Rilevamento glicogeno in cellule periferiche mononucleate del sangue con Periodic Acid Schiff colorazione

Introduction

Acido periodico Schiff (PAS) è una tecnica di colorazione immunoistochimica che è ampiamente utilizzato nella ricerca e diagnostica muscolare. Viene anche utilizzato come strumento diagnostico su campioni di sangue. La tecnica funziona applicando soluzione di acido periodico al campione, che ossida unità all'interno dei polisaccaridi creazione di gruppi aldeidici che reagiscono con il reagente di Schiff incolore producendo così un prodotto magenta profondo. I passi di questa procedura sono mostrati in Figura 1. La macchia gira nulla con polisaccaridi magenta, tra glicogeno, glicoproteine, glicolipidi, mucine, o altre molecole con porzioni polisaccaridi.

Colorazione PAS viene spesso utilizzato per misurare i livelli di glicogeno nelle fibre muscolari. Sezioni di muscoli di tessuto sono ideali per la tecnica in quanto fermamente attribuiscono alla diapositiva e sopportano più fasi di lavaggio e colorazione. Il glicogeno è più presente in contrazione rapida di tipo II fibre muscolari, che hanno una forte domandaper la produzione di ATP rapida richiede glicogeno per il massimo delle prestazioni ^1,2. Il glicogeno è un polimero ramificato di glucosio che può essere suddiviso in glucosio libero attraverso l'azione di enzimi glicogeno fosforilasi. In tempi di riposo e nutrizionale-autosufficienza, il glicogeno viene rifornito attraverso il processo di glicogenesi, mentre in tempi di insufficienza o di alta energia domanda nutrizionale; glicogeno è suddiviso in glucosio da glicogenolisi. Dalla già a partire dal 1950 gli scienziati hanno esplorato clinico colorazione PAS su campioni di sangue per analizzare il contenuto di glicogeno in varie malattie ^3-7. Ad esempio, in Pompe malattia un accumulo di glicogeno autentico globuli bianchi alle malattie accumulano grandi quantità di glicogeno che differisce significativamente da controlli sani ^8.

Questo video-articolo illustra una versione adattata di colorazione PAS per l'uso su cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) campioni di sangue venoso di soggetti umani sani. PBMCs contengono principalmente linfociti del linfociti T e B famiglie linfociti, così come altre cellule immunitarie come le cellule killer naturali e monociti. La prima fase di purificazione rimuove eritrociti, neutrofili e altri granulociti. Questa tecnica fornisce dati su una proporzione concentrata di linfociti consentendo più robusta enumerazione delle cellule PAS-positive rispetto all'utilizzo strisci di sangue intero.

Figura 1:. Passo dopo passo la metodologia di colorazione PAS su PBMC (A) In primo luogo, l'isolamento delle PBMC è ottenuta attraverso Ficoll gradiente, il pannello di sinistra mostra la preparazione prima della centrifugazione, il pannello di destra mostra che dopo centrifugazione dove il cappotto buffy contenente il PBMC si osserva nel centro del tubo. (B) Isolamento PBMC sono fissati su vetrino utilizzando formalina-etanolo solu fissativezione. Il vetrino viene delicatamente risciacquato con acqua distillata da una spruzzetta di plastica. (C) Il vetrino viene quindi posto in un becher da 100 ml a metà riempito con soluzione di amilasi, che si dissolverà glicogeno. Il vetrino viene delicatamente risciacquato. (D) La slitta viene trattato con soluzione di acido periodico, in cui l'ossidazione dei saccaridi avviene. I vetrini sono sciacquati delicatamente; Questa operazione rimuoverà l'acido periodico eccesso e fermare la fase di ossidazione. (E) Quando il reagente di Schiff viene aggiunta ai vetrini, esso reagirà con aldeidi creati durante la fase di ossidazione. Questo reagente incolore sarà quindi ottenere un prodotto magenta rosso intenso. I vetrini sono delicatamente risciacquate per rimuovere l'eccesso di reagente di Schiff.

Protocol

La ricerca con campioni di sangue umano è stato approvato dalla Concordia University Ethics Review Board, numero del certificato 10000618. Il lavoro sul muscolo del mouse è stato approvato dalla Concordia University Ethics Review Board, numero del certificato 2010BERG.

1. PBMC Isolamento da sangue intero

NOTA: Effettuare questa procedura in un armadio biosicurezza con tecnica sterile e attrezzature produttore-sterilizzati.

1. Versare con cautela 10-15 ml di sangue intero dai eparinizzato tubi (anticoagulante) di raccolta del sangue in una provetta sterile da 50 ml. Per fuoriuscite di sangue minori, pulire con DDH ₂ O e il 70% EtOH utilizzando tessuti di pulizia.
2. Diluire il sangue nel tubo conico ad un rapporto 1: 1 con tampone fosfato salino (PBS 1x) pH 7,4. Assicurarsi che il volume massimo totale non supera i 30 ml.
3. Mescolare delicatamente con una pistola pipetta sierologica evitando bolle.
   NOTA: NON miscelare invertendo il tubo per evitare il sangue di unccumulation nel tappo e successiva filtrazione durante la centrifugazione.
4. Aggiungere 13 ml di Ficoll-Paque (vedi Materiali e tavolo Equipment), a un nuovo tubo conico capacità di 50 ml. Mantenere il tubo verticalmente nel rack.
5. Usando una pipetta di trasferimento, prendere il sangue diluito, toccare la punta della pipetta di trasferimento alla parete interna del tubo vicino alla cima. Con pressione lenta e costante, trasferire il sangue lungo la parete interna del tubo formare uno strato sangue sulla parte superiore dello strato di saccarosio. Eseguire questa operazione più volte fino a che tutto il sangue è stato trasferito.
6. Chiudere la provetta e centrifugare saldamente il tubo a temperatura ambiente per 30 min a 700 xg in un rotore battente con set accelerazione medio 5, e decelerazione impostato a zero.
7. Lentamente estrarre il tubo e senza disturbare gli strati, si torna a prendere l'armadio biosicurezza.
8. Raccogliere accuratamente il cappotto buffy (sottile strato nuvoloso bianco), dove si trovano PBMC, posto tra il PBS / plasma unnd strati ficoll con una pipetta di trasferimento. Evitare di raccogliere strato di saccarosio e non disturbare lo strato di globuli rossi.
9. Trasferire il buffy coat in un nuovo tubo conico sterile 50 ml. Si può richiedere più volte di ripetere passo 1.8 per raccogliere tutti i PBMC.
10. Aggiungere PBS pH 7,4 al tubo con PBMC e riempire fino alla tacca 45 ml. Agitare bene il tubo. Non fare vortex.
11. Lavare 1: Centrifugare per 15 min a 480 xg sia massima accelerazione e decelerazione impostato 9. Osservare formazione di un pellet di PBMC sul fondo della provetta conica.
12. Eliminare il PBS (surnatante) in un becher di plastica con 10 ml di candeggina.
13. Allentare pellet delicatamente "travaso" contro una superficie ondulata (cioè, rack vuoto). Non fare vortex.
14. Aggiungere 25 ml di PBS fresco pH 7.4 al tubo. Se più di un tubo viene elaborato, riunire i pellets insieme in questa fase.
15. Lavare 2: Centrifugare la provetta per 12 minuti a 480 xg with sia massima accelerazione e decelerazione impostato su 9.
16. Eliminare il PBS (surnatante) nel bicchiere di plastica con una spruzzata di candeggina.
17. Delicatamente "rack" contro una superficie ondulata (cioè, rack vuoto). Non fare vortex.
18. Aggiungere 25 ml di PBS fresco al tubo.
    1. Estrarre 50 ml di cellule e trasferire in una provetta per il conteggio redditività.
    2. Aggiungere un importo pari (50 ml) di trypan blu (una macchia vitalità) e pipetta su e giù per mescolare delicatamente.
19. Estrarre 10 ml e trasferirlo ad un emocitometro per verificare la vitalità delle cellule per ml. Registrare il numero di cellule / ml.
20. Estrarre la quantità desiderata di cellule e centrifugare la provetta per 12 min a 480 xg sia massima accelerazione e decelerazione impostato 9.
21. Eliminare il PBS (surnatante) nel bicchiere con candeggina.
22. Delicatamente "rack" contro una superficie ondulata (cioè, rack vuoto). Aggiungere 80 ml di PBS nel tubo.

2. Rendere Slide PBMC

1. Mettere 80 ml di cellule su un vetrino da microscopio. Spalmare il goccia con l'aiuto di un'altra diapositiva o collocare 2 gocce di 40 microlitri ciascuno su entrambe le estremità della slitta.
2. Lasciare diapositiva nella cappa di sicurezza biologica ad asciugare. Etichettare il vetrino con una matita sul lato opaco.

3. Fissaggio dei campioni sulle diapositive

1. Preparare la soluzione fissativa miscelando 0,5 ml di 37% di formaldeide al 4,5 ml di 99% di etanolo.
2. Dopo i vetrini vengono essiccati, estrarre 2 ml della soluzione di fissativo fresco e versarlo sul vetrino in modo che l'intera superficie del vetrino è coperto.
3. Lasciare la soluzione sul vetrino per 1 min. Sciacquare il vetrino per 1 min con acqua corrente e lasciare asciugare all'aria.

4. Rendere la soluzione di amilasi per controllo negativo

1. Prendere 0,25 g di polvere di amilasi e sciogliere in 50 ml di diacqua calmato. Versare la soluzione in un becher da 100 ml pulito.
2. Immergere il vetrino nel becher in modo che la metà del vetrino riceve il trattamento e l'altra metà rimane non trattato e quindi incubare per 15 min a temperatura ambiente (Figura 1C).
3. Prendere nota su quale lato della diapositiva sta ricevendo il trattamento amilasi. Tracciare una linea sul retro del vetrino indicare il confine tra il trattamento e di controllo.
4. Lavare i vetrini con DDH ₂ O per rimuovere la soluzione amilasi e lasciare la diapositiva di aria secca.

5. Eseguire Periodic Acid Schiff (PAS) colorazione e Imaging

NOTA: i reagenti PAS sono tossici per inalazione e sono corrosivi, così i passi devono essere fatte in una cappa, ed i prodotti di scarto devono essere smaltite in conformità alle linee guida istituzionali.

1. Posizionare il vetrino su una superficie piana e versare 1,50-2,00 ml di soluzione di acido periodico sul campione. Incubate per 5 minuti a temperatura ambiente.
2. Sciacquare i vetrini in varie accuse di acqua distillata.
3. Versare 1,50-2,00 ml di reagente di Schiff sul vetrino ed incubare a temperatura ambiente per 15 min.
4. Lavare il vetrino con acqua distillata per 5 minuti e lasciare asciugare.
5. Applicare mezzo di montaggio 10 ml sul vetrino e coprire con due piccole lamelle, o applicare 50 ml e utilizzare una grande coprioggetti.
6. Applicare smalto trasparente sui bordi del vetrino, lasciare asciugare per una notte.

6. Ottenere immagini con la luce microscopio binoculare Uso Obiettivo 100X

Representative Results

Per convalidare i reagenti e la tecnica di base, colorazione PAS è stata eseguita secondo le istruzioni del produttore su sezioni muscolari del mouse soleo. La colorazione è stato fatto stesso giorno del sacrificio e nell'ultimo passaggio della colorazione, le sezioni sono state fissate dal xilene. Il muscolo soleo è nota la presenza di ~ 35% di glicogeno-positivo cellule ^9. Le cellule muscolari colorate visualizzate due distinte granuli puntiformi Caratteristiche-PAS-positiva all'interno della cellula, e una linea continua demarking membrana cellulare (Figura 2A). La presenza di granuli puntiformi è coerente con glicogeno, ed è stato utilizzato per definire una cellula muscolare positiva. Trattamento dei campioni con amilasi rimosso i granuli puntiformi che è coerente con loro che sono glicogeno (Figura 2b).

Figura 2: PAS sezioni muscolari di topo colorate sono stati analizzati con microscopia ottica. sezioni muscolo soleo del mouse sono state colorate con PAS. Alcuni campioni sono stati pre-trattati con amilasi. (A) particelle PAS-positivi erano visibili all'interno delle cellule muscolari. (B) Meno PAS cellule positive sono state osservate sezioni muscolari sono stati pre-trattati con amilasi. La colorazione intorno alla membrana cellulare è rimasto dopo il trattamento amilasi (scala bar = 100 micron). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Il segnale membrana colorazione rimasto anche dopo il trattamento amilasi. Come previsto, la percentuale di cellule PAS-positive nella sezione muscolare non-amilasi era 37%, mentre amilasi trattata sezioni muscolari era significativamente inferiore, circa 5% PAS-positivi cellule (Figura 3).

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Figura 3: Quantificazione delle cellule muscolari PAS-positivi La proporzione di cellule muscolari che erano positive PAS è stato contato da una diapositiva rappresentante senza o con l'amilasi pre-trattamento.. Come previsto, il 37% delle cellule muscolari erano positive per glicogeno. Trattamento Amilasi ridotto significativamente il PAS segnale al 4% (* p <0,001).

Successivamente, PAS-colorazione è stata eseguita su PBMC da sangue venoso di soggetti umani sani utilizzando una tecnica modificata come descritto nella sezione del protocollo, ed illustrato in figura 1. Il PBMC aderito bene se le fasi di lavaggio sono state eseguite con attenzione. Il PBMC PAS macchiato mostrato una varietà di modelli di colorazione. Piccole cellule (5 micron) con granuli sono stati prontamente notato. Sono stati inoltre osservata una percentuale di cellule più grandi con un pattern di colorazione diffusa (4A, e inserto A.1-6 (Figura 4B).

È stata eseguita acid-Schiff periodico (PAS) colorazione su PBMC umani (A) PAS-colorazione on PBMCs: Figura 4.. Sono stati osservati due tipi di cellule. (A.1-6) piccole cellule (a 5 micron) in non-amilasi diapositive trattati hanno mostrato particelle magenta coerenti con glicogeno. Queste cellule potrebbero essere cellule quiescenti. Celle più grandi (più di 5 micron) nelle cellule trattate non-amilasi avevano diffusa colorazione PAS-positivo. Queste cellule possono essere attivati ​​linfociti. (B) PBMC sono stati trattati con amilasi per 15 minuti prima della colorazione, che diminuisce il segnale PAS. Rappresentante di sette diversi soggetti umani sani. (C) La PAS e hematoxylin colorazione fatto su tutto il vetrino di sangue. La freccia indica una PBMC circondato da molti eritrociti (scala bar = 10 micron). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

La percentuale che era PAS positiva è stata del 98% per le celle più piccole e il 40% per le celle più grandi. Trattamento Amilasi eliminato il segnale PAS nelle piccole cellule (p <0,001) e significativamente ridotto l'PAS segnale nelle cellule più grandi al 7% (Figura 5).

Figura 5: Quantificazione di PBMC PAS-positive La percentuale di PBMC che erano positive PAS è stato contato da una diapositiva rappresentante senza o con l'amilasi pre-trattamento.. 98% delle piccole dimensioni cellule erano positive per PAS. 40% delle cellule più grandi erano positive per PAS. Trattamento Amilasi eliminato il segnale PAS nelle piccole cellule (p <0,001) e significativamente ridotto l'PAS segnale nelle cellule più grandi al 7% (p <0.001).

Per confermare che PBMC possiedono glicogeno un secondo metodo indipendente che fornisce anche la quantificazione della quantità di glicogeno è stata utilizzata ^10,11, ed è stato precedentemente pubblicati JoVE su altri tipi di cellule ^12. PBMC sono state lisate in tampone ipotonico e glicogeno differenziati come brevemente descritto nella voce di figura 6.

Figura 6: Misurazione della glicogeno utilizzando la digestione enzimatica con enzimi di idrolisi. Il glicogeno è stata misurata secondo le istruzioni del produttore. In breve, il protocollo comporta lisi ipotonica di 1 x 10 ⁶ PBMC seguita da pellet di materiale insolubileche contiene glicogeno. Il pellet è stato lavato e digerito con gli enzimi di idrolisi cedevoli glucosio che è stato misurato mediante spettrofotometria e comparati con una curva standard. Il lisato cellulare è stato diluito a rapporti indicati con tampone di idrolisi. I dati sono rappresentativi di tre esperimenti. Livelli significativi di glicogeno sono stati rilevati nella diluizione 1: 1 (p = 0,02), e questo segnale titolato come il lisato è stato ulteriormente diluiti.

Il glicogeno insolubile è stato lavato diverse volte, e poi digerito con enzimi di idrolisi. La quantità di glucosio ceduto dalla digestione è stata misurata usando spettrofotometria e confrontata con una curva standard. Un milione di PBMC avevano 1.19 mg di glicogeno. Il segnale glicogeno titolata giù come il lisato cellulare è stato ulteriormente diluito (figura 6).

Discussion

Le fasi critiche di questo articolo video erano durante il lavaggio e amilasi trattamento delle cellule. Mentre si lava le diapositive, il passo fondamentale stava usando una bottiglia di plastica di lavaggio squeezable e lasciando scorrere l'acqua dolcemente attraverso il campione sul vetrino e non puntando direttamente sui campioni. Anche la minima pressione dell'acqua diretta potrebbe causare le cellule a venire fuori la diapositiva. Un altro passo fondamentale è stato quello di utilizzare lo stesso scivolo per ± condizioni amilasi. Dopo le PBMC sono state rispettate diapositiva, il vetrino è stato accuratamente posizionato in un becher soltanto metà della striscio stato esposto alla soluzione amilasi. Questo passaggio offre un controllo affidabile, perché le cellule del sangue sono dello stesso vetrino, riducendo così al minimo le variabili di confondimento che possono verificarsi a causa di lievi variazioni di tempo. Le cellule bloccato bene con nessun trattamento, così i costi ei tempi aggiuntivi coinvolto con poli-L-lisina o polietilene glicole rivestimento, ad esempio, non sarebbe giustificato.

Attraverso troubleshooting l'attività ottimale di amilasi è stato determinato. Per sezioni muscolari, è stato osservato che l'attività ottimale dell'amilasi è stata osservata entro 1 ora di incubazione. In tempi più lunghi sezioni muscolari sarebbero lentamente staccare la diapositiva, mentre entro tempi più brevi i tempi di amilasi non rimuovere adeguatamente il PAS-segnale. I tempi di incubazione amilasi per diapositive PBMC doveva essere ridotto rispetto alla temporizzazione muscolo-campione (che era 1 ora) fino al 15 min. Tempi più lunghi causato PBMC a venire fuori la diapositiva, mentre i tempi più brevi non hanno impatto efficacemente il PAS-segnale. Una modifica al protocollo standard di colorazione PAS stava cambiando il modo di lavare i vetrini. Le istruzioni del produttore indicate per lavare i vetrini con acqua corrente, che ha causato le cellule a venire fuori le diapositive. La modifica doveva lavare i vetrini con bottiglia squeezable lavaggio per conservare le cellule. Come descritto nella sezione critica passi, era molto importante non applicare direttamente all'acquapressione sulle cellule.

Ci sono alcune limitazioni di questa tecnica. La membrana delle cellule muscolari era macchiato con granuli puntiformi nel citoplasma della cellula muscolare. I granuli sono stati eliminati mediante trattamento amilasi e che possono quindi essere glicogeno, mentre la colorazione di membrana era insensibile alla amilasi. L'identità delle particelle PAS-positivi sulla membrana cellulare non è noto. Potrebbe essere la membrana basale muscolare (perimisio). Questa membrana avvolge i fasci muscolari e grazie al suo elevato contenuto glicoproteina è noto per essere PAS positive. Un'altra limitazione di colorazione PAS è che i granuli di glicogeno devono avere almeno 50 nm di diametro per essere visibili al microscopio ottico convenzionale. Così, granuli di glicogeno piccole potrebbero essere presenti in una cellula, ma ancora registrati negativo in un test PAS. Il secondo metodo utilizzato supera questa limitazione fornendo rilevamento di glicogeno in un lisato. In combinazione con una curva standard può essere utilizzato per determine l'esatta quantità di glicogeno. Sebbene questa tecnica è altamente quantificabile e non è limitata dalla dimensione dei granuli, essa stessa ha alcune limitazioni. Granuli di glicogeno sono complesse strutture ramificate con molte proteine ​​accessorie e chimico legami incrociati, il che rende improbabile che gli enzimi di idrolisi dissolvono completamente un'intera glicogeno molecola di ^13. Così, il enzimatica rilevamento (come la tecnica PAS) può sottorappresentare la quantità effettiva di glicogeno in un campione. Un modo per gestire questa limitazione è con il microscopio elettronico che risolve anche i più piccoli granuli di glicogeno ^14. Bisognerebbe impiegare una combinazione di queste tecniche, PAS-colorazione, digestione enzimatica e microscopia elettronica per la caratterizzazione più completa di glicogeno.

Questo articolo e il video dimostra l'acido Schiff (PAS) tecnica di pittura periodica adattato per l'uso su PBMC. Il significato di questo studio è visto nella scelta di utilizzarePBMC oltre striscio di sangue, che ha reso più fattibile per enumerare i linfociti. Inizialmente, una tecnica classica sangue striscio è stato testato, ma la maggior parte delle cellule sul vetrino sono state globuli rossi ed eventualmente neutrofili (Figura 4C). Per concentrare i linfociti, PBMC sono stati purificati dal sangue usando la tecnica gradiente di densità standard. Utilizzando una tecnica simile a sangue striscio, il PBMC prontamente aderito per la durata della procedura PAS, che ha molti lavaggi vigorosi. La tecnica PAS è stato usato per decenni per stabilire i livelli di glicogeno nelle biopsie dei tessuti muscolari, che sono tagliati in sezioni sottili e rispettati diapositive. PAS colorazione è stata scelta tra le altre sostanze chimiche carboidrati macchianti grazie alla sua elevata affidabilità e la presenza dei risultati attesi in letteratura. Un topo (Mus spretus) sezioni muscolari è stato utilizzato come controllo positivo e trovato, come previsto, che il 37% delle cellule erano PAS-positivi ^9. In termini di costi e tempi, preparando PBMC è più oneroso di uno striscio di sangue, ma ci sono diversi vantaggi. In primo luogo, la preparazione è più arricchito in linfociti, che sono le cellule di interesse per i progetti che ruotano su autoimmunità. Se sono stati utilizzati strisci di sangue, i linfociti sarebbero la minoranza, il che rende difficile trovare la cella di interesse. Bisognerebbe preparare e analizzare molti più diapositive per ottenere gli stessi numeri che si otterrebbe con alcune diapositive PBMC. I ricercatori sarebbero molto interessati a utilizzare la nuova tecnica ottimizzato in progetti autoimmunità legati al diabete di tipo 1, sclerosi multipla, lupus, artrite reumatoide, etc. dove linfociti T e B e le cellule NK hanno un ruolo. Naturalmente, per altre applicazioni in cui eritrociti o neutrofili sono di interesse sarebbe raccomandato striscio di sangue. L'altro vantaggio è che PBMC possono essere utilizzati per lo studio della biologia linfociti umani in vitro.

Una ricerca in corso sta indagando la fonte di glicogeno nei PBMC. Ion il futuro, si prevede di misurare il contenuto di glicogeno nel contesto della sclerosi multipla, una malattia autoimmune T linfociti mediata che colpisce circa 2,3 milioni di persone in tutto il mondo a partire dal 2013 ^15,16. Quali sono le piccole e grandi cellule nei campioni PBMC? Celle a 5 micron sono in linea con la linea linfoide nel loro stato di riposo. Linfociti T, linfociti B, cellule natural killer, e altri sottoinsiemi minori sono all'interno di questo intervallo di grandezza. Le PBMC grandi sono probabilmente composte da linfociti attivati, che crescono più grande come ricevono segnali infiammatori dal sistema immunitario, e monociti dalla linea mieloide. Separazione delle cellule tecniche avanzate come fluorescente attivato ordinamento delle cellule o l'ordinamento delle cellule magnetiche attivate sono necessari per perfezionare ulteriormente il sottoinsieme che esprime glicogeno.

Ematossilina contatore colorazione è stato utilizzato quando la colorazione è stato fatto su sangue intero. Questo ci ha permesso di distinguere monociti di eritrociti (Figura 4C). Quando la colorazione è stato fatto su PBMC, poiché tutte le cellule mononucleari erano, non vi era alcuna necessità di contrastare macchia con ematossilina per identificare le cellule. Anche ematossilina interferiva con il segnale PAS nelle cellule. In sintesi, abbiamo dimostrato una procedura PAS-colorazione adatto per PBMCs. Questa tecnica è utile per gli scienziati e medici che ricercano autoimmunità, infezioni e allergie.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Periodic Acid Shiff Kit	Sigma-Aldrich	395B	Bring to room temperature prior to use. Materials in this kit are toxic and harmful. Use caution.
α-Amylase from porcine pancreas	Sigma-Aldrich	A3176
Binocular Microscope	Carl Zeiss Microscopy	Axio Lab A0
Glycogen Assay Kit	Sigma-Aldrich	MAK016
Ficoll-Paque PLUS	VWR, GE Healthcare	17-1440-02	Nonionic synthetic polymer of sucrose.
Centrifuge			For PBMC isolation, swing buckets were used.