Afsløring glykogen i perifere mononukleære blodceller med Periodic Acid Schiff Farvning

Introduction

Periodisk syre Schiff (PAS) farvning er en immunhistokemisk teknik, der er meget udbredt i muskel forskning og diagnostik. Det er også anvendes som et diagnostisk redskab på blodprøver. Teknikken virker ved at anvende periodiske syreopløsning til prøven, som oxiderer enheder inden polysaccharid skabe aldehydgrupper, som reagerer med den farveløse Schiffs reagens for derved at frembringe en dyb magenta produkt. Trinene i denne fremgangsmåde er vist i figur 1. Pletten fik noget med polysaccharider magenta, herunder glycogen, glycoproteiner, glycolipider, muciner eller andre molekyler med polysaccharid dele.

PAS-farvning er ofte anvendt til at måle glykogen niveauer i muskelfibre. Muskler vævssnit er ideelle til den teknik, som de fast tillægger dias og modstå flere Vask og farvning trin. Glycogen er mest til stede i hurtige ryk type II muskelfibre, som har en stor efterspørgselfor hurtig ATP-produktion kræver glycogen for maksimal ydelse ^1,2. Glycogen er en forgrenet polymer af glucose, der kan opdeles i fri glucose gennem virkningen af ​​glycogenphosphorylaseinhibitorer enzymer. I tider med hvile og ernæringsmæssig tilstrækkelig, er glykogen genopfyldes gennem processen med glycogenese, mens i tider med ernæringsmæssige insufficiens eller højenergi-demand; glykogen er opdelt i glukose ved glycogenolyse. Fra så tidligt som i 1950'erne kliniker forskere har udforsket PAS-farvning på blodprøver for at analysere glykogen indhold i forskellige sygdomme ^3-7. For eksempel i Pompes sygdom-en respektabelt glykogen lagring sygdomsspecifikke hvide blodlegemer ophobes store mængder glykogen, der adskiller sig væsentligt fra raske kontroller ^8.

Denne video-artiklen viser en tilpasset version af PAS-farvning til brug på perifere mononukleære blodceller (PBMC) Prøver fra venøst ​​blod fra raske forsøgspersoner. PBMCs mest indeholder lymfocytter af T-lymfocyt og B lymfocyt familier, samt andre immunceller såsom naturlige dræberceller og monocytter. Det første oprensningstrin fjerner erytrocytter, neutrofile og andre granulocytter. Denne teknik giver data på en koncentreret del af lymfocytter muliggør mere robust tælling af PAS-positive celler i forhold til at bruge fuldblod udstrygninger.

Figur 1:. Trinvis metode PAS farvning på PBMC (A) Først isolering af PBMC opnået gennem ficoll gradient, venstre panel viser fremstillingen før centrifugering, højre panel viser den efter centrifugering, hvor fibrinlaget indeholdende PBMC observeres i centrum af røret. (B) Isolerede PBMC'er er fastgjort på objektglasset ved hjælp af formalin-ethanol fastgørelse Solution. Objektglasset forsigtigt skyllet med destilleret vand fra en plastik vaskeflaske. (C) Objektglasset anbringes derefter i et 100 ml bægerglas halvvejs fyldt med amylaseopløsning, som vil opløse glykogen. Slæden forsigtigt skylles. (D) Slæden behandles med periodisk sur opløsning, hvor oxidation af saccharider finder sted. Objektglassene skylles forsigtigt; dette vil fjerne overskydende periodisk syre og stoppe oxidationstrinnet. (E) Når Schiff-reagens tilsættes til slides, vil det reagere med aldehyder skabt under oxidationstrinnet. Denne farveløse reagens vil derefter resultere i en dyb rød magenta produkt. Objektglassene skylles forsigtigt at fjerne overskydende Schiff-reagens.

Protocol

Forskning med humane blodprøver blev godkendt af Concordia University Ethics Review Board, certifikat nummer 10000618. Arbejdet med mus muskel blev godkendt af Concordia University Ethics Review Board, certifikat nummer 2010BERG.

1. PBMC Isolering fra fuldblod

BEMÆRK: Udfør denne procedure i en biosikkerhed skab ved hjælp af steril teknik og producent-steriliseret udstyr.

1. Hæld forsigtigt 10-15 ml fuldblod fra hepariniserede rør (antikoagulant) BLODPRØVETAGNINGSSYSTEM i en 50 ml sterilt konisk rør. For mindre blod spild, tørres af med Hedeselskabet ₂ O og 70% EtOH hjælp rengøring væv.
2. Fortynd blodet i konisk rør til en 1: 1-forhold med phosphatbuffer saltvand (PBS 1x) pH 7,4. Sørg for, at den maksimale samlede mængde ikke overstiger 30 ml.
3. Bland forsigtigt ved hjælp af en serologisk pipette pistol undgå bobler.
   BEMÆRK: Må ikke blandes ved at vende røret for at undgå blod accumulation i hætten og efterfølgende nedsivning under centrifugering.
4. Tilføj 13 ml Ficoll-Paque (se Materialer og udstyr tabel), til et nyt 50 ml kapacitet konisk rør. Hold røret oprejst i racket.
5. Ved hjælp af en overførsel pipette udtages fortyndet blod, skal du trykke overførselspipetten tip til den indvendige væg af røret i toppen. Med langsom og konstant tryk, overføre blod langs med indersiden af ​​røret danner en blod lag oven på saccharose lag. Gør dette trin flere gange, indtil alt blod er overført.
6. Cap røret stramt og centrifugeres røret ved stuetemperatur i 30 minutter ved 700 xg i en swing rotor med medium acceleration indstillet til 5, og deceleration til nul.
7. Tag langsomt røret og uden at forstyrre lagene, tage det tilbage til biosikkerhed kabinet.
8. Indsamle forsigtigt buffy coat (tynd overskyet hvidt lag), hvor PBMC'erne er placeret, som er tilføjet mellem PBS / plasma and Ficoll lag ved hjælp af en transfer pipette. Undgå at indsamle saccharose lag og ikke forstyrrer de røde blodlegemer lag.
9. Overfør buffy coat i en ny 50 ml sterilt konisk rør. Det kan tage flere gange for at gentage trin 1.8 til at samle alle PBMC.
10. Tilføj PBS pH 7,4 til røret med PBMC og fyld op til 45 ml mærket. Ryst rør grundigt. Undlad at slynge.
11. Vask 1: centrifugeres i 15 minutter ved 480 xg med både maksimal acceleration og deceleration sat til 9. Observer dannelse af en pellet af PBMC'er i bunden af ​​den koniske rør.
12. Kassér PBS (supernatant) i et plastbæger med 10 ml blegemiddel.
13. Løsn cellepelleten ved forsigtigt "reoler" mod en bølget overflade (dvs. tom rack). Undlad at slynge.
14. Tilsæt 25 ml frisk PBS pH 7,4 til røret. Hvis mere end en slange bliver behandlet, pool pillerne sammen i dette trin.
15. Vask 2: centrifugeres i 12 minutter ved 480 xg with både maksimal acceleration og deceleration indstillet til 9.
16. Kassér PBS (supernatanten) i plastbæger med et stænk af blegemiddel.
17. Forsigtigt "rack" mod en bølget overflade (dvs. tom rack). Undlad at slynge.
18. Tilsæt 25 ml frisk PBS til røret.
    1. Tag 50 pi celler og overføres til et mikrocentrifugerør for levedygtighed tæller.
    2. Tilføj et tilsvarende beløb (50 pl) af trypanblåt (en levedygtighed plet) og pipette op og ned for at blande forsigtigt.
19. Tag 10 pi og overføre det til et hæmocytometer at kontrollere levedygtigheden af ​​celler pr ml. Registrere antallet af celler / ml.
20. Tag den ønskede mængde af celler og centrifugeres i 12 minutter ved 480 xg med både maksimal acceleration og deceleration til 9.
21. Kassér PBS (supernatant) i bægerglasset med blegemiddel.
22. Forsigtigt "rack" mod en bølget overflade (dvs. tom rack). Tilføj 80 pi PBS i røret.

2. Gøre PBMC Slide

1. Placer 80 pi af cellerne på et mikroskopobjektglas. Smør drop med hjælp fra et andet dias eller placere 2 dråber 40 pi hver på begge ender af dias.
2. Lad dias i biologisk sikkerhedsskab til tørre. Mærk slide med en blyant på matteret side.

3. Fastsættelse prøverne på dias

1. Forbered fikseringsopløsning ved at blande 0,5 ml 37% formaldehyd til 4,5 ml 99% ethanol.
2. Efter objektglassene tørret, tage 2 ml af frisk gjort fikseringsopløsning og hæld den på slæden, således at hele overfladen af ​​objektglasset er dækket.
3. Lad opløsningen på objektglasset for 1 min. Skyl dias i 1 minut med postevand og lad det lufttørre.

4. Gøre amylaseopløsning for negativ kontrol

1. Tag 0,25 g amylase pulver og opløses i 50 ml ditavs vand. Hæld opløsningen i et rent 100 ml bægerglas.
2. Nedsænk objektglasset i bægeret, således at halvdelen af slæden modtager behandlingen og den anden halvdel forbliver ubehandlet, og derefter inkuberes i 15 minutter ved stuetemperatur (figur 1C).
3. Lav en note om, hvilken side af slæden får den amylase behandling. Tegn en linje på bagsiden af ​​objektglasset angiver grænsen mellem behandling og kontrol.
4. Vask slides med Hedeselskabet ₂ O for at fjerne amylaseopløsning og lade dias lufttørre.

5. Udfør Periodisk Acid Schiff (PAS) Farvning og Imaging

BEMÆRK: PAS reagenser er giftig ved indånding og er ætsende, så de skridt der skal gøres i stinkskab, og affaldsstofferne skal bortskaffes korrekt i henhold til institutionelle retningslinier.

1. Placer dias på en flad overflade og hæld 1,50-2,00 ml periodiske syreopløsning på prøven. Incubate i 5 minutter ved stuetemperatur.
2. Skyl dias i flere afgifter af destilleret vand.
3. Hæld 1,50-2,00 ml Schiffs reagens på objektglasset og inkuberes ved stuetemperatur i 15 min.
4. Vask dias med destilleret vand i 5 minutter og lad det lufttørre.
5. Påfør 10 pi montering medier på dias og dække med to små dækglas, eller anvende 50 pl og bruge en stor dækglas.
6. Anvend klar neglelak på kanterne af dækglasset, lad tørre natten over.

6. opnå billeder med Kikkert lysmikroskop med den 100X Formål

Representative Results

At validere reagenser og grundlæggende teknik blev PAS-farvning udføres ifølge fabrikantens instruktioner om mus soleusmusklen sektioner. Farvningen blev udført samme dag som offer og i det sidste trin af farvning blev snittene fastsat ved xylen. Soleus muskel vides at indeholde ~ 35% glykogen-positive celler ^9. De farvede muskelceller vises to særskilte PAS-positive funktioner- punktformig granulat i cellen, og en kontinuerlig linje demarking cellemembranen (figur 2A). Tilstedeværelsen af ​​punktformig granuler er i overensstemmelse med glykogen butikker, og blev anvendt til at definere en positiv muskelcelle. Behandling af prøver med amylase fjernet punktformig granulat, der er i overensstemmelse med dem er glykogen (figur 2B).

Figur 2: pas- farvede musemuskel snit blev analyseret med lysmikroskopi. Mouse soleusmusklen sektioner blev farvet med PAS. Nogle prøver blev forbehandlet med amylase. (A) PAS-positive partikler var synlige inde i muskelceller. (B) Mindre PAS-positive celler blev observeret, når de muskel sektioner blev forbehandlet med amylase. Farvningen omkring cellemembranen tilbage efter amylase behandling (skala bar = 100 um). Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Membranen-farvning signal forblev selv efter amylase behandling. Som forventet, procentdelen af PAS-positive celler i den ikke-amylase muskel sektion var 37%, mens amylase behandlet muskel sektioner havde betydeligt mindre, ca. 5% PAS-positive celler (figur 3).

">
Figur 3: Kvantificering af PAS-positive muskelceller Andelen af muskelceller, der var PAS positive blev talt fra en repræsentativ slide uden eller med amylase forbehandlingen.. Som forventet, 37% af muskelceller var positive for glycogen. Amylase behandling reducerede signifikant PAS-signal til 4% (* p <0,001).

Dernæst blev PAS-farvning udføres på PBMC fra venøst ​​blod fra raske forsøgspersoner ved anvendelse af en modificeret teknik som beskrevet i protokollen afsnit og illustreret i figur 1. PBMC klæbes godt, hvis vasketrinnene omhyggeligt blev udført. Pas-farvede PBMC'er viste en række farvningsmønstre. Små celler (5 um) med granuler blev let iagttaget. En del af større celler med et diffust farvningsmønster blev også observeret (figur 4A og inset A.1-6 (figur 4B).

Figur 4:. Periodisk syre-Schiff (PAS) farvning på humane PBMC'er (A) PAS-farvning på PBMC'er blev udført. To typer af celler blev observeret. (A.1-6) Mindre celler (ved 5 pm) i ikke-amylase behandlede slides viste magenta partikler i overensstemmelse med glykogen. Disse celler kunne hvilende celler. Større celler (mere end 5 m) i ikke-amylase behandlede celler havde diffus PAS-positiv farvning. Disse celler kan aktiveres lymfocytter. (B) PBMCer blev behandlet med amylase i 15 minutter før farvning, hvilket formindskede PAS signal. Repræsentant syv forskellige sunde forsøgspersoner. (C) PAS og hematoxylin farvning udført på fuldblod dias. Pilen viser en PBMC omgivet af mange erythrocytter (skala bar = 10 um). Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Andelen, der var PAS positive var 98% for de mindre celler og 40% for de større celler. Amylase behandling eliminerede PAS signal i små celler (p <0,001) og væsentligt formindsket PAS-signal i de større celler til 7% (figur 5).

Figur 5: Kvantificering af PAS-positive PBMC'er Andelen af PBMC'er, der var PAS positive blev talt fra en repræsentativ dias uden eller med amylase forbehandling.. 98% af de små celler var positive for PAS. 40% af de større celler var positive for PAS. Amylase behandling eliminerede PAS signal i små celler (p <0,001) og væsentligt formindsket PAS-signal i de større celler til 7% (p <0,001).

For at bekræfte, at PBMC'er besidder glykogen en anden uafhængig metode, der også tilvejebringer kvantificering af mængden af glycogen blev anvendt ^10,11, og er tidligere blevet offentliggjort i JOVE på andre celletyper ^12. PBMC'er blev lyseret i hypotonisk buffer og glykogen blev adskilt som kort beskrevet i billedteksten i figur 6.

Figur 6: Måling af glycogen ved hjælp af enzymatisk fordøjelse med hydrolyse enzymer. Glycogen blev målt i henhold til producentens anvisninger. Kort sagt, protokollen indebærer hypotonisk lyse af 1 x 10 ⁶ PBMC'er efterfulgt af pelletering af uopløseligt materialeder indeholder glykogen. Pelleten blev vasket og fordøjet med hydrolyse enzymer der giver glucose som blev målt ved spektrofotometri og sammenlignet med en standardkurve. Cellelysatet blev fortyndet i de angivne forhold med hydrolyse buffer. Dataene er repræsentative for tre eksperimenter. Signifikante niveauer af glycogen blev påvist i 1: 1 fortynding (p = 0,02), og dette signal titreres som lysatet blev yderligere fortyndet.

Det uopløselige glycogen blev vasket flere gange, og derefter fordøjet ved hjælp af hydrolyse enzymer. Mængden af ​​glucose givet fra fordøjelsen blev målt ved hjælp af spektrofotometri og sammenlignet med en standardkurve. En million PBMC'er havde 1,19 ug glycogen. The glycogen signal titreres ned som cellelysatet blev yderligere fortyndet (figur 6).

Discussion

De kritiske trin i denne video artiklen var under vask og amylase behandling af cellerne. Mens vaske dias blev den afgørende skridt ved hjælp af en plastik squeezable vask flaske og lade vandet forsigtigt køre gennem prøven på objektglasset og ikke direkte sigte på prøverne. Selv den mindste direkte vandtryk ville bevirke, at cellerne til at komme væk fra dias. Et andet afgørende skridt var at bruge den samme slide for ± amylase forhold. Efter PBMC'erne blev klæbet til objektglasset blev objektglasset forsigtigt anbragt i et bægerglas, så kun halvdelen af ​​smear blev udsat for amylaseopløsning. Dette trin giver en robust kontrol, fordi blodcellerne er fra samme slide, derved minimere forstyrrende variabler, der kan opstå som følge af små timing variationer. Cellerne stak godt med ingen behandling, så de ekstra omkostninger og tid involveret med poly-L-lysin eller polyethylenglycol belægning for eksempel ikke ville være berettiget.

Gennem troubleshooting den optimale aktivitet af amylase blev bestemt. For muskel sektioner blev det bemærket, at den optimale aktivitet af amylase blev observeret inden for 1 time af inkubation. På længere tider musklen strækninger skulle langsomt skrælle dias, mens kortere tider amylase ikke i tilstrækkelig grad fjerner PAS-signal. Havde Timingen for amylase inkubering i PBMC dias skal reduceres i forhold til den muskel-prøve timing (som var 1 time) ned til kun 15 min. Længere tider forårsagede PBMC'er til at komme væk fra dias, mens kortere tider ikke reelt påvirke PAS-signal. En modifikation af standard protokol PAS farvning blev ændre fremgangsmåden til vask af objektglassene. Producentens anvisninger angivet at vaske slides med rindende vand, som forårsagede cellerne til at komme væk fra dias. Ændringen var at vaske slides med squeezable vask flaske for at bevare cellerne. Som beskrevet i det kritiske trin afsnittet, var det meget vigtigt ikke at direkte anvendelse vandtryk på cellerne.

Der er visse begrænsninger i denne teknik. Musklen cellemembranen blev farvet sammen med punktformig granulat i cytoplasmaet i muskelcellen. Granulerne blev elimineret ved amylase behandling og derfor sandsynligvis være glycogen, medens membranfarvning var ufølsom over for amylase. Identiteten af ​​PAS-positive partikler på cellemembranen er ikke kendt. Det kunne være musklen kælderen (perimysium) membran. Denne membran omgiver muskel hæfterne og på grund af dens høje indhold glycoprotein er det kendt at være PAS positive. En anden begrænsning af PAS-farvning er, at glykogen granuler skal være mindst 50 nm i diameter til at være synlige ved konventionel lysmikroskopi. Således kunne mindre glykogen granulat være til stede i en celle, men stadig registrere negativ på en PAS test. Den anden metode overvinder denne begrænsning ved at tilvejebringe påvisning af glykogen i et lysat. I kombination med en standardkurve kan dette anvendes til Determine det nøjagtige beløb af glykogen. Selv om denne teknik er meget kvantificerbare og er ikke begrænset af størrelsen af ​​granulat, er det i sig selv har visse begrænsninger. Glykogen granulat er komplekse forgrenede strukturer med mange accessoriske proteiner og kemiske tværbindinger, hvilket gør det usandsynligt, at hydrolyse enzymer opløses fuldstændigt en hel glycogen molekyle ^13. Således kan den enzymatiske-detektion (ligesom PAS teknik) under-repræsentere den faktiske mængde af glykogen i en prøve. En måde at håndtere denne begrænsning er med elektronmikroskopi, som løser selv de mindste glykogen granulat ^14. Man skal anvende en kombination af disse teknikker, PAS-farvning, enzymatisk nedbrydning, og elektronmikroskopi for den mest omfattende karakterisering af glykogen.

Denne artikel og video viser den periodiske syre Schiff (PAS) farvning teknik tilpasset til brug på PBMC'er. Betydningen af ​​denne undersøgelse ses i valget af anvendelse afPBMC'er end blod smear, hvilket gjorde det mere realistisk at opregne lymfocytter. Indledningsvis blev en klassisk blod-udstrygningspræparat teknik testet, men de fleste af cellerne på objektglasset var røde blodlegemer og eventuelt neutrofiler (figur 4C). At koncentrere lymfocytter blev PBMC'er oprenset fra blod ved hjælp af standard densitetsgradient teknik. Ved hjælp af en teknik svarende til en blod-udstrygningspræparat, PBMC'erne let klæbet til varigheden af ​​PAS procedure, som har mange kraftige vasketrin. PAS teknik har været anvendt i årtier for at bestemme glycogenniveauerne i muskelvæv biopsier, som er skåret i tynde sektioner og klæbet til lysbilleder. PAS farvning blev valgt frem for andre kulhydrat farvning kemikalier på grund af sin høje pålidelighed og tilstedeværelsen af ​​de forventede resultater i litteraturen. En mus (Mus spretus) muskel sektioner blev anvendt som en positiv kontrol og fundet, som forventet, at 37% af cellerne var PAS-positive ^9. Med hensyn til omkostninger og tid, forberedelse PBMC er strengere end en blodudstrygning, men der er flere fordele. For det første, præparatet er mere beriget i lymfocytter, som er cellerne af interesse for projekter, der koncentreres om autoimmunitet. Hvis der blev anvendt blodudstrygninger ville lymfocytterne mindretal, hvilket gør det svært at finde cellen af ​​interesse. Man skal forberede og analysere langt flere dias for at få de samme numre, du ville få med et par PBMC dias. Forskerne ville være meget interesseret i at bruge vores nye optimerede teknik i autoimmunitet projekter relateret til type 1-diabetes, dissemineret sklerose, lupus, leddegigt, etc. hvor T og B-lymfocytter og NK-celler spiller en rolle. Selvfølgelig, til andre anvendelser, hvor erythrocytter eller neutrofiler er af interesse blodudstrygning ville blive anbefalet. Den anden fordel er, at PBMC'er kan anvendes til at studere human lymfocyt biologi in vitro.

Et igangværende forskning undersøger kilden til glykogen i PBMC'er. Jegn fremtiden, er det planen at måle glykogen indhold i forbindelse med multipel sklerose, en T-lymfocyt-medieret autoimmun sygdom, der påvirker en anslået 2,3 millioner mennesker verden over fra 2013 ^15,16. Hvad er de små og store celler i PBMC prøverne? Celler ved 5 um er i overensstemmelse med den lymfoide afstamning i deres hviletilstand. T-lymfocyt, B-lymfocytter, naturlige dræberceller og andre mindre delmængder er inden for dette størrelsesområde. De større PBMC'er sandsynligvis består af aktiverede lymfocytter, der vokser, når de modtager inflammatoriske signaler fra immunsystemet, og monocytter fra myeloid afstamning. Avancerede cellesortering teknikker såsom fluorescerende cellesortering eller magnetisk cellesortering kræves for yderligere at raffinere den delmængde, der udtrykker glykogen.

Hematoxylin counter farvning blev brugt, da farvningen blev udført på fuldblod. Dette gjorde det muligt at skelne monocytter fra erythrocytter (Figur 4C). Når farvningen blev udført på PBMC'er, idet alle cellerne var mononukleære, var der ingen grund til at imødegå pletten med hematoxylin at identificere celler. Også hematoxylin blev interferere med PAS signal i cellerne. Sammenfattende har vi vist en PAS-farvning procedure tilpasset til PBMC'er. Denne teknik er nyttig til forskere og klinikere forsker autoimmunitet, infektion og allergi.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Periodic Acid Shiff Kit	Sigma-Aldrich	395B	Bring to room temperature prior to use. Materials in this kit are toxic and harmful. Use caution.
α-Amylase from porcine pancreas	Sigma-Aldrich	A3176
Binocular Microscope	Carl Zeiss Microscopy	Axio Lab A0
Glycogen Assay Kit	Sigma-Aldrich	MAK016
Ficoll-Paque PLUS	VWR, GE Healthcare	17-1440-02	Nonionic synthetic polymer of sucrose.
Centrifuge			For PBMC isolation, swing buckets were used.