Abstract
ההדמיה של תחזיות עצביות באורך מלא בעוברים היא חיונית כדי לזכות בהבנה של איך יונקים רשתות עצביות לפתח. כאן אנו מתארים שיטה לתייג באתר משנה של גנגליון שורש הגבי תחזיות האקסון (DRG) כדי להעריך את המאפיינים פנוטיפי שלהם באמצעות כמה שורות עכבר מניפולציות גנטית. נוירונים TrkA חיובי נוירונים קולטן אזעקה, שהוקדשו להעברת אותות כאב. אנו מנצלים קו עכבר TrkA taulacZ לתייג המסלולים של כל האקסונים ההיקפיים TrkA החיובי בעובר העכבר ללא פגע. בנוסף, אנו להתרבות קו TrkA taulacZ על רקע null Bax, אשר למעשה מבטל אפופטוזיס העצבי, על מנת להעריך את השאלות הקשורות לצמיחה באופן עצמאי מהשפעות אפשריות של מניפולציות גנטיות על הישרדות עצבית. בהמשך לכך, עכברים מהונדסים גנטי של עניין הם התרבו עם taul TrkAקו וnull acZ / Bax אז הם מוכנים למחקר באמצעות הטכניקות המתוארות במסמך זה. מצגת זו כוללת מידע מפורט על תוכניות רבייה עכבר, genotyping בזמן הנתיחה, הכנת רקמה, צביעה וסליקה, כדי לאפשר ויזואליזציה של מסלולי axonal באורך מלא בהכנה כל הר.
Introduction
הקמת רשתות עצביות מדויקות היא תהליך התפתחותי מורכב חיוני לפעולה התקינה של מערכת העצבים. הפרעה בתהליך זה מובילה לבעיות בתפקוד עצביים שהיה מעורב במחלות נוירולוגיות אנושיות 1-3. כדי לחקור את המנגנונים מולקולריים שבבסיס של צמיחת האקסון ועצבוב היעד ביונקים, שפיתחנו פרוטוקול לדמיין מסלולי axonal של TrkA להביע עצב סנסורי באמצעות שילוב של שני קווי עכבר מהונדסים גנטי.
TrkA הוא קולטן לגורם גדילה עצבית NGF ומהווה סמן תפקודי של עצב סנסורי nociceptive 4. TrkA מתבטא מאוד בתאי עצב nociceptive במהלך התפתחות מוקדמת ומתווך הישרדות NGF תלוי נוירון, צמיחת האקסון, arborization ויעד עצבוב 5-9. בעכברי TrkA taulacZ, גן TrkA הסוג בר הוא הוחלף על ידי ג ביטוי taulacZ10 assette, כך שמורפולוגיה axonal של נוירונים TrkA החיובי משוערים ניתן דמיינה ידי β-gal (X-gal) מכתים 11. באמצעות קו TrkA taulacZ / WT הטרוזיגוטיים, אנו יכולים לבחון גורמים שעשויים לווסת או להפריע להתפתחות של תחזיות מביא חושיות in vivo.
יתר על כן, ביטוי TrkA נעדר בעכברי TrkA taulacZ / taulacZ הומוזיגוטים, אשר על כן ניתן להשתמש בו כדי להעריך את צמיחת האקסון קידום מנגנונים בהעדר איתות NGF / TrkA. מאז הנוירונים nociceptive תלויים בNGF / TrkA איתות לא רק לצמיחת האקסון, אלא גם להישרדות, אנו מעסיקים קו עכבר אחר, חסר את גן Bax פרו-אפופטוטיים, לעכב אפופטוזיס בתאי עצב DRG עוברי, מציל אותם ממוות של תאים שהוא אחרת נצפה בהעדר איתות TrkA. Bax - / - הרקע 12 וכך מאפשר לmolecuנתיחת lar של מסלולי איתות שדווקא משפיעים 7-9,13-15 צמיחת האקסון. בTrkA - / -: Bax - / - עכברים, תאי עצב DRG לשרוד, אבל עצבוב מביא חושי בעור הוא בוטל לחלוטין 14,15. אנחנו באופן סלקטיבי יכולים להפעיל מסלולי איתות כדי לקבוע התרומות שלהם לפיתוח תחזיות האקסון. השירות של שיטה זו הוא שהיא מאפשרת ההערכה של שינויים בפנוטיפים צמיחת axonal כאשר שינויים גנטיים שונים הם התרבו על TrkA taulacZ / taulacZ: Bax - / - או TrkA taulacZ / WT: Bax - / - רקע.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: כל הנהלים עומדים במדריך NIH לשימוש וטיפול בחי מעבדה. פרוטוקול בעלי החיים אושר על ידי IACUC במכללה רפואית ווייל קורנל.
1. רקמות הכנה
- להרדים נקבות מתוזמן-הריון על ידי צוואר רחם עקירה 15. לנתח E16 עובריים - עוברי E18 מנקבות מתוזמן-הריון ועוברי מקום בנפרד בבארות של צלחת 6-גם, מלאות מלוח פוספט הקר שנאגרו (PBS).
- יש לשטוף את העוברים בקור PBS.
- הסר חלק קטן של הקרום מי השפיר של העובר והמקום בפתרון K proteinase מוכן מראש עבור genotyping שלאחר מכן. לחלופין, אם הקרום מי השפיר הולך לאיבוד, להסיר חלק קטן מקצה זנב העובר ולמקם אותו בפתרון K proteinase
- חורים לתוך העור בכל רחבי העובר באמצעות סיכות חרקים (לפחות 100 לכל צד).
- הסר PBS ולאט לאט להוסיף paraformaldehyde 2% טריים (PFA),pH 7.4, ול.
- נער בעדינות לשעה 2 ב 4 ° C.
- יש לשטוף את עוברי פעמים PBS ולאחסן PBS ב 4 מעלות צלזיוס עד צביעה.
2. Genotyping
- לטבול את הקרומים מי שפיר או זנבות עובר בתערובת K proteinase לפי הוראות היצרן.
- לדגור על 56 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
- לחלץ DNA באמצעות ערכת טיהור DNA זמינה מסחרי.
- קח 0.5 μl של 200 μl הכולל מטוהר פתרון הדנ"א הגנומי, לשלב את זה עם 0.5 μl של כל אחד מצבעי יסוד הגן ספציפי תחושה וantisense (10 מיקרומטר), 2 μl dNTP Mix (2.5 מ"מ של dATP, dCTP, dGTP וdTTP) , 0.2 פולימראז μl תקי (5 U / μl) וחיץ 2 μl PCR (10x), להוסיף H 2 O כדי בהיקף כולל של 20 μl.
הערה: רצפי פריימר הם כדלקמן (טבלה 1):
TrkA: TrkA_F: GCG GGC GCC GCC GCG ATG, TrkA_R: GAA GCC GCC TGC GCG GCT CTG CCA GGG TG; frag PCRאורך ment: 400 basepairs (נ"ב).
Bax: In5R: GTT GAC CAG AGT GGC GTA GG, Ex5F: TGA TCA GAA CCA TCA TG, NeoR: CCG CTT CCA TTG CTC AGC GG; אורכי PCR בר: סוג בר, 304 נ"ב; null Bax, 507 נ"ב.
TauLacZ: lacZup: ACA ACG TCG TGA GTG GGA AAA, lacZdown: ATC AAC ATT AAA TGT GAG CGA G; אורך PCR בר: 360 נ"ב. - הפעל PCR עם התכנית לTrkA הבאה: שלב 1: 1 דקות על 95 מעלות צלזיוס, שלב 2: 10 שניות על 95 מעלות צלזיוס, שלב 3: 20 שניות על 68 מעלות צלזיוס, שלב 4: 30 שניות על 72 מעלות צלזיוס. חזור על שלבים 2-4 במשך 40 מחזורים.
- לLacZ וBax, לרוץ PCR עם התכנית הבאה: צעד 1: 1 דקות על 95 מעלות צלזיוס, שלב 2: 10 שניות על 95 מעלות צלזיוס, שלב 3: 1 דקות על 54 ° C, שלב 4: 1 דקות ב 72 מעלות צלזיוס, חזור על השלבים 2-4 במשך 35 מחזורים.
- דגימות הפעלת PCR על ג'ל 2% agarose ב 100 V במאגר 1x טריס-אצטט-EDTA במשך 20 דקות עם נתיב של סולם DNA להעריך אורכי בר.
- לנתח עובר לנוכחות של הסוג בר TrkA, TrkA-tauLacZ וBax אללים null. גנוטיפים של עוברים ניסיוניים הם TrkA taulacZ / WT: Bax - / - וTrkA taulacZ / taulacZ: Bax - / -, בהתאם לשאלות הניסיוניות. העוברים חסרי כתב tauLacZ יהיו שליליים עבור מכתים axonal ולכן יכולים לשמש בקרות שליליות לכייל את תהליך הצביעה.
3. העובר מכתים
- השתמש בערכה מסחרית מכתים lacZ עם כמה שינויים כמפורט להלן בסעיפי 3.2-3.8. כאן, השתמש בערכת Millipore.
- לטבול את העוברים במאגר לשעה לפחות 1, רועדים בעדינות בטמפרטורת חדר.
- ישירות לטבול עוברים במאגר B לפחות 15 דקות, רועד בעדינות בטמפרטורת חדר.
- בעוד עוברים נמצאים במאגר A / B, פתרון Base רקמות טרום חם על 37 מעלות צלזיוס. השתמש 5 מיליליטר של תמיסת בסיס רקמות לעובר.
- בעוד עוברים נמצאים במאגר A / B, להכין 5-br הטריomo- 4 כלורופורם 3 indolyl α-D-galactopyranoside (X-gal) בריכוז של 40 מ"ג / מיליליטר ב 100 sulfoxide דימתיל% (DMSO).
- לדלל X-gal לפתרון בסיס רקמות המחומם מראש בריכוז של 1 מ"ג / מ"ל ולהוסיף 5 מיליליטר של X-gal / תערובת בסיס רקמות לבקבוקון נצנץ זכוכית.
- העבר את העוברים לבקבוקון נצנץ זכוכית המכיל תערובת Base X-gal / רקמות. לאטום את המכסה עם Parafilm ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה, בדיקה לנוכחות של כתם כחול.
- עוברי Postfix עם 4% טריים PFA, pH 7.4. נער בעדינות במשך 4 שעות על 4 מעלות צלזיוס.
- יש לשטוף את העוברים פעמים PBS הקר.
4. רקמות התייבשות וסליקה
- עוברי מקום ב -50% מתנול / 50% תערובת PBS למשך 30 דקות בטמפרטורת חדר, רועדות בבקבוקוני הזכוכית.
- המשך ליבש במתנול 75% / 25% PBS למשך 30 דקות בטמפרטורת חדר, רועד בבקבוקוני זכוכית.
- המשך ליבש ב -90% מתנול / 10% PBS למשך 30 דקות בטמפרטורת חדר, רועדות בבקבוקוני זכוכית.
- המשך ליבש במתנול 100% למשך 30 דקות (2x) בטמפרטורת חדר, רועד בבקבוקוני זכוכית.
- בעוד עוברים להתייבשות, להכין 1: 1 (v: v) תערובת של אלכוהול ונזואיל נזואיל בנזואט.
הערה: בנזואט האלכוהול בנזואיל ונזואיל הוא רעיל. - לטבול את העוברים ב1: 1 (v: v) תערובת של מתנול 100%: 100% באב במשך 15 דקות. השתמש אך ורק משום שזכוכית באב יתמוסס פלסטיק.
- לטבול את העוברים ב100% באב לברור לחלוטין הרקמה ולדמיין צביעת X-gal בעובר פינה.
הערה: תמונה בהקדם האפשרי משום שכתם X-gal יימוג לאורך זמן.
5. הר שלם הדמיה
- לייצב את העובר, שקוע ב100% באב, בזוויות המתאימות למלקחי מתכת צילום באמצעות. להאיר באמצעות שילוב של מקורות עד-אור ותחת אור אור.
- לרכוש תמונות עם מיקרוסקופ לנתחמצויד במצלמה דיגיטלית. קח חשיפות שדה בהירות מרובות בחמישה מטוסי מוקד רצופים 0.5 מ"מ זה מזה לאורך ציר Z. זמני חשיפה וF- מפסיק עשויות להשתנות בהתאם למפרט תאורה ומצלמה וצריכים להיות מותאמים לכל התקנה.
- השתמש בתוכנת עיבוד תמונה סטנדרטית לעיבוד תמונות כיסוי וליצור photomontages.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
גנוטיפים של TrkA WT / taulacZ: Bax - / - וTrkA taulacZ / taulacZ: Bax - / - עוברים ניתן לקבוע באופן חד משמעי על ידי genotyping PCR הסטנדרטי (איור 1). מציגה צביעת X-gal מפורט סוכות axonal היקפיים תת עורי בעוברים מוכתמים קונבנציונלי (איורים 2, 3 א), ובכל רחבי העובר לאחר סליקת רקמה (3 ב איורים, 4).
יש לנו גידלנו TrkA WT / taulacZ: Bax - / - קו עם עכברים שנשאו B RAF-המוטציה constitutively המופעל קינאז (V600E) (LSL-kaBraf 16) תחת שליטה של אמרגן nestin נוירון ספציפי 17, להשיג LSL- kaBraf: TrkA taulacZ / taulacZ: Bax - / - עכברים. בעוברים אלה, אשר חסרים איתות TrkA לחלוטין, המורפולוגיה של תחזיות היקפי קולטן אזעקה בכל זאת פיתחה כמעט נורמלית (איור 4). זה מדגיםפונקציה חיונית sa לB-RAF איתות בצמיחת האקסון היקפי, וגם מראה כי ההישרדות וצמיחת האקסון-קידום פונקציות של איתות TrkA ניתן להפריד, עם Bax - / - הרקע הגנטי מחליף את ההפסד של הישרדות TrkA תלויה איתות .
איור 1: Genotyping של העכברים הטרנסגניים תמונות agarose ג'ל נציג.. דוגמא 1: TrkA WT / taulacZ: Bax WT / -, מדגם 2: TrkA taulacZ / taulacZ: Bax - / -, מדגם 3: TrkA WT / taulacZ: Bax - / -.
איור 2: E18.5 TrkA WT / taulacZ עכבר מוכתם בX-gal תחזיות אקסון מגרעיני trigeminal בפלג גוף עליון וhea.ד מוצג בעובר הבלתי מסולקת. בר סולם: 1 מ"מ.
איור 3:. עכבר E18.5 TrkA WT / taulacZ המוכתם בX-gal () לפני ו( B) לאחר ניקוי עם באב תחזיות מDRGs באמצע גוף-מוצג. בר סולם: 2 מ"מ.
איור 4: E16.5 LSL-kaBraf: TrkA taulacZ / taulacZ: Bax - / -:. Nestin-Cre עובר העכבר מוכתם בX-gal ופינה עם באב kaBraf מקודד-B RAF חלבון kinase מופעל קינאז, B-RAF V600E. ביטוי של קבין-RAF בנוירונים DRG הביא באורך מלא, בסמוך לרחבת האקסון נורמלי בהעדר איתות TrkA. בר סולם: 1 מ"מ. לתמונות נוספות כוללים בקרות, ראה נ"צ. 15, איור2.
| Primers המשמש לgenotyping PCR | ||
| 1 | TrkA | גודל שבר DNA: 400 נ"ב |
| TrkA_F | GCG GGC GCC GCC GCG ATG | |
| TrkA_R | GCT GAA GCC GCC TGC GCG CTG CCA GGG TG | |
| 2 | Bax | גודל שבר DNA: 304 נ"ב (סוג בר), 507 נ"ב (null Bax) |
| In5R | GTT GAC CAG AGT GGC GTA GG | |
| Ex5F | GAA TCA TGA CCA TCA TG | |
| NeoR | CCG CTT CCA TTG CTC AGC GG | |
| 3 | TauLacZ | גודל שבר DNA: 360 נ"ב |
| lacZup | ACA ACG TCG TGA GTG GGA AAA | |
| lacZdown | AAC ATC ATT AAA TGT GAG CGA G | |
טבלה 1: Primers המשמש לgenotyping PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ההליך מכתים X-gal-שתואר לעיל של עכברי TrkA taulacZ עובריים מאפשר ההדמיה המהירה ומפורטת של תחזיות האקסון למרחקים ארוכים בעובר הקבוע בשלמותה. בגלל רקע null Bax עכברים אלה מאפשרים לחיטוט של איתות מנגנונים שעשויות לתרום לצמיחת שני האקסון והישרדות עצבית. הזדווגות עם עכברים מהונדסים או בנוקאאוט של עניין מאפשרת להערכה מקיפה של פנוטיפים axonal ויכול לשמש כמדריך שימושי לניסויים עתידיים לבחון איתות צמיחת האקסון באופן מפורט יותר. אתגר גדול עבור במחקרי vivo צמיחת האקסון הוא הזמן להכין רקמה חלקים ולהעריך את פנוטיפים המורכבים של אקסונים הגובר שעשויות להיות מושפע במספר דרכים על ידי כל מניפולציה גנטית. TrkA taulacZ / taulacZ: Bax - / - קו מאפשר הערכה של השפעות המלאה של גןריבית על פיתוח האקסון קולטן האזעקה היקפי.
הטכניקה מוגבלת להדמיה של מסלולי axonal קולטן אזעקה שבדרך כלל להביע TrkA במהלך שלבי התפתחות המוקדמים. בנוסף לnociceptors ההיקפי, זה עשוי להיות אפשרי לדמיין תחזיות כולינרגית המוח הקדמי אוהדות ובסיסיות; אולם זה היה דורש אופטימיזציה ספציפית של טכניקות צביעה
סליקת רקמות היא צעד מפתח של הפרוטוקול המתואר כאן. הוא מאפשר הערכה מפורטת של תחזיות עמוקות שוכבים בהכנות-הר שלמות ובכך זיהוי הפוטנציאל של פנוטיפים שונים. כתבי ניאון, כגון tdTomato או כתבי GFP 18,19, עשויים להציע בהירות חזותית בתנאים מסוימים, אבל זה קשה לרכוש דימוי הר שלם כי יש לנו גילו כי בניגוד לצביעת X-gal, אותות ניאון לדעוך באופן משמעותי במהלך הליך סליקת רקמה. DiIמכתים גם בשימוש נרחב לתיוג האקסון 20; חסרונותיו הם שהוא לא יכול באופן סלקטיבי תווית תת סוג ספציפי של אקסונים כגון סיבי קולטן האזעקה כאן, וקשה לתייג באופן מלא מסלולים ארוכים בפריפריה.
לסיכום, אנו מציעים פרוטוקול שמשתמש בשילוב של שני קווי עכבר מהונדסים גנטי כדי לאפשר להדמיה שגרתית של סוכות המלאה של אקסונים nociceptive בעובר העכבר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות לד"ר לואיס Reichardt לעכברי TrkA taulacZ וד"ר אנט מרקוס לדיון והצעות תובנה. עבודה זו נתמכה על ידי קרנות הפעלה מהקרן בורק כמו גם המענק וייטהול קרן מחקר 2010-08-61, מענק מחקר מכנפיים לקרן חיים (WFL-ארה"ב-028/14), להעניק ZB1-1102-1 מ כריסטופר ודנתי ריב קרן, ומענקים 1R01EY022409 ו3R01EY022409-01S1 מהעין הלאומית, לJZ. KJO הוא עמית גולדסמית.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PFA | Sigma-Aldrich | P6418 | |
| PBS | Life Tech | 10010-023 | |
| Tissue Rinse Solution A | Millipore | BG-6-B | |
| Tissue Rinse Solution B | Millipore | BG-7-B | |
| Tissue Stain Base Solution | Millipore | BG-8-C | |
| X-gal | Sigma-Aldrich | B4252 | |
| Glass scintiallation vial | Kimble Chase | 74500-20 | |
| Incubator | Labline | Model 120 | |
| Insect pins | FST | 26000-30 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| 6-well dish | USA Scientific | CC7672-7506 | |
| Primers | IDT | custom DNA primers | |
| Takara dNTP mixture | Takara | 4030 | |
| Takara LA buffer | Takara | RR002A | |
| Takara LA Taq | Takara | RR002A | |
| PCR machine | Bio-Rad | DNA Engine Dyad | |
| Benzyl alcohol | Sigma-Aldrich | B-1042 | |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | B-6630 | |
| Dissecting microscope | Leica | M205A | |
| Camera | Leica | DFC310FX | |
| Ring light | Leica | MEB110 | |
| Photoshop | Adobe | Photoshop 4.0 |
References
- Verze, L., et al. Cutaneous innervation in hereditary sensory and autonomic neuropathy type IV. Neurology. 55, 126-128 (2000).
- Sethna, N. F., Meier, P. M., Zurakowski, D., Berde, C. B. Cutaneous sensory abnormalities in children and adolescents with complex regional pain syndromes. Pain. 131, 153-161 (2007).
- Uceyler, N., et al. Small fibers in Fabry disease: baseline and follow-up data under enzyme replacement therapy. J Peripher Nerv Syst. 16, 304-314 (2011).
- Reichardt, L. F., Mobley, W. C. Going the distance, or not, with neurotrophin signals. Cell. 118, 141-143 (2004).
- White, F. A., et al. Synchronous onset of NGF and TrkA survival dependence in developing dorsal root ganglia. J Neurosci. 16, 4662-4672 (1996).
- Farinas, I., Wilkinson, G. A., Backus, C., Reichardt, L. F., Patapoutian, A. Characterization of neurotrophin and Trk receptor functions in developing sensory ganglia: direct NT-3 activation of TrkB neurons in vivo. Neuron. 21, 325-334 (1998).
- Markus, A., Zhong, J., Snider, W. D. Raf and akt mediate distinct aspects of sensory axon growth. Neuron. 35, 65-76 (2002).
- Kuruvilla, R., et al. A neurotrophin signaling cascade coordinates sympathetic neuron development through differential control of TrkA trafficking and retrograde signaling. Cell. 118, 243-255 (2004).
- Zhong, J., et al. Raf kinase signaling functions in sensory neuron differentiation and axon growth in vivo. Nature. 10, 598-607 (2007).
- Bulfone, A., et al. An olfactory sensory map develops in the absence of normal projection neurons or GABAergic interneurons. Neuron. 21, 1273-1282 (1998).
- Moqrich, A., et al. Expressing TrkC from the TrkA locus causes a subset of dorsal root ganglia neurons to switch fate. Nature. 7, 812-818 (2004).
- Knudson, C. M., Tung, K. S., Tourtellotte, W. G., Brown, G. A., Korsmeyer, S. J. Bax-deficient mice with lymphoid hyperplasia and male germ cell death. Science. 270 (5233), 96-99 (1995).
- Lentz, S. I., Knudson, C. M., Korsmeyer, S. J., Snider, W. D. Neurotrophins support the development of diverse sensory axon morphologies. J. Neurosci. 19, 1038-1048 (1999).
- Patel, T. D., Jackman, A., Rice, F. L., Kucera, J., Snider, W. D. Development of sensory neurons in the absence of NGF/TrkA signaling in vivo. Neuron. 25, 345-357 (2000).
- Donovan, K. J., et al. B-RAF kinase drives developmental axon growth and promotes axon regeneration in the injured mature CNS. The Journal of experimental medicine. 211, 801-814 (2014).
- Mercer, K., et al. Expression of endogenous oncogenic V600EB-raf induces proliferation and developmental defects in mice and transformation of primary fibroblasts. Cancer research. 65, 11493-11500 (2005).
- Tronche, F., et al. Disruption of the glucocorticoid receptor gene in the nervous system results in reduced anxiety. Nature genetics. 23, 99-103 (1999).
- Madisen, L., et al. A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-induced activation and silencing. Nat Neurosci. 15, 793-802 (2012).
- Feng, G., et al. Imaging Neuronal Subsets in Transgenic Mice Expressing Multiple Spectral Variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Schmidt, H., Rathjen, F. G. DiI-labeling of DRG neurons to study axonal branching in a whole mount preparation of mouse embryonic spinal cord. J Vis Exp. , (2011).
