubes | Axygen | MCT-175-C | |
| Deep Petri dishes | Fisher Scientific | 89107-632 | |
| Transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| Yeast Extract | VWR Scientific | 90000-726 | |
| Peptone | VWR Scientific | 90000-264 | |
| Dextrose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Agar | VWR Scientific | 90000-760 | |
| Fine tweezers (Dumont Dumoxel #5) | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Wooden dowels | VWR Scientific | 10805-018 | |
| Low melt agarose | VWR Scientific | 12001-722 | |
| Flaming Brown micropipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Borosilicate capillary | Sutter Instruments | BF120-69-10 | |
| MPPI-3 injection system | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | |
| Back pressure unit | Applied Scientific Instrumentation | BPU | |
| Micropipette holder kit | Applied Scientific Instrumentation | MPIP | |
| Foot switch | Applied Scientific Instrumentation | FSW | |
| Micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MM33 | |
| Magnetic base | Applied Scientific Instrumentation | Magnetic Base | |
| Tricaine methane sulfonate | Western Chemical Inc. | MS-222 | |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ61 top SZX-ILLB2-100 base | |
| Confocal microscope | Olympus | IX-81 with FV-1000 laser scanning confocal system | |
| 20X microscope objective | Olympus | UPlanSApo 20x/0.75 | |
| Roller drum | New Brunswick Scientific | TC-7 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Glass culture tubes (16 x 150 mm) | VWR Scientific | 60825-435 | |
| NaCl | VWR Scientific | BDH4534-500GP | |
| KCl | VWR Scientific | BDH4532-500GP | |
| MgSO4 | VWR Scientific | BDH0246-500GP | |
| HEPES (Corning) | VWR Scientific | BDH4520-500GP | |
| Children clay (Play-Doh) | Hasbro | ||
| CaCl2 | Fisher Scientific | C69-500 | |
| Methylene blue | VWR Scientific | VW6276-0 | |
| PTU | Sigma | P7629-10G | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Hemocytometer (Hausser scientific) | VWR Scientific | 15170-172 | |
| Type A immersion oil | Blue Marble Products | 51935 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Vortex Genie | VWR Scientific | 14216-184 | |
| Agarose (Lonza) | VWR Scientific | 12001-870 | |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374-500 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Fishing wire | Stren | ||
| 96 well imaging plate (Sensoplate) | Greiner Bio-One | 655892 | |
| High vacuum grease (Dow Corning) | VWR Scientific | 59344-055 | |
| Microslide (25 x 75 mm) | VWR Scientific | 48300-025 | |
| Cover slips (18 x 18 mm), No 1.5 | VWR Scientific | 48366-045 | |
| 15 cm Petri dish (Olympus plastics) | Genesee Scientific | 32-106 | |
| Glycerol (EMD chemicals) | VWR Scientific | EMGX0185-5 | |
| 24-well culture dish (Olympus plastics) | Genesee Scientific | 25-107 | |
| Weight boats (8.9 cm) | VWR Scientific | 89106-766 |
References
- Peterson, L. W., Artis, D. Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis. Nat Rev Immunol. 14 (3), 141-153 (2014).
- Elinav, E., Henao-Mejia, J., Flavell, R. A. Integrative inflammasome activity in the regulation of intestinal mucosal immune responses. Mucosal Immunol. 6 (1), 4-13 (2013).
- Sansonetti, P. J. To be or not to be a pathogen: that is the mucosally relevant question. Mucosal Immunol. 4 (1), 8-14 (2011).
- Tlaskalová-Hogenová, H., Stěpánková, R., et al. The role of gut microbiota (commensal bacteria) and the mucosal barrier in the pathogenesis of inflammatory and autoimmune diseases and cancer: contribution of germ-free and gnotobiotic animal models of human diseases. Cell Mol Immunol. 8 (2), 110-120 (2011).
- Pasparakis, M. Regulation of tissue homeostasis by NF-kappaB signalling: implications for inflammatory diseases. Nat Rev Immunol. 9 (11), 778-788 (2009).
- Scully, C., el-Kabir, M., Samaranayake, L. P. Candida and oral candidosis: a review. Crit Rev Oral Biol Med. 5 (2), 125-157 (1994).
- Reef, S. E., Lasker, B. A., et al. Nonperinatal nosocomial transmission of Candida albicans in a neonatal intensive care unit: prospective study. J Clin Microbiol. 36 (5), 1255-1259 (1998).
- Soll, D. R., Galask, R., Schmid, J., Hanna, C., Mac, K., Morrow, B. Genetic dissimilarity of commensal strains of Candida spp. carried in different anatomical locations of the same healthy women. J Clin Microbiol. 29 (8), (1991).
- Rindum, J. L., Stenderup, A., Holmstrup, P. Identification of Candida albicans types related to healthy and pathological oral mucosa. J Oral Pathol Med. 23 (9), 406-412 (1994).
- Mear, J. B., Gosset, P., et al. Candida albicans airway exposure primes the lung innate immune response against Pseudomonas aeruginosa infection through innate lymphoid cell recruitment and IL-22 associated mucosal response. Infect Immun. 82 (1), 306-315 (2013).
- Faro-Trindade, I., Willment, J. A., et al. Characterisation of innate fungal recognition in the lung. PLoS ONE. 7 (4), 35675 (2012).
- Wisplinghoff, H., Bischoff, T., Tallent, S. M., Seifert, H., Wenzel, R. P., Edmond, M. B. Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study. Clin Infect Dis. 39 (3), 309-317 (2004).
- Schaller, M., Zakikhany, K., Naglik, J. R., Weindl, G., Hube, B. Models of oral and vaginal candidiasis based on in vitro reconstituted human epithelia. Nat Protoc. 1 (6), 2767-2773 (2006).
- Weindl, G., Naglik, J. R., et al. Human epithelial cells establish direct antifungal defense through TLR4-mediated signaling. Clin Invest. 117 (12), 3664-3672 (2007).
- Moyes, D. L., Runglall, M., et al. A biphasic innate immune MAPK response discriminates between the yeast and hyphal forms of Candida albicans in epithelial cells. Cell Host and Microbe. 8 (3), 225-235 (2010).
- Conti, H. R., Shen, F., et al. Th17 cells and IL-17 receptor signaling are essential for mucosal host defense against oral candidiasis. J Exp Med. 206 (2), 299-311 (2009).
- Hise, A. G., Tomalka, J., et al. An essential role for the NLRP3 inflammasome in host defense against the human fungal pathogen Candida albicans. Cell Host Microbe. 5 (5), 487-497 (2009).
- Gladiator, A. A., Wangler, N. N., Trautwein-Weidner, K. K., Leibundgut-Landmann, S. S. Cutting Edge: IL-17-Secreting Innate Lymphoid Cells Are Essential for Host Defense against Fungal Infection. J Immunol. 190 (2), 521-525 (2013).
- Hess, I., Boehm, T. Intravital imaging of thymopoiesis reveals dynamic lympho-epithelial interactions. Immunity. 36 (2), 298-309 (2012).
- Roca, F. J., Ramakrishnan, L. TNF Dually Mediates Resistance and Susceptibility to Mycobacteria via Mitochondrial Reactive Oxygen Species. Cell. 153 (3), 521-534 (2013).
- Tobin, D. M., Vary, J. C., et al. The lta4h locus modulates susceptibility to mycobacterial infection in zebrafish and humans. Cell. 140 (5), 717-730 (2010).
- Cambier, C. J., Takaki, K. K., et al. Mycobacteria manipulate macrophage recruitment through coordinated use of membrane lipids. Nature. 505 (7482), 218-222 (2014).
- Semova, I., Carten, J. D., et al. Microbiota regulate intestinal absorption and metabolism of fatty acids in the zebrafish. Cell Host and Microbe. 12 (3), 277-288 (2012).
- Rendueles, O., Ferrières, L., et al. A new zebrafish model of Oro-intestinal pathogen colonization reveals a key role for adhesion in protection by probiotic bacteria. PLoS Pathog. 8 (7), 1002815 (2012).
- Field, H., Ober, E., Roeser, T., Stainier, D. Formation of the digestive system in zebrafish I. Liver morphogenesis. Dev Biol. 253 (2), 279-290 (2003).
- Field, H., Dong, P., Beis, D., Stainier, D.
- Sullivan, L., Daniels, C., Phillips, I., Orgeig, S., Whitsett, J. Conservation of surfactant protein A: evidence for a single origin for vertebrate pulmonary surfactant. J Mol Evol. 46 (2), 131-138 (1998).
- Oehlers, S. H., Flores, M. V., Chen, T., Hall, C. J., Crosier, K. E., Crosier, P. S. Topographical distribution of antimicrobial genes in the zebrafish intestine. Dev Comp Immunol. 35 (3), 385-391 (2011).
- Winata, C., Korzh, S., Kondrychyn, I., Zheng, W., Korzh, V., Gong, Z. Development of zebrafish swimbladder: The requirement of Hedgehog signaling in specification and organization of the three tissue layers. Dev Biol. 331 (2), 22-236 (2009).
- Zheng, W., Wang, Z., Collins, J. E., Andrews, R. M., Stemple, D., Gong, Z. Comparative transcriptome analyses indicate molecular homology of zebrafish swimbladder and mammalian lung. PLoS ONE. 6 (8), 24019 (2011).
- Galuppi, R., Fioravanti, M., Delgado, M., Quaglio, F., Caffara, M., Tampieri, M. Segnalazione di due casi do micosi della vescica natatoria in Sparus aurata e Carrassius auratus. Bollettino Societa Italiana di Patologic. 32, 26-34 (2001).
- Gratacap, R. L., Rawls, J. F., Wheeler, R. T. Mucosal candidiasis elicits NF-κB activation, proinflammatory gene expression and localized neutrophilia in zebrafish. Dis Model Mech. 6 (5), 1260-1270 (2013).
- Brothers, K. M., Gratacap, R. L., Barker, S. E., Newman, Z. R., Norum, A., Wheeler, R. T. NADPH oxidase-driven phagocyte recruitment controls Candida albicans filamentous growth and prevents mortality. PLoS Pathog. 9 (10), (2013).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (25), (2009).
- Anaissie, E. J., Bodey, G. P. Fungal infections in patients with cancer. Pharmacotherapy. 10 (6 pt 3), 1648-1698 (1990).
- Fidel, P. L., Barousse, M., et al. An intravaginal live Candida challenge in humans leads to new hypotheses for the immunopathogenesis of vulvovaginal candidiasis. Infect Immun. 72 (5), 2939-2946 (2004).
- Akova, M., Akalin, H. E., et al. Efficacy of fluconazole in the treatment of upper gastrointestinal candidiasis in neutropenic patients with cancer: factors influencing the outcome. Clin Infect Dis. 18 (3), 298-304 (1994).
- Farah, C. S., Elahi, S., et al. T cells augment monocyte and neutrophil function in host resistance against oropharyngeal candidiasis. Infect Immun. 69 (10), 6110-6118 (2001).
- Renshaw, S. A., Loynes, C. A., Trushell, D. M. I., Elworthy, S., Ingham, P. W., Whyte, M. K. B. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
- Kanther, M., Sun, X., et al. Microbial Colonization Induces Dynamic Temporal and Spatial Patterns of NF-κB Activation in the Zebrafish Digestive Tract. Gastroenterology. 141 (1), 197-207 (2011).
- Trinh, L. A., Hochgreb, T., et al. A versatile gene trap to visualize and interrogate the function of the vertebrate proteome. Genes Dev. 25 (21), 2306-2320 (2011).
- Trinh, L. A., Fraser, S. E., Moens, C. B. Zebrafish Neural Tube Morphogenesis Requires Scribble-Dependent Oriented Cell Divisions. Curr Biol. 21 (1), 79-86 (2011).
- Oehlers, S. H. B., Flores, M. V., et al. Expression of zebrafish cxcl8 (interleukin-8) and its receptors during development and in response to immune stimulation. Dev Comp Immunol. 34 (3), 352-359 (2010).
- Bast, D. J., Yue, M., et al. Novel murine model of pneumococcal pneumonia: use of temperature as a measure of disease severity to compare the efficacies of moxifloxacin and levofloxacin. Antimicrob Agents Chemother. 48 (9), 3343-3348 (2004).
- Davis, J., Clay, H., Lewis, J., Ghori, N., Herbomel, P., Ramakrishnan, L. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).
- Pack, M., Solnica-Krezel, L., et al. Mutations affecting development of zebrafish digestive organs. Development. 123, 321-328 (1996).
- Le Guyader, D., Redd, M. J., et al. Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish. Blood. 111 (1), 132-141 (2008).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F.
- Parichy, D. M., Elizondo, M. R., Mills, M. G., Gordon, T. N., Engeszer, R. E. Normal table of postembryonic zebrafish development: staging by externally visible anatomy of the living fish. Dev Dyn. 238 (12), 2975-3015 (2009).
- Noverr, M. C., Huffnagle, G. B. Does the microbiota regulate immune responses outside the gut. Trends in Microbiology. 12 (12), 562-568 (2004).
- Huffnagle, G. B.
- Kim, Y. -G., Udayanga, K. G. S., Totsuka, N., Weinberg, J. B., Núñez, G., Shibuya, A. Gut dysbiosis promotes M2 macrophage polarization and allergic airway inflammation via fungi-induced PGE2. Cell Host Microbe. 15 (1), 95-102 (2014).
