Abstract
Visualisering av helaftens nevronale anslag i embryoer er viktig å få en forståelse av hvordan pattedyr nevrale nettverk utvikle. Her beskriver vi en metode for å merke in situ en undergruppe av dorsal root ganglion (DRG) axon anslag for å vurdere deres fenotypiske egenskaper ved hjelp av flere genetisk manipulerte mus linjer. TrkA-positive nevroner er nociceptor nevroner, dedikert til overføring av smerte signaler. Vi bruker et TrkA taulacZ mus linje å merke baner av alle trkA--positive perifere axoner i intakt museembryo. Vi avler videre TrkA taulacZ linje på en Bax null bakgrunn, som i hovedsak opphever nerveapoptose, for å vurdere vekstrelaterte spørsmål uavhengig av mulige effekter av genetiske manipulasjoner på neuronoverlevelse. Deretter blir genmodifiserte mus av interesse avlet med TrkA TaulACZ / Bax null linje og er deretter klar for studien ved hjelp av teknikker som er beskrevet her. Denne presentasjonen inneholder detaljert informasjon om muse avl planer, genotyping på tidspunktet for disseksjon, vev forberedelse, beising og rydding for å tillate visualisering av helaftens aksonale baner i hel-mount forberedelse.
Introduction
Etablering av presise nevrale nettverk er en kompleks utviklingsprosess viktig for funksjonaliteten av nervesystemet. Forstyrrelse i denne prosessen fører til nevronal dysfunksjon, som har vært implisert i humane nevrologiske sykdommer 1-3. Å studere de underliggende molekylære mekanismene for axon vekst og mål innervasjon i pattedyr, har vi utviklet en protokoll for å visualisere de aksonale baner av TrkA-uttrykke sensoriske nevroner ved bruk av en kombinasjon av to genmodifiserte mus linjer.
TrkA er en reseptor for NGF nervevekstfaktor, og er en funksjonell markør for nociceptive sensoriske nevroner 4. TrkA er sterkt uttrykt i nociceptive nevroner under tidlig utvikling og formidler NGF-avhengige nevron overlevelse, axon vekst, arborization og mål innervation 5-9. I TrkA taulacZ mus, er villtype TrkA-genet erstattet med et taulacZ ekspresjon cAssette 10, slik at aksonal morfologi putative trkA-positive nevroner kan visualiseres ved β-gal (X-gal) farging 11. Ved hjelp av en heterozygot TrkA taulacZ / WT linje, kan vi undersøke faktorer som kan regulere eller forstyrre utviklingen av sensoriske afferente anslag in vivo.
Videre er TrkA ekspresjon fraværende i homozygot TrkA taulacZ / taulacZ mus, som derfor kan brukes til å vurdere axon vekstfremmende mekanismer i fravær av NGF / TrkA signalering. Siden nociceptive neuroner avhenger av NGF / TrkA signalering, ikke bare for axon vekst, men også for å overleve, anvender vi en annen muselinje som mangler den pro-apoptotiske Bax-genet, for å hemme apoptose i embryonale DRG-neuroner, redning dem fra celledød som ellers observert i fravær av TrkA signalering. Den Bax - / - bakgrunn 12 tillater dermed for molecuLar disseksjon av signalveier som spesifikt påvirker axon vekst 7-9,13-15. I TrkA - / -: Bax - / - mus, DRG nevroner overleve, men sensorisk afferent innervasjon i huden er fullstendig avskaffet 14,15. Vi kan selektivt aktivere signalveier å bestemme sine respektive bidrag til utviklingen av axon anslag. Nytten av denne fremgangsmåte er at den gjør det mulig å vurdere endringer i aksonal vekstfenotyper når forskjellige genetiske modifikasjoner er avlet på TrkA taulacZ / taulacZ: Bax - / - eller TrkA taulacZ / WT: Bax - / - bakgrunner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Alle prosedyrer i samsvar med NIH Guide for bruk og vedlikehold av forsøksdyr. Dyret protokollen ble godkjent av IACUC ved Weill Cornell Medical College.
1. Vevspreoarerlng
- Avlive timet-graviditet hunner ved halshugging 15. Dissekere embryoniske E16 - E18 embryoer fra tidsbestemte-graviditet hunner og plassere embryoer individuelt i brønnene i en 6-brønners skål, som er fylt med kaldt fosfatbufret saltvann (PBS).
- Skyll embryo i kald PBS.
- Fjerne en liten del av fostermembran av embryoet og plasseres i en forhånds forberedt proteinase K-løsning for etterfølgende genotyping. Alternativt, hvis fostermembran er tapt, fjerne en liten del av spissen av embryoet halen og plassere den i proteinase K-løsning
- Stikke hull i huden rundt embryoet ved hjelp av insekt pinner (minst 100 pr side).
- Fjern PBS og sakte legge fersk 2% Paraformaldehyde (PFA),pH 7,4, til brønnen.
- Rist forsiktig i 2 timer ved 4 ° C.
- Skyll embryoer to ganger i PBS og lagres i PBS ved 4 ° C inntil farging.
2. Genotyping
- Fordype amniotiske membraner eller embryo haler i proteinase K blanding i henhold til produsentens instruksjoner.
- Inkuber ved 56 ° C i 10 min.
- Pakk DNA ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig DNA rensing kit.
- Ta 0,5 ul av de totale 200 ul renset genomisk DNA-oppløsning, kombinere det med 0,5 ul av hver av genspesifikke sense og antisense-primere (10 uM), 2 pl dNTP mix (2,5 mM dATP, dCTP, dGTP og dTTP) , 0,2 pl Taq-polymerase (5 U / pl) og 2 pl PCR-buffer (10x), tilsett H2O til et totalvolum på 20 ul.
MERK: Primer sekvenser er som følger (tabell 1):
TrkA: TrkA_F: GCG GGC GCC GCC GCG ATG, TrkA_R: GAA GCC GCC TGC GCG GCT CTG CCA GGG TG; PCR fragling Lengde: 400 basepar (bp).
Bax: In5R: GTT GAC CAG AGT GGC GTA GG, Ex5F: TGA TCA GAA CCA TCA TG, NeoR: CCG CTT CCA TTG CTC AGC GG; PCR fragment lengder: villtype, 304 bp; Bax null, 507 bp.
TauLacZ: lacZup: ACA ACG TCG TGA GTG GGA AAA, lacZdown: ATC AAC ATT AAA TGT GAG CGA G; PCR fragment lengde: 360 bp. - Kjøre en PCR med følgende program for TrkA: trinn 1: 1 min ved 95 ° C, trinn 2: 10 sek ved 95 ° C, trinn 3: 20 sek ved 68 ° C, trinn 4: 30 sek ved 72 ° C. Gjenta trinn 2 - 4 til 40 sykluser.
- For LacZ og Bax, kjøre en PCR med følgende program: trinn 1: 1 min ved 95 ° C, trinn 2: 10 sek ved 95 ° C, trinn 3: 1 min ved 54 ° C, trinn 4: 1 min ved 72 ° C, gjenta trinn 2 - 4 til 35 sykluser.
- Run PCR-prøver på en 2% agarosegel ved 100 V i 1x Tris-acetat-EDTA-buffer i 20 min med et kjørefelt av DNA stige for å vurdere fragmentlengder.
- Analyser embryoer for tilstedeværelsen av villtype TrkA, TRKA-tauLacZ og Bax null alleler. Genotypene av eksperimentelle embryoer er TrkA taulacZ / WT: Bax - / - og TrkA taulacZ / taulacZ: Bax - / -, avhengig av de eksperimentelle spørsmål. Embryoer som mangler tauLacZ reporter vil være negativ for aksonal farging og kan derfor tjene som negative kontroller for å kalibrere fargeprosessen.
3. Embryo Farging
- Bruke et kommersielt kit for lacZ farging med noen modifikasjoner som beskrevet nedenfor i avsnitt 3.2 til 3.8. Her bruker den Millipore kit.
- Dyppe embryo i Buffer A i minst 1 time, forsiktig risting ved romtemperatur.
- Direkte fordype embryoene i Buffer B i minst 15 min, rister forsiktig ved romtemperatur.
- Mens embryoer er i Buffer A / B, pre-varm Tissue baseoppløsning ved 37 ° C. Bruk 5 ml Tissue Base løsning per embryo.
- Mens embryoer er i Buffer A / B, forberede frisk 5-bromo- 4- klor-3- indolyl α-D-galaktopyranosid (X-gal) i en konsentrasjon på 40 mg / ml i 100% dimetylsulfoksid (DMSO).
- Fortynn X-gal til den forvarmede Tissue baseoppløsning ved en konsentrasjon på 1 mg / ml og tilsett 5 ml X-gal / Tissue Base blandingen til et scintillasjonsglass.
- Overfør embryoer i et scintillasjonsglass inneholdende X-gal / Tissue baseblanding. Forsegle lokket med Parafilm og inkuber ved 37 ° C over natten, for å kontrollere tilstedeværelsen av blå flekk.
- Postfix embryoer med frisk 4% PFA, pH 7,4. Rist forsiktig i 4 timer ved 4 ° C.
- Skyll embryo to ganger i kald PBS.
4. Tissue Dehydrering og Clearing
- Plasser embryoer i 50% metanol / 50% PBS blandingen i 30 minutter ved romtemperatur, risting i glassampullene.
- Fortsett å dehydrere i 75% metanol / 25% PBS i 30 minutter ved romtemperatur, risting i glassflasker.
- Fortsett å dehydrere i 90% metanol / 10% PBS i 30 minutter ved romtemperatur, risting i glassflasker.
- Fortsett å dehydrere i 100% metanol i 30 min (2x) ved romtemperatur, risting i glassflasker.
- Mens embryoer blir dehydratisering, fremstille en 1: 1 (v: v) blanding av benzoyl alkohol og benzoyl benzoat.
MERK: Benzoyl alkohol og benzoyl benzoat er giftig. - Dyppe embryo i 1: 1 (v: v) blanding av 100% metanol: 100% Babb i 15 min. Bruk kun glass fordi Babb vil oppløse plast.
- Fordype embryoer i 100% Babb til helt klart vevet og for å visualisere X-gal flekker i ryddet embryo.
MERK: Bilde så snart som mulig fordi X-gal flekken vil svekkes over tid.
5. Hele Mount Imaging
- Stabilisere embryo, nedsenket i 100% Babb, på de riktige vinkler for fotografering ved hjelp av metall tang. Belyse ved hjelp av en kombinasjon av up-light og under-lys lys kilder.
- Hente bilder med en dissekere mikroskoputstyrt med et digitalt kamera. Ta flere lyse felt eksponeringer på fem påfølgende fokalplanene 0,5 mm fra hverandre langs Z-aksen. Eksponeringstider og blenderåpninger kan variere avhengig av belysning og kamera spesifikasjoner og må være optimalisert for hver enkelt oppsett.
- Bruk standard bildebehandling programvare for å behandle overlegg bilder og generere fotomontasjer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Genotypene av TrkA WT / taulacZ: Bax - / - og TrkA taulacZ / taulacZ: Bax - / - embryo kan entydig bestemmes av standard PCR genotyping (figur 1). X-gal-farging viser detaljerte perifere aksonal dor subkutant i konvensjonelt farget embryoer (figurene 2, 3a), og i hele embryoet etter at vevet lysning (fig 3b, 4).
Vi har oppdrettet trkA WT / taulacZ: Bax - / - linje med mus som bærer den konstitutivt kinase-aktiverte B-RAF (V600E) mutasjon (LSL-kaBraf 16) under styring av neuron-spesifikke promoter nestin 17, for å oppnå LSL- kaBraf: TrkA taulacZ / taulacZ: Bax - / - mus. I disse embryoer, som fullstendig mangler TrkA signalering, morfologi nociceptor perifere fremspring likevel utviklet nesten normalt (figur 4). Dette demonstreres en viktig funksjon for B-RAF signalering i omkrets axon vekst, og også viser at overlevelsen og axon-vekstfremmende funksjoner av TrkA signalering kan adskilles, med Bax - / - genetisk bakgrunn å erstatte tapet av TrkA-avhengige overlevelse signale .
Figur 1: genotyping av de transgene mus Representative agarosegel bilder.. Prøve 1: TrkA WT / taulacZ: Bax WT / -, prøve 2: TrkA taulacZ / taulacZ: Bax - / -, prøve 3: TrkA WT / taulacZ: Bax - / -.
Figur 2: E18.5 TrkA WT / taulacZ mus farget med X-gal Axon anslag fra trigeminusgangliene i overkroppen og hea.d er vist i en innskuddet embryo. Målestokk: 1 mm.
Figur 3:. E18.5 TrkA WT / taulacZ mus farget med X-gal (A) før og (B) etter avregning med Babb Anslag fra DRG i mid-torso vises. Målestokk: 2 mm.
Figur 4: En E16.5 LSL-kaBraf: TrkA taulacZ / taulacZ: Bax - / -:. Nestin-Cre mus embryo farget med X-gal og klarert med Babb kaBraf koder en kinase aktivert B-RAF kinase protein, B-RAF V600E. Uttrykk for KAB-RAF i DRG nevroner resultert i full-lengde, i nærheten av normal axon forlengelse ved fravær av TrkA signalering. Målestokk: 1 mm. For flere bilder, inkludert kontroller, se ref. 15, figur2.
| Primere som brukes for PCR genotyping | ||
| 1 | TrkA | DNA fragment størrelse: 400 bp |
| TrkA_F | GCG GGC GCC GCC GCG ATG | |
| TrkA_R | GAA GCC GCC TGC GCG GCT CTG CCA GGG TG | |
| 2 | Bax | DNA fragment størrelse: 304 bp (wild type), 507 bp (Bax null) |
| In5R | GTT GAC CAG AGT GGC GTA GG | |
| Ex5F | TGA TCA GAA CCA TCA TG | |
| NeoR | CCG CTT CCA TTG CTC AGC GG | |
| 3 | TauLacZ | DNA fragment størrelse: 360 bp |
| lacZup | ACA ACG TCG TGA GTG GGA AAA | |
| lacZdown | ATC AAC ATT AAA TGT GAG CGA G | |
Tabell 1: Primere anvendt for PCR genotyping.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den ovenfor beskrevne X-gal-farging Måten i embryonale TrkA taulacZ mus muliggjør den raske og detaljert visualisering av lang avstand axon spring i intakt fast embryo. På grunn av den Bax null bakgrunns disse musene tillate for sondering av signaleringsmekanismer som kan bidra til både axon vekst og neuronal overlevelse. Parring med transgene eller knockout mus av interesse åpner for omfattende vurdering av aksonale fenotyper og kan tjene som nyttig guide for fremtidige eksperimenter for å undersøke axon vekst signalisering i en mer detaljert måte. En stor utfordring for in vivo axon vekststudier er det tid til å forberede vev seksjoner og vurdere komplekse fenotyper av voksende axoner som kan bli berørt på flere måter av noen genetisk manipulasjon. Den TrkA taulacZ / taulacZ: Bax - / - linje muliggjør evaluering av den fulle effekten av et genav interesse på perifer nociceptor axon utvikling.
Teknikken er begrenset til visualisering av nociceptor aksonal baner som normalt ville uttrykke TrkA under de tidlige utviklingsstadier. I tillegg til de perifere nociseptorer, kan det være mulig å visualisere sympatiske og basal forhjerne cholinergiske fremspring; men dette ville kreve spesiell optimalisering av fargingsteknikker
Vev clearing er et viktig skritt av protokollen beskrevet her. Det muliggjør detaljert vurdering av dypere liggende anslagene i hele Monterte forberedelser og dermed den potensielle identifisering av forskjellige fenotyper. Fluorescerende reportere, som for eksempel TdTomato eller GFP reportere 18,19, kan tilby visuell klarhet under visse betingelser, men det er vanskelig å skaffe hel-mount image fordi vi har funnet ut at i motsetning til X-gal farging, fluorescerende signalene svekkes betydelig i løpet vevet clearing prosedyre. Dilfarging er også mye brukt for axon merking 20; sine mangler er at det ikke kan selektivt merke en spesifikk subtype av aksoner slik som nociceptor fibrene her, og det er vanskelig å fullt ut merke lange baner i periferien.
Oppsummert kan vi tilby en protokoll som bruker en kombinasjon av to genmodifiserte mus linjer for å tillate rutine visualisering av den fulle lysthus av nociceptive axoner i museembryo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke Dr. Louis Reichardt for TrkA taulacZ mus og Dr. Annette Markus for innsiktsfull diskusjon og forslag. Dette arbeidet ble støttet av oppstart midler fra Burke Foundation samt Whitehall Foundation forskningsstipend 2010-08-61, et forskningsstipend fra Wings for Life Foundation (WFL-US-028/14), gi ZB1-1102-1 fra Christopher & Dana Reeve Foundation, og tilskudd 1R01EY022409 og 3R01EY022409-01S1 fra National Eye Institute, til JZ. KJo er en Goldsmith stipendiat.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PFA | Sigma-Aldrich | P6418 | |
| PBS | Life Tech | 10010-023 | |
| Tissue Rinse Solution A | Millipore | BG-6-B | |
| Tissue Rinse Solution B | Millipore | BG-7-B | |
| Tissue Stain Base Solution | Millipore | BG-8-C | |
| X-gal | Sigma-Aldrich | B4252 | |
| Glass scintiallation vial | Kimble Chase | 74500-20 | |
| Incubator | Labline | Model 120 | |
| Insect pins | FST | 26000-30 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| 6-well dish | USA Scientific | CC7672-7506 | |
| Primers | IDT | custom DNA primers | |
| Takara dNTP mixture | Takara | 4030 | |
| Takara LA buffer | Takara | RR002A | |
| Takara LA Taq | Takara | RR002A | |
| PCR machine | Bio-Rad | DNA Engine Dyad | |
| Benzyl alcohol | Sigma-Aldrich | B-1042 | |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | B-6630 | |
| Dissecting microscope | Leica | M205A | |
| Camera | Leica | DFC310FX | |
| Ring light | Leica | MEB110 | |
| Photoshop | Adobe | Photoshop 4.0 |
References
- Verze, L., et al. Cutaneous innervation in hereditary sensory and autonomic neuropathy type IV. Neurology. 55, 126-128 (2000).
- Sethna, N. F., Meier, P. M., Zurakowski, D., Berde, C. B. Cutaneous sensory abnormalities in children and adolescents with complex regional pain syndromes. Pain. 131, 153-161 (2007).
- Uceyler, N., et al. Small fibers in Fabry disease: baseline and follow-up data under enzyme replacement therapy. J Peripher Nerv Syst. 16, 304-314 (2011).
- Reichardt, L. F., Mobley, W. C. Going the distance, or not, with neurotrophin signals. Cell. 118, 141-143 (2004).
- White, F. A., et al. Synchronous onset of NGF and TrkA survival dependence in developing dorsal root ganglia. J Neurosci. 16, 4662-4672 (1996).
- Farinas, I., Wilkinson, G. A., Backus, C., Reichardt, L. F., Patapoutian, A. Characterization of neurotrophin and Trk receptor functions in developing sensory ganglia: direct NT-3 activation of TrkB neurons in vivo. Neuron. 21, 325-334 (1998).
- Markus, A., Zhong, J., Snider, W. D. Raf and akt mediate distinct aspects of sensory axon growth. Neuron. 35, 65-76 (2002).
- Kuruvilla, R., et al. A neurotrophin signaling cascade coordinates sympathetic neuron development through differential control of TrkA trafficking and retrograde signaling. Cell. 118, 243-255 (2004).
- Zhong, J., et al. Raf kinase signaling functions in sensory neuron differentiation and axon growth in vivo. Nature. 10, 598-607 (2007).
- Bulfone, A., et al. An olfactory sensory map develops in the absence of normal projection neurons or GABAergic interneurons. Neuron. 21, 1273-1282 (1998).
- Moqrich, A., et al. Expressing TrkC from the TrkA locus causes a subset of dorsal root ganglia neurons to switch fate. Nature. 7, 812-818 (2004).
- Knudson, C. M., Tung, K. S., Tourtellotte, W. G., Brown, G. A., Korsmeyer, S. J. Bax-deficient mice with lymphoid hyperplasia and male germ cell death. Science. 270 (5233), 96-99 (1995).
- Lentz, S. I., Knudson, C. M., Korsmeyer, S. J., Snider, W. D. Neurotrophins support the development of diverse sensory axon morphologies. J. Neurosci. 19, 1038-1048 (1999).
- Patel, T. D., Jackman, A., Rice, F. L., Kucera, J., Snider, W. D. Development of sensory neurons in the absence of NGF/TrkA signaling in vivo. Neuron. 25, 345-357 (2000).
- Donovan, K. J., et al. B-RAF kinase drives developmental axon growth and promotes axon regeneration in the injured mature CNS. The Journal of experimental medicine. 211, 801-814 (2014).
- Mercer, K., et al. Expression of endogenous oncogenic V600EB-raf induces proliferation and developmental defects in mice and transformation of primary fibroblasts. Cancer research. 65, 11493-11500 (2005).
- Tronche, F., et al. Disruption of the glucocorticoid receptor gene in the nervous system results in reduced anxiety. Nature genetics. 23, 99-103 (1999).
- Madisen, L., et al. A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-induced activation and silencing. Nat Neurosci. 15, 793-802 (2012).
- Feng, G., et al. Imaging Neuronal Subsets in Transgenic Mice Expressing Multiple Spectral Variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Schmidt, H., Rathjen, F. G. DiI-labeling of DRG neurons to study axonal branching in a whole mount preparation of mouse embryonic spinal cord. J Vis Exp. , (2011).
