Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

الطريقة الجراحية لفيروسي وساطة جين التسليم إلى الأذن الداخلية الماوس من خلال جولة النافذة غشاء

Published: March 16, 2015 doi: 10.3791/52187
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, University of California, San Francisco

Abstract

العلاج الجيني، وتستخدم لتحقيق الانتعاش وظيفية من الصمم الحسي العصبي، وعود بمنح فهم أفضل للآليات الجزيئية والجينية الأساسية التي تساهم في فقدان السمع. ويجب أن يتم إدخال ناقلات في الأذن الداخلية بطريقة توزع على نطاق واسع وكيل في جميع أنحاء القوقعة مع التقليل من إصابة في الهياكل القائمة. توضح هذه المخطوطة نهج الجراحي بعد أذني التي يمكن استخدامها للماوس العلاج القوقعة باستخدام الجزيئية، الصيدله، والتسليم الفيروسي على الفئران يوم ما بعد الولادة 10 وكبار السن عبر النافذة غشاء الجولة (RWM). هذا النهج الجراحي يمكن التسليم السريع والمباشر إلى طبلة الأذن سكالا مع تقليل فقدان الدم وتجنب نفوق الحيوانات. هذه التقنية تنطوي على ضرر يذكر أو لا للهياكل الأساسية في الأذن الداخلية والوسطى وكذلك عضلات الرقبة بالكامل مع الحفاظ على السمع. للتدليل على فعالية هذه التقنية الجراحية، وglutam حويصليأكل نقل ستستخدم 3 خروج المغلوب (VGLUT3 KO) الفئران كمثال على نموذج الفأر من الصمم الخلقي أن يسترد السمع بعد الولادة من VGLUT3 إلى الأذن الداخلية باستخدام فيروس الغدة المرتبطة (AAV-1).

Introduction

منذ فترة طويلة واقترح العلاج الجيني كعلاج محتمل لفقدان السمع الوراثية، ولكن ظلت النجاح في هذا المجال بعيد المنال 1. حتى الآن، وقد سادت منهجيات بوساطة فيروسي بسبب القدرة النظرية لاستهداف أنواع معينة من الخلايا داخل القوقعة التي يتعذر الوصول إليها نسبيا. وقد استخدمت كل من اتش (AV) وفيروس الغدة المرتبطة (AAV) لتوصيل الجينات القوقعة. AAVs هي مفيدة في القوقعة لعدد من الأسباب. وهي فيروسات النسخ ناقصة ويمكن نقل الجزيئات المعدلة وراثيا بكفاءة لأنواع مختلفة من الخلايا بما في ذلك الخلايا العصبية، هدف هام لعدد من الأسباب المؤدية إلى فقدان السمع. وتوسطت دخول AAV في الخلية التي كتبها مستقبلات محددة 2. وبالتالي، يجب أن يكون اختيار النمط المصلي خاص متوافق مع أنواع الخلايا إلى أن transduced. يمكن AAVs بالنقل فعال خلايا الشعر (3) وتدرج في الجينوم المضيف، مما أدى إلى مستقر، والتعبير على المدى الطويل من هيئة تنظيم الاتصالاتnsgenic البروتين والتغير المظهري في الخلية 4. في حين لا فائدة بالضرورة لتطبيقات قصيرة الأجل مثل تجديد خلايا الشعر، والتعبير على المدى الطويل هو مهم جدا لإنقاذ مستقر من عيوب وراثية. لأن لا ترتبط AAVs مع أي مرض أو عدوى الإنسان وإظهار أي تسميم أذني 5،6،7، فهي مرشحا مثاليا للاستخدام في العلاج الجيني لأشكال الموروثة من فقدان 8 السمع.

وقد تمت دراسة نقل المادة الوراثية الخارجية إلى الأذن الداخلية الثدييات باستخدام ناقلات فيروسية خلال العقد الماضي، ويبرز بوصفه تقنية واعدة لعلاج أشكال كلا الوراثية والمكتسبة للخسارة 9 السمع. القوقعة يحتمل أن تكون هدفا مثاليا للعلاج بالجينات لعدة أسباب: 1) يتطلب حجمه صغير كمية محدودة من الفيروس الحاجة؛ 2) عزلتها النسبية عن غيرها من آثار حدود أجهزة الجسم الجانب. و3) غرف مملوءة بسائل في تسهيل الفيروسيةتسليم جميع أنحاء المتاهة 10، 11،12،13،14، 15.

نماذج الماوس من الصمم الخلقي تسمح لاستخدام العديد من أساليب الدراسة إلى رصد التنمية في الأذن الداخلية و بطريقة قابلة للتكرار منهجية. في حين أن صغر حجم الماوس القوقعة لا يقدم بعض الصعوبة الجراحية، ويعمل الماوس باعتبارها نموذجا هاما للغاية في دراسة فقدان السمع الوراثية، مع العديد من المزايا التجريبية على الأنواع الأخرى (16). نماذج الماوس تسمح بتقييم مجموعة من الخصائص من خلال التحليل الجيني الربط، وجمع من الملاحظات الشكلية مفصلة، ​​ومحاكاة سيناريوهات المسببة للأمراض. على هذا النحو، فهي مرشحة جيدة للعلاج بالجينات بوساطة فيروسي. جعلت الدراسات الجينية واسعة في الفئران جنبا إلى جنب مع التقدم التكنولوجي من الممكن لتوليد الفئران المعدلة وراثيا بطريقة استنساخه في المختبرات 17،18، 19، 20،21. Furthermorه، توجد العديد من النماذج على حد سواء المكتسبة والموروثة سماع الظواهر الخسارة في الفئران، مما يسمح للاختبارات صارمة في هذا النموذج الحيواني 22، 23،24. وهكذا، وتصحيح السمع باستخدام العلاج الجيني بوساطة فيروسي في نموذج الفأر هو خطوة أولى المناسبة في البحث عن علاج لمرض البشري.

لقد أظهرنا سابقا أن الفئران المعدلة وراثيا التي تفتقر إلى نقل الغلوتامات حويصلي 3 (VGLUT3) يولدون الصم بسبب عدم الإفراج الغلوتامات في IHC الشريط المشبك 25. لأن هذه الطفرة لا يؤدي إلى انحطاط الأساسي للخلايا الشعر الحسية، هذه الفئران الطافرة يمكن أن تكون نموذجا ممتازا فيها لاختبار العلاج الجيني قوقعة لفقدان السمع الخلقية.

حتى الآن، وقد وصفت عدد من التقنيات تسليم الفيروسية للعلاج بالجينات القوقعة، بما في ذلك جولة نشر نافذة الغشاء، مستديرة حقن نافذة الغشاء، والتسليم عن طريق فغر القوقعة. هناك قويةمزايا وعيوب كل من هذه الأساليب 9 الاتحاد العالمي للتعليم.

نحن هنا الإبلاغ عن طريقة جراحية للتوسط فيروسي توصيل الجينات إلى الأذن الداخلية VGLUT3 KO الماوس من خلال النافذة غشاء الجولة (RWM). وبعد أذني طريقة الحقن RWM هو الغازية الحد الأدنى مع الحفاظ على جلسة ممتازة، وسريع نسبيا. كما نشرنا سابقا، في محاولة لاستعادة السمع في هذا النموذج الماوس، تم إدخال ناقلات AAV1 تحمل الجين VGLUT3 (AAV1-VGLUT3) في القوقعة من هذه الفئران صماء في يوم ما بعد الولادة 12 (P! @)، مما أدى إلى استعادة السمع 26. السمع في الفئران VGLUT3 KO تم التحقق من استجابة الدماغ السمعية (ABR)، في حين تم التحقق من البروتين التحوير التعبير باستخدام المناعي (IF). وهكذا يوضح هذه المنهجية أن العلاج الجيني بوساطة فيروسي يمكن أن تصحح الخلل الجيني التي من شأنها أن يؤدي خلاف ذلك في الصمم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: جميع الإجراءات والحيوان معالجة ينسجم مع المبادئ التوجيهية الأخلاق NIH ومتطلبات البروتوكول وافقت لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي من جامعة كاليفورنيا في سان فرانسيسكو.

1. إعداد الحيوان للجراحة

  1. تنفيذ العمليات الجراحية في نظيفة، ومساحة مخصصة. الأوتوكلاف جميع الأدوات الجراحية، وتعقيم للتعقيم الزجاج حبة قبل الجراحة.
    ملاحظة: في هذا البروتوكول، استخدم يوم بعد الولادة 10-12 (P10-12) الفئران FVB. مختلف الأعمار وسلالات من الفئران يمكن استخدامها لتلبية احتياجات مشروع معين. الفئران الأكبر سنا من P40 يمكن أن يكون تحديا لأن العظام الفقاعة أكثر صعوبة.
  2. تخدير الفئران مع حقن داخل الصفاق من خليط من هيدروكلوريد الكيتامين (100 ملغ / كلغ)، هيدروكلوريد زيلازين (10 ملغ / كلغ)، وآسيبرومازين (2 ملغ / كلغ). تبدأ التحضير الجراحي إلا بعد الحيوان لم يعد يستجيب للمؤثرات المؤلمة، مثل قرصة أخمص قدميه. اذا لزم الامرذ، إدارة جرعة معززة (خمس الجرعة الأصلية) من كوكتيل مخدر لاستعادة الطائرة مخدر الأصلية.
    ملاحظة: احرص على هذه الخطوة لأن معظم وفيات لوحظ في هذا العصر تسببها جرعة زائدة من مخدر.
  3. تغطية أعين الحيوان مع مرهم للعين وقائي للحفاظ على العينين رطبة أثناء التخدير، وقمع طرفة المنعكس الحيوان.
  4. ضع الماوس مع الرقبة امتدت على وسادة التدفئة في جميع أنحاء الإجراء حتى الفأر هو مستيقظا تماما، لمنع ما بعد التخدير، انخفاض حرارة الجسم.
  5. حلق منطقة ما بعد أذني اليسرى مع المقص وتعقيم مع الايثانول 70٪ وبوفيدون اليود قبل التلاعب الجراحي.

2. إجراء العمليات الجراحية والمتجهات حقن

  1. استخدام نهج ما بعد أذني لفضح الفقاعة الطبلية. شق النسيج تحت الجلد مع مقص صغير لفضح العضلات بعد أذني. بعد التراجع في الأنسجة الدهنية إلى thالبريد الجانب الخلفي من شق، فصل العضلات على الجانب الأيمن والأيسر عمودي على شق لفضح العظم الصدغي. تأكد من أن هذا الشق طويلة بما فيه الكفاية للعمل بشكل مريح مع التصور الملائم.
  2. خرم الفقاعة الطبلية مع 25 G إبرة وتوسيع ثقب عند الضرورة مع ملقط عن طريق تقشير العظم الخلفي للسماح بالوصول إلى بدوره القاعدية من القوقعة، ومن ثم توسيع بما فيه الكفاية لتصور الشريان الركابي والغشاء النافذة المستديرة (RWM) .
  3. ثقب RWM بلطف في وسط مع ماصة البورسليكات الشعرية. نلاحظ هروب رأس المال السائل من خلال RWM في هذه المرحلة. وهذا أمر طبيعي. انتظر حتى استقر هروب رأس المال (تجفف السائل effluxed من القوقعة مع ورق الترشيح العقيمة).
    ملاحظة: خذ الحيطة والحذر عند عقد ودفع الإبرة الزجاج بحيث ثقب RWM صغير بقدر الإمكان. اعتمادا على المجهر المستخدمة، عقد ماصات باستخدام لمياداة مجهرية أو باليد باستخدام ماصةحامل.
  4. إعداد ماصات للحقن باستخدام ماصة مجتذب يتم إعدادها بنفس الطريقة الماصات المشبك التصحيح. تأكد من أن قطر الحافة هو كبير (حوالي 15 ميكرون في القطر) بحيث pipetting لفيروس الدخول والخروج من السهل القيام به.
  5. وضع 1 إلى 2 ميكرولتر من AAV1-VGLUT3، AAV1-GFP أو AAV2-GFP إلى ماصة الحقن. بعد استقرار هروب رأس المال (من 5 إلى 10 دقيقة)، microinject هذا الحجم ثابت في طبلة الأذن سكالا خلال نفس الحفرة جعلت سابقا في RWM.
  6. ختم المتخصصة RW بسرعة بعد سحب ماصة مع المكونات صغيرة من العضلات وضمان الحصول عليها مع قطرة صغيرة من مادة لاصقة وضعت على الأنسجة العضلية لتجنب تسرب من النافذة المستديرة.
    ملاحظة: ختم هذا الثقب بشكل جيد للغاية بعد إزالة الإبرة مع المكونات صغيرة من العضلات لمنع أي تسرب اللمف المحيطي من القوقعة-هذه الخطوة أمر بالغ الأهمية للحفاظ على السمع. والفشل في التوصل تماما فإن RWM يؤدي إلى فقدان السمع مع مرور الوقت.
  7. بعد الحقن، تغطيةثقب في الفقاعة السمعية مع الأنسجة الدهنية، والعودة العضلات بعد أذني والأنسجة الدهنية إلى وضعها الطبيعي وخياطة الجرح في طبقات مع 6-0 أو أصغر خياطة الكروم للامتصاص.
  8. تطهير الجرح مع بوفيدون اليود.

3. بعد العملية الجراحية العناية

  1. وضع الفئران في قفص دافئ وليس تركهم دون مراقبة حتى تعافى تماما أنهم ثم نقلها مرة أخرى مع الأم. فمن المستحسن لإزالة الذكور من القفص قبل وضع الجراء مرة أخرى مع الأم.
  2. إدارة تحت الجلد كاربروفين (2 ملغ / كلغ) لتسكين الألم بعد العمل الجراحي وكل 24 ساعة بعد ذلك لمدة 3 أيام، لإدارة الالتهاب والألم. مراقبة الحيوانات يوميا بحثا عن علامات الضيق، وفقدان الوزن غير طبيعية، والألم، أو العدوى. عموما اليوم 3 الثالثة بعد الجراحة جميع الفئران يجب أن يتصرف بشكل طبيعي. في حالة ظهور أي علامات على الضيق أو المرض في الماوس بعد اليوم 3 الثالثة، والنظر في القتل الرحيم رانه الماوس وفقا لتوجيهات المؤسسية.

4. تقييم من وظيفة القوقعة بعد التسليم الفيروسي عن طريق الدماغ السمعية الاستجابة (ABR) تسجيلات

ملاحظة: استجابة الدماغ السمعية (ABR) هي أثار والسمعية إمكانات المستخرجة من النشاط الكهربائي المستمر في الدماغ وسجلت عن طريق أقطاب كهربية وضعت تحت فروة الرأس. يتم تحفيز الحيوان مع الصوت. ويتكون تسجيل الناتجة من خمس موجات التي تعكس النشاط الكهربائي من النقاط المتتالية في مسار السمعي في ميللي ثانية 10 الأولى بعد ظهور حافز السمعي.

  1. تخدير الفئران عن طريق الحقن داخل الصفاق من خليط من هيدروكلوريد الكيتامين وزيلازين هيدروكلوريد كما هو موضح في القسم 1.2 من هذا البروتوكول، باستثناء دون آسيبرومازين.
  2. ضع الماوس على وسادة التدفئة في جميع أنحاء اختبار السمع حتى الفأر هو مستيقظا تماما، لمنع ما بعد التخدير، انخفاض حرارة الجسم.
    ملاحظة: استخدمالمنبهات الصوتية التالية في هذه التجربة: اضغط (5 ميللي ثانية مدتها؛ 31 معدل العرض هرتز).
  3. وضع أقطاب كهربائية إبرة تحت الجلد في قمة الرأس، وتحت الصيوان من الأذن اليسرى (المرجع)، وتحت الأذن المقابل (الأرض) والبدء ABRs تسجيل كما هو موضح سابقا في غرفة عازلة للصوت 27،28. سجل الطول الموجي ABR في 5 فترات ديسيبل مستوى ضغط الصوت منخفضا من أقصى السعة.
  4. تحديد عتبات ABR بعد العمل الجراحي في أقرب وقت 4 أيام بعد الولادة الفيروسي
    يتم تعريف عتبة كمستوى أدنى التحفيز التي استجابة قمم للموجات I-V من الواضح والحاضر مرارا وتكرارا على الفحص البصري: ملاحظة.
  5. قياس الموجة I لتحليل النشاط من العصب القوقعي. يتم تعريف أدنى مستوى التحفيز التي تعطي ABR الموجي كشفها كما العتبة.

5. القوقعة التعبير التحوير البروتين عن طريق المناعي

  1. تخدير الفئران عن طريق جرعة زائدة من intrapحقن eritoneal من خليط من هيدروكلوريد الكيتامين وزيلازين هيدروكلوريد النحو الموضح في القسم 1.2 من هذا البروتوكول، باستثناء دون آسيبرومازين.
  2. قطع رأس رئيس إلا بعد الحيوان لم يعد يستجيب للمؤثرات المؤلمة، مثل قرصة أخمص قدميه.
  3. تشريح للقوقعة بها وعملية لجبل لالجامع المناعي كما هو موضح 26. يوصف بروتوكول مفصل من قوقعة كله يشن المناعي باستخدام مكافحة VGLUT3 والأجسام المضادة 7A مكافحة الميوسين في عقيل وآخرون. 2013 29.
  4. لوضع العلامات GFP، احتضان قوقعة يتصاعد كلها بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية مع الأرنب مكافحة GFP الأجسام المضادة في 1: 250 التخفيف.
  5. شطف القوقعة مرتين لمدة 10 دقيقة مع برنامج تلفزيوني ثم احتضان لمدة 2 ساعة في الماعز المضادة للأرنب مفتش مترافق إلى Cy2 المخفف 1: 4،000 في برنامج تلفزيوني.
  6. شطف القوقعي مع برنامج تلفزيوني مرتين لمدة 10 دقيقة واحتضان لهم دابي لمدة 15 دقيقة.
  7. تركيب القوقعة على الشرائح الزجاجية ومراقبة اوندإيه المجهر مع المناعي متحد البؤر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

للتحقق من الخصائص التقنية وفائدة النهج بعد أذني لعلاج الجزيئي القوقعة، تم تسليم AAV1-VGLUT3، AAV1-GFP وAAV2-GFP في الفئران P10-12 الأذن الداخلية عن طريق RWM. هذا النهج يوضح الناجح التعبير التحوير في خلايا الشعر الداخلية (IHC) (VGLUT3 الشكل 1 و 2 و GFP الشكل GFP الشكل 3A)، وخلايا الشعر الخارجي (OHC) (GFP الشكل 2) والخلايا الداعمة (GFP الشكل 2 والشكل 3A) 26 دون جهاز كبير من الإصابات كورتي. مراقبة أنواع مختلفة من الخلايا معربا عن GFP ينظر في الصور المناعي كلها جبل قوقعة (الشكل 2 والشكل 3A) يوضح أن اختيار AAV المصلي يجب أن تكون متوافقة مع أنواع الخلايا إلى أن transduced الشكل 1، الشكل 2 والشكل 3A 26 مشاهدة TR جيد جداansfection في كل من IHCs وOHCs، فضلا عن توزيع البروتين التحوير (GFP / VGLUT3) في جميع أنحاء القوقعة بعد AAV1 أو AAV2-GFP أو AAV1-VGLUT3 ترنسفكأيشن. توزيع IHCs معربا عن VGLUT3 بعد AAV1-VGLUT3 ترنسفكأيشن (الشكل 3B) 26 تشير إلى أن ترنسفكأيشن عبر RWM هو أكثر فعالية وموحدة من خلال القوقعة كلها من الأساليب الأخرى التي أبلغت ارتفاع معدلات ترنسفكأيشن أقرب إلى موقع تسليم الفيروسي. لقد وجدنا أن معدلات ترنسفكأيشن يمكن أن تكون أكثر كفاءة من خلال زيادة حجم الفيروس حقنها في الأذن الداخلية (الشكل 1) 26.

لدينا مراقبة ناجحة التعبير VGLUT3 في VGLUT3 KO الماوس IHCs مع أي ضرر القوقعة أدى بنا لاختبار السمع عن طريق قياس ABRs في الفئران KO انقاذهم. الشكل 4A) والشكل (4B 26 وثيقة قدرة ما بعد أذني تسليم RWM من AAV1-VGLUT3 في البريد الداخليع من الفئران VGLUT3 KO لإنتاج الإنقاذ السمع في هذا نموذج الفأر من فقدان السمع الخلقية. تم استعادة استجابة الدماغ السمعية (ABR) آثار في VGLUT3 انقاذ KO (الشكل 4A)، وكانت عتبات ABR للقياس وقابلة للمقارنة لتلك التي ظهرت في البرية من نوع الفئران (الشكل 4B).

الشكل (1)
الشكل 1: VGLUT3 IHC ترنسفكأيشن بعد RWM تسليم الفيروسي إلى P10-P12 الفئران KO تم فحص القوقعة transfected في P30 التي كتبها المناعي استخدام الألغام المضادة للMyo7a الأجسام المضادة، علامة خلايا الشعر، والأجسام المضادة ضد VGLUT3. وأعرب عن Myo7a وVGLUT3 في جميع IHCs فقط في WT، في حين IHCs من الفئران KO أعرب فقط Myo7a. أظهرت القوقعة الماوس انقاذ بعض IHCs معربا عن VGLUT3، وأعربت عن IHCs Myo7a (الصف 3) IHC: خلايا الشعر الداخلية. إعادة طبع بإذن من26. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: الفأر القوقعة كله يشن المناعي بعد الولادة RWM AAV2-GFP إلى البرية من نوع الفئران P10-P12 تم استخدام AAV2-GFP لتقييم تسليم الفيروسية باستخدام نهج ما بعد أذني إلى القوقعة الماوس. وقد تم تسليم AAV2-GFP في P10-12 وتم فحص المعدلة وراثيا التعبير GFP في القوقعة في P21 باستخدام الأجسام المضادة لمكافحة GFP. التعبير GFP (الأخضر) في الفئران WT القوقعة كله جبل تظهر أقوى التعبير GFP في خلايا الشعر الخارجي (OHC) من خلايا الشعر الداخلية (IHC).

الشكل (3)
الشكل 3: الفأر انبا hlear كله يشن المناعي بعد الولادة RWM AAV1-GFP إلى البرية من نوع الفئران P10-P12. وبعد وينظر تسليم AAV1-GFP إلى التعبير القوقعة من GFP في الخلايا الداخلية الشعر (IHC) والخلايا الداعمة (A)، ولكن ليس OHCs ، في حين أدى تسليم AAV1-VGLUT3 إلى القوقعة من VGLUT3 KO الفئران (B) في VGLUT3 التعبير فقط في IHCs. عدد IHCs معربا عن VGLUT3 في VGLUT3 KO الفئران القوقعة بعد الولادة AAV1-VGLUT3 يعتمد على كمية الفيروس تسليمها إلى الأذن الداخلية. على سبيل المثال، أعربت 40٪ من IHCs VGLUT3 عندما تم حقن 0.6 ميكرولتر من الفيروس، في حين أن 100٪ من IHCs أعربت VGLUT3 بعد أن تم تسليمها 1 ميكرولتر من الفيروس. لم يكن هناك فرق في VGLUT3 التعبير بين قمة، منتصف بدوره، أو القاعدة عندما تم حقن 0.6 ميكرولتر من الفيروس. إعادة طبع بإذن من 26.

ز "/>
كانت استجابة الدماغ السمعية (ABR) تقييم الطول الموجي ABR التمثيلية بعد الولادة AAV1-VGLUT3 مماثل بين الفئران انقاذ والنوع البري.: الشكل 4. في المقابل، لم يشاهد الطول الموجي ABR في الفئران KO (A). وأظهرت الفئران KO إنقاذهم أيضا عتبات ABR قابلة للقياس. وكانت هذه العتبات ABR مماثلة لتلك التي ظهرت في WT الفئران لجميع الترددات قياس (B). الأول: ABR موجة I. طبع بإذن من 26 الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في هذا العمل، نحن تصف بالتفصيل تقنية التي يمكن استخدامها للعلاج بالجينات القوقعة، وذلك بهدف استعادة أو إنقاذ وظيفة السمع العادية التي تتعرض للخطر من قبل خلل جيني. كما هو ارضحي عادة، وهذا النهج هو آمن لنقل الجين القوقعة أو العلاجات الجزيئية المحتملة الأخرى 30. وقد وصفت مناهج أخرى للعلاج القوقعة، بما في ذلك النهج بطني 24، 31،32 فغر القوقعة والكيس اللمفي الباطن تسليم 33 في الماوس وخنزير غينيا. في تجربتنا، ونهج ما بعد أذني هو أسرع وأسهل، ويرتبط مع انخفاض الإصابة والوفيات الحيوان. وعلاوة على ذلك، فإن النهج بعد أذني يقدم تحسين التصور من RWM مع فرصة أقل من الصدمة وفقدان السمع المرتبط 34،35،36. يوثق هذا التقرير الجوانب الفنية وفائدة النهج بعد أذني لعلاج الجزيئي القوقعة من خلال إظهار إيصال AAV1-VGLUT3 إلى عشرالبريد الأذن الداخلية عن طريق RWM، مما أدى إلى التعبير المعدلة وراثيا من كلا VGLUT3 وGFP (الشكل 1 والشكل 2 والشكل 3A) والإنقاذ السمع في هذا نموذج الفأر من فقدان السمع الخلقية. وأظهرت الدراسات السابقة التي تصف طرق لتوصيل الجينات المعدلة وراثيا فقط التعبير محدود في المناطق الحرجة من جهاز كورتي 12،37،38،39،40،41. قد تكون هذه الاختلافات يرجع إلى نوعية إعداد الفيروسي، وعيار من ناقلات فيروسية، النمط المصلي المستخدمة، أو ببساطة عدم كفاية تسليم الفيروسي في القوقعة. في المقابل، وذلك باستخدام هذا النهج بعد أذني تمكنا من الحصول على معدلات ترنسفكأيشن جيدة للغاية لكلا خلايا الشعر الداخلي والخارجي وتوزيع الجينات مراسل (GFP) بعد AAV2-GFP ترنسفكأيشن (الشكل 2 والشكل 3A) في جميع أنحاء القوقعة. على أساس النسبة المئوية من IHCs transfected مع AAV1-VGLUT3 (الشكل 3B)، نقترح أن ترنسفكأيشن عبر RWM هو أكثر ممثل المؤسسةECTIVE وموحدة من خلال القوقعة كلها من الأساليب الأخرى، بما في ذلك تلك التي وصفها في خنزير غينيا، حيث سجلت أعلى معدلات ترنسفكأيشن في مطلع القاعدية، على مقربة من موقع التطبيق الفيروسي 42. التعبير على المدى الطويل من GFP / VGLUT3 داخل القوقعة، ما لا يقل عن عام ونصف العام، ويتسق مع البيانات التي تم الحصول عليها من النماذج الحيوانية الأخرى وأجهزة الجسم المختلفة 38،43.

بالإضافة إلى ذلك، تحليل نسيجية من القوقعة transfected أظهرت أي دليل على استجابة التهابية، مع الحفاظ الممتاز للالتهندس الخلوي للجهاز كورتي، بما في ذلك عائي السطر والخلايا العصبية العقدية الحلزونية 26. وعلاوة على ذلك، على النقيض من الأساليب التي استخدمت لفغر القوقعة، ترنسفكأيشن RWM المستخدمة في الدراسة الحالية لم يسبب الضرر القوقعة، وكميات أكبر يمكن حقن 31،32. تم التحقق من عدم وجود صدمة باستخدام هذه التقنية من خلال إظهار ما يعادل ABR threshoLDS بين تشغيلها والتحكم في الأذنين، وإيجاد مماثلة لتلك التي اطلعت عليها شيا وآخرون. 4 وأخيرا، أدى التسليم AAV VGLUT3 من خلال RWM في ABR عتبات مماثلة لتلك التي ظهرت في الفئران WT (الشكل 4A) والشكل (4B) 26. وقد استخدمنا هذه التقنية في جميع الأعمار من الفئران، ولكن من الصعب فنيا في الفئران الأكبر سنا من P40 لأن العظام الفقاعة يصبح من الصعب خرم والعظم المكسور من الفقاعة هو أكثر وضوحا في كبار السن مما كان عليه في الفئران الأصغر سنا. في الأعمار المتقدمة، يمكن أن تحدث إذا لم يتم اتخاذ الحذر النزيف إذا قطعة من العظم الفقاعة يمزق الأنسجة الرقبة.

في الختام، ويوثق هذا التقرير نقل الجينات الناجح في عدة أنواع من خلايا القوقعة في الماوس باستخدام ناقلات القائم على AAV كما تبين سابقا. هذه التقنية من توصيل الجينات يقلل الصدمة، لا يؤدي إلى فقدان السمع، ويمكن أن يؤدي في ترنسفكأيشن على نطاق واسع لمجموعة متنوعة من أنواع الخلايا داخل القوقعة، المؤتمر الوطني العراقيluding خلايا الشعر والخلايا العصبية العقدية الحلزونية. أنه يحتوي التطبيق المحتمل الكبير لأنواع أخرى من النماذج الخلقية والمكتسبة من فقدان السمع، ويمكن أيضا أن تطبق على مجموعة متنوعة من العلاجات الجزيئية في نماذج الماوس من فقدان السمع.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamine Butler Schein
Xylazine AnaSed
Acepromazine Provided by UCSF LARC
Carprofen analgesia Provided by UCSF LARC
Betadine Betadine Puredue Pharma
dexamethasone ophthalmic ointment (TobraDex) Alcon
Heating pad Braintree scientific, inc.
25G needle BD 305127
Borosilicate capillary pipette World precision instruments, inc. 1B100F-4
Suture PDS*plus Antibacterial Ethicon PDP149
Tissue glue (Vetcode) Butler Schein 31477
Rabbit Anti-GFP antibody Invitrogen A11122
Dissecting microscope      Leica MZ95
Flaming/ Brown Micropipette      Sutter Instrument Co
Puller Model P-97  
TDT BioSig III System                 Tucker-Davis Technologies

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jero, J., et al. Cochlear gene delivery through an intact round window membrane in mouse. Hum. Gene Ther. 12 (5), 539-548 (2001).
  2. Nam, H. J., et al. Structure of adeno-associated virus serotype 8, a gene therapy vector. J. Virol. 81 (22), 12260-12271 (2007).
  3. Ryan, A. F., Mullen, L. M., Doherty, J. K. Cellular targeting for cochlear gene therapy. Adv Otorhinolaryngol. 66, 99-115 (2009).
  4. Xia, L., Yin, S., Wang, J. Inner ear gene trasfection in neonatal mice using adeno-associate viral vwctor: a comparison of two approaches. PLoS One. 7 (8), e43218 (2012).
  5. Husseman, J., Raphael, Y. Gene therapy in the inner ear using adenovirus vectors. AdvOtorhinolaryngol. 66, 37-51 (2009).
  6. Ballana, E., et al. Efficient and specific transduction of cochlear supporting cells by adeno-associated virus serotype 5. Neurosci. Lett. 442 (2), 134-139 (2008).
  7. Praetorius, M., et al. Adenoviral vectors for improved gene delivery to the inner ear. Hear. Re. 248 (1-2), 31-38 (2009).
  8. Kay, M. A., Glorioso, C. G., Naldini, L. Viral vectors for gene therapy: the art of turning infectious agents into vehicles of therapeutics. Nature Medicine. 7 (1), 33-40 (2001).
  9. Ryan, A. F. Gene Therapy and Stem Cell Transplantation: Strategies for Hearing Restoration. Adv Otorhinolaryngol. 66, Karger. Basel. 64-86 (2009).
  10. Cooper, L. B., et al. AAV-mediated delivery of the caspase inhibitor XIAP protects against cisplatin ototoxicity. Otol. Neurotol. 27 (4), 484-490 (2006).
  11. Gratton, M. A., Salvi, R. J., Kamen, B. A., Saunders, S. S. Interaction of cisplatin and noise on the peripheral auditory system. Hear. Res. 50 (1-2), 211-223 (1990).
  12. Lalwani, A. K., Walsh, B. J., Reilly, P. G., Muzyczka, N., Mhatre, A. N. Development of in vivo gene therapy for hearing disorders: introduction of adeno-associated virus into the cochlea of the guinea pig. Gene Ther. 3 (7), 588-592 (1996).
  13. Kesser, B. W., Hashisaki, G. T., Holt, J. R. Gene Transfer in Human Vestibular Epithelia and the Prospects for Inner Ear Gene Therapy. Laryngoscope. 118 (5), 821-831 (2008).
  14. Izumikawa, M., et al. Auditory hair cell replacement and hearing improvement by Atoh1 gene therapy in deaf mammals. Nat. Med. 11 (3), 271-276 (2005).
  15. Praetorius, M., et al. Adenovector-mediated hair cell regeneration is affected. Acta Otolaryngol. 130 (2), 215-222 (2009).
  16. Friedman, L. M., Dror, A. A., Avraham, K. B. Mouse models to study inner ear development and hereditary hearing loss. Int. J. Dev. Biol. 51 (6-7), 609-631 (2007).
  17. Chang, E. H., Van Camp, G., Smith, R. J. The role of connexins in human disease. Ear Hear. 24 (4), 314-323 (2003).
  18. Cohen-Salmon, M., et al. Targeted ablation of connexin26 in the inner ear epithelial gap junction network causes hearing impairment and cell death. Curr. Biol. 12 (13), 1106-1111 (2002).
  19. Nickel, R., Forge, A. Gap junctions and connexins in the inner ear: their roles in homeostasis and deafness. Curr. Opin. Otolaryngol. Head Neck Surg. 16 (5), 452-457 (2008).
  20. Lv, P., Wei, D., Yamoah, E. N. Kv7-type channel currents in spiral ganglion neurons: involvement in sensorineural hearing loss. J. Biol. Chem. 285 (45), 34699-34707 (2010).
  21. Leibovici, M., Safieddine, S., Petit, C. Mouse models for human hereditary deafness. Curr. Top. Dev. Biol. 84, 385-429 (2008).
  22. Dror, A. A., Avraham, K. B. Hearing loss: mechanisms revealed by genetics and cell biology. Annu. Rev. Genet. 43, 411-437 (2009).
  23. Richardson, G. P., de Monvel, J. B., Petit, C. How the genetics of deafness illuminates auditory physiology. Annu. Rev. Physiol. 73, 311-334 (2011).
  24. Jero, J., Tseng, C. J., Mhatre, A. N., Lalwani, A. K. A surgical approach appropriate for targeted cochlear gene therapy in the mouse. Hearing Research. 151 (1-2), 106-114 (2001).
  25. Seal, R. P., et al. Sensorineural deafness and seizures in mice lacking vesicular glutamate transporter 3. Neuron. 57 (2), 263-275 (2008).
  26. Akil, O., et al. Restoration of hearing in the VGLUT3 knockout mouse using virally mediated gene therapy. Neuron. 75 (2), 283-293 (2012).
  27. Akil, O., et al. Progressive deafness and altered cochlear innervation in knock-out mice lacking prosaposin. J. Neurosci. 26 (5), 13076-13088 (2006).
  28. Fremeau, R. T., et al. Vesicular glutamate transporters 1 and 2 target to functionally distinct synaptic release sites. Science. 304 (5678), 1815-1819 (2004).
  29. Akil, O., Lustig, L. R. Mouse Cochlear Whole Mount Immunofluorescence. Bio-protocol. , Available from: http://www.bio-protocol.org/wenzhang.aspx?id=332 (2013).
  30. Kho, S. T., Pettis, R. M., Mhatre, A. N., Lalwani, A. K. Cochlea microinjection and its effects upon auditory function in guinea pig. Eur Arch Otorhinolaryngol. 257 (9), 469-472 (2000).
  31. Iizuka, T., et al. Noninvasive in vivo delivery of transgene via adeno-associated virus into supporting cells of the neonatal mouse cochlea. Hum. Gene Ther. 19 (4), 384-390 (2008).
  32. Kilpatrick, L. A., et al. Adeno-associated virus-mediated gene delivery into the scala media of the normal and deafened adult mouse ear. Gene Ther. 18 (6), 569-578 (2011).
  33. Yamasoba, T., Yagi, M., Roessler, B. J., Miller, J. M., Raphael, Y. Inner Ear Transgene Expressionafter Adenoviral Vector Inoculation in the Endolymphatic Sac Hum. Gene Ther. 10 (5), 769-774 (1999).
  34. Praetorius, M., Baker, K., Weich, C. M., Plinkert, P. K., Staecker, H. Hearing preservation after inner ear gene therapy: the effect of vector and surgical approach. ORL J. Otorhinolaryngol. Relat. Spec. 65 (4), 211-214 (2003).
  35. Carvalho, G. J., Lalwani, A. K. The effect of cochleaostomy and intracochlear infusion on auditory brain stem response threshold in the guinea pig. Am. J. Otol. 20 (1), 87-90 (1999).
  36. Kawamoto, K., Oh, S. H., Kanzaki, S., Brown, N., Raphael, Y. The Functional and Structural Outcome of Inner Ear Gene Transfer via the Vestibular and Cochlear Fluids in Mice. Mol. Ther. 4 (6), 575-585 (2001).
  37. Lalwani, A. K., Han, J. J., Walsh, B. J., Zolotukhin, S., Muzyczka, N., Mhatre, A. N. Green fluorescent protein as a reporter for gene transfer studies in the cochlea. Hear Res. 114 (1-2), 139-147 (1997).
  38. Lalwani, A. K., et al. Long-term in vivo cochlear transgene expression mediated by recombinant adeno-associated virus. Gene Ther. 5 (2), 277-281 (1998).
  39. Raphael, Y., Frisancho, J. C., Roessler, B. J. Adenoviral-mediated gene transfer into guinea pig cochlear cells in vivo. Neurosci. Lett. 207 (2), 137-141 (1996).
  40. Weiss, M. A., Frisancho, J. C., Roessler, B. J., Raphael, Y. Viral mediated gene transfer in the cochlea. Int. J. Dev. Neurosci. 15 (4=5), 577-583 (1997).
  41. Pettis, R. M., Han, J. J., Mhatre, A. N., Lalwani, A. K. Intracochlear infusion of recombinant adeno associated virus: Analysis of its dissemination to near and distant tissues. Assoc. Res. Otolaryngol. Abstr. 21, 673 (1998).
  42. Konish, iM., Kawamoto, K., Izumikawa, M., Kuriyama, H., Yamashita, T. Gene transfer into guinea pig cochlea using adeno-associated virus vectors. J. Gene Med. 10 (6), 610-618 (2008).
  43. Kaplitt, M. G., et al. Long-term gene expression and phenotypic correction using adeno-associated virus vectors in the mammalian brain. Nature Genetics. 8 (2), 148-154 (1994).

Tags

علم الأعصاب، العدد 97، العلاج الجيني، وفيروس ترنسفكأيشن، الغدة المصاحب (AAV)، الفأرة، القوقعة، خلايا الشعر الداخلية (IHC)، نقل الغلوتامات الحويصلي 3 (VGLUT3).
الطريقة الجراحية لفيروسي وساطة جين التسليم إلى الأذن الداخلية الماوس من خلال جولة النافذة غشاء
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Akil, O., Rouse, S. L., Chan, D. K., … More

Akil, O., Rouse, S. L., Chan, D. K., Lustig, L. R. Surgical Method for Virally Mediated Gene Delivery to the Mouse Inner Ear through the Round Window Membrane. J. Vis. Exp. (97), e52187, doi:10.3791/52187 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter