Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Remote Limb iskemisk prekondisjonering: neuroprotective Technique i Gnagere

Published: June 2, 2015 doi: 10.3791/52213
Automatic Translation
1
1Discipline of Physiology and Bosch Institute, Sydney Medical School, University of Sydney

Summary

Remote iskemisk prekondisjonering (RIP) er en metode for condition vev mot skadelig stress. Vi har etablert en metode for fjern iskemi på bakben, ved å blåse en sphygmomanometer mansjett i 5-10 min. De nevroprotektive egenskapene RIP har blitt vist i en modell av retinal degenerasjon hos gnagere.

Abstract

Sublethal iskemi beskytter vev mot etterfølgende, mer alvorlig iskemi gjennom oppregulering av endogene mekanismer i det berørte vevet. Subletal ischemia har også blitt vist å oppregulere beskyttende mekanismer i fjerntliggende vev. En kort periode med iskemi (5-10 min) i bakbenet av pattedyr induserer selvbeskyttende reaksjoner i hjernen, lungene, hjertet og netthinnen. Effekten er kjent som fjern iskemisk prekondisjonering (RIP). Det er en terapeutisk lovende måte å beskytte vitale organer, og er allerede i kliniske studier for hjerte- og hjerneskader. Denne publikasjonen demonstrerer en kontrollert, minimal invasiv metode for å lage en lem - spesielt bakbenet til en rotte - iskemisk. En blodtrykksmansjett utviklet for bruk i human nyfødte er forbundet med en manuell blodtrykksmåler og brukes til å anvende 160 mmHg trykk rundt den øvre del av bakbenet. En sonde konstruert for å detektere hudtemperatur blir brukt til å verifisere ischemien, ved å registrere nedgang i huden temperatur forårsaket av trykk-indusert okklusjon av bein arteriene, og økningen i temperatur som følger utgivelsen av mansjetten. Denne metoden for RIP gir beskyttelse til rotte hinnen mot sterkt lys-indusert skade og degenerasjon.

Introduction

Overlevelse av de fleste, kanskje alle, kan vev i ansiktet av metabolsk stress forbedres ved forhånds condition med en periode på sublethal iskemi 1,2. Ischemisk prekondisjonering (IP) i praksis er eksponering av vev for å subletal ischemi, før vevet erfaringer mer alvorlig stressfaktorer, som en etterfølgende ischemisk skade. I dyremodeller, IP gir slående beskyttelse til hjernen, retina, hjerte og lunger 3-6. Tilsvarende observasjoner i slagpasienter viste en sammenheng mellom tidligere forbigående iskemiske angrep og bedre kliniske utfall 7,8. IP beskytter også retinal fotoreseptorene fra ikke-iskemiske skader ni.

Effektiviteten av IP i forskjellige vev og skader antyder at den aktiverer en medfødt mekanismen for celleoverlevelse er tilstede i alle vev. Ischemisk prekondisjonering av myokard er blitt foreslått å ha beskyttende virkninger gjennom oppreguleringav hypoksi induserbar faktor (HIF), som er kjent for å regulere mange metabolske baner gjennom frigivelse av adenosin, eller ved åpning av mitokondrielle ATP-kaliumkanaler 10,11. Adenosin utslipp og ATP kaliumkanaler er innblandet i cerebral iskemi, men etterforskning av nevro mekanismene for iskemisk conditioning hittil har vært fokusert på endringer av anti-eksitotoksisitet, anti-apoptotiske og anti-inflammatorisk pathways 12,13. Totalt sett er forståelse av molekylære prosessen med iskemisk condition for å beskytte nerveceller begrenset.

Fjern iskemiske preconditioning forsøk på å pleie fjerne kritisk viktige organer (hjerte, hjerne, lunge) ved å generere iskemi i mindre kritiske vev. Remote iskemisk prekondisjonering (RIP) med bakbenet har vist seg å være nervecellene i gnagermodeller av hjerneslag 14-17. Fremgangsmåten beskrevet av oss er en enkel, pålitelig og ikke-invasiv Protocol for å indusere RIP.

De aller fleste av RIP protokoller involvere bakben, antagelig fordi lårarterie ligger i den øvre bakben kan lett identifiseres og åpnes for kirurgiske klem og tourniquet søknad. I invasiv lem iskemiske studier for studiet av hjernen og hudbeskyttelse er iskemi indusert ved å skille lårarterie fra lysken leddbånd og klem lårarterie 2,15,18.

Den iskemi som følge av enten lem cuffing eller femoralarterie klem har blitt bekreftet av endringer på lem, inkludert et tap av puls, redusert oksygenering og et fall i hudtemperatur. Remote iskemi kan bekreftes ved tap av puls ved hjelp av laser Doppler eller ultralyd Doppler 17-19. Hudtemperatur kan brukes som alternativ til Doppler selv om forholdet er ikke-lineær 20,21. Nøyaktige temperatur innspillinger er vanlig i laboratorier og kanlett tas med i eksterne iskemiske studier.

Et alternativ til lår- klem kirurgi er induksjon av ischemi ved anvendelse av en tilstrammende. Tourniquet søknad produserer sammenlign iskemi det som oppnås med fartøy klem; Kutchner et al. sammenlignet invasiv femoralarterie klem til en ikke-invasiv tourniquet og fant begge metodene stoppet blodtilførselen til lem og redusert skade huden i en plastisk kirurgi modell av hud klaff iskemi 18. Cuffing enten benet eller armen og heve mansjettrykket til over systolisk blodtrykk har blitt funnet å være beskyttende mot ischemisk skade hos gris og menneske 17,19,22.

Annerledes tourniquet tilnærminger til å indusere fjern iskemisk inkluderer bruk av en blodtrykksmansjett eller en strikk 17,22,23. Imidlertid er bruken av et elastisk bånd for å indusere iskemi en usikker metode, som potensielt kan gi opphav til en uregulert mengde av trykket ilem, med trykk stiger over 500 mmHg blir registrert hos mennesker 24. Videre, iskemi i bena ved hjelp av et elastisk bånd fører til muskelskader hos rotter etter fjerning av båndet 23, slik som bestemt ved Evans Blue-fargestoff, en in vivo markør for myofiber permeabilitet 25. I kontrast, kan levering av et kontrollert press på tourniquet oppnås ved hjelp av en blodtrykksmansjett koblet til en sphygmomanometer 17,19,22,26.

I denne studien ble en lys skade modell av fotoreseptoren degenerasjon brukt for å demonstrere den nevrobeskyttende effekten av fjern ischemisk prekondisjonering. Remote iskemi ble fremkalt umiddelbart før lyset skade, og forhindret påfølgende fotoreseptoren degenerasjon som bekreftes av netthinnefunksjon testing. Den medfølgende video vil demonstrere anvendelsen av ikke-invasiv fjern iskemi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Etikk uttalelse: Protokollen følger retningslinjene dyr vare på University of Sydney, AEC # 5657. Anestesi ble godkjent av dyreetiske komité (University of Sydney, AEC # 5657).

1. Utstyr Forberedelser

  1. Bruk sanntid hudtemperatur sporing. Slå på datamaskinen, og datainnsamling maskinvare.
  2. Åpne temperatur innspillingen programvare og justere temperaturinnstillingen til mellom 30-35 ° C og prøvetakingsfrekvens til hver 100 ms.
  3. Valgfritt: Sett rektal termometer for å sikre kjernetemperaturen holder seg stabil på 37,5 ° C.

2. Kalibrering av Manual Sphygmomanometer

  1. Koble neonatal arm mansjetten sphygmomanometer.Use en størrelse 2 mansjett for en 250-550 g rotte. En adapter kan være nødvendig å koble mansjetten slangen til sphygmomanometer.
  2. Tømme mansjetten enten ved å løsne lufteventilen eller kobler mansjetten slangen fra tilpasseeller. Sikre at ingen trykket forblir i røret og manometeret nålen hviler på null inne i den ovale / rektangel.
  3. Sjekk trykket mellom slange, manometer og mansjett. Blåse opp mansjetten med milde pumper av inflasjon pære til det viser 100 mmHg på manometeret. Sørg for at trykket forblir konstant. Tømme mansjetten ved sakte å åpne lufte verdi.

3. Animal Forberedelse

Merk: Dyr som skal gjennomgå lys skade krever mørk tilpasning kvelden før fjern iskemi. Dyr som gjennomgår lys skade krever mørk oppdragelse (12 timers lys: mørke syklus (5 lux))

  1. Utføre fjern iskemi i enten våken eller anesteserte gnagere. Pass på at dyr har en sunn muskel tone. Sikre dette ved å klemme den øvre hind lem for å bekrefte at det er tilstrekkelig muskel stede. RIP-indusert beskyttelse mot lys skaden har blitt testet i stillesittende rotter opp til 6 måneders alder.
  2. Bedøvet forberedelse til RIP
    1. Injisere rottene med en intraperitoneal injeksjon av 60 mg / kg ketamin og 5 mg / kg xylazin. Kontroller anestesidybden ved å utvide ben og knipe huden på undersiden av foten. Dyret har ingen refleks hvis det er dypt bedøvet. Påfør kunstige tårer for å unngå hornhinne tørrhet mens under narkose.
    2. Plasser rotter på enten en varmematte eller sirkulerende vannvarmer rør for å opprettholde en konstant kroppstemperatur på 37,5 ° C. Plasser rotte i liggende stilling med underekstremitetene 'foot pads vendt opp. Enten høyre eller venstre lem kan gjennomgå ekstern iskemi.
  3. Awake forberedelse til RIP
    Merk: Awake dyreforsøk krever to personer. Én person begrenser dyret og den annen person betjener manuell sphygmomanometer. De forskere må være sikre på å utføre prosedyren som tvang øker risikoen for skade på handlers. Rottene som gjennomgår ekstern iskemi må akklimatiseres to manuell tilbakeholdenhet. Avhengig intuitive retningslinjer manuell støtten skal være fremgang fra 30 sek til maksimalt 5 min over flere uker. Engstelige dyr som ikke klarer å akklimatisere seg til manuell tilbakeholdenhet bør utelukkes fra våken eksperimentering. Til slutt, er manuell tilbakeholdenhet sannsynlig å forårsake stress (og potensielt innføre confounds til studiet) til dyr og en humbug kohort (plassering av mansjetten uten betennelse) må brukes til å tolke RIP studere resultatene.
    1. Skjær et håndkle inn i en 15 cm x 30-50 cm stykke og legg kortsiden vinkelrett på rotte ryggrad, som dekker hodet til toppen av baklemmene.
    2. Brette kortsiden under rottekroppen tett og begynner å vikle rotte med de resterende langsiden av håndkle. Fest innpakket dyr under armen i liggende stilling. Hvis rotta blir holdt under venstre arm, frigjøre rotte rett lem fra håndkle.

4. Søknad of Skin temperaturprobe

  1. Forlenge etappe av rotte som er å gjennomgå iskemi og plassere huden sonde på fotbladet. Plasser huden sonden for å maksimere kontakten mellom temperatursonden og huden. Skyv sonden inn i fotbladet og fest sonden med papirtape.
  2. Sjekk huden probe plassering ved å spore temperaturen på temperaturen innspillingen programvare. Sørg for at huden temperaturen er mellom 30-34 ° C og holder seg stabil. Spor huden temperatur i 1-2 min. Juster huden sonde hvis temperaturen er ustabil eller under 30 ° C.

5. Remote Iskemi

  1. Tømme mansjetten og sørge for lufttrykket ventilen er lukket. Forlenge beinet og løst omringe mansjetten på over bakben. Bruk pekefingeren og tommelen til å forlenge beinet og lavere tall for å holde løsnet mansjetten på plass.
  2. Hev bedøvet dyret mansjettrykket til 160 mmHg, og i våken dyr increase mansjetten trykket til 180 mmHg.
    Merk: bedøvet trykk på rotter blod varierer 120-140 mmHg og stiger til 160 mmHg når bevisst. Starter tidtakeren og fot temperatur opptak når riktig trykk er nådd.
    Merk: Foten Temperaturen bør slippe med 2 ° C etter 5 min med konstant trykk.
  3. Opprettholde posisjonen av mansjetten over dyrets "kne" gjennom iskemi. Mansjettrykket vil begynne å falle etter noen få minutter, eller dersom rotte lem er i bevegelse.
  4. Gjentatte ganger pumpe inflasjon pære i små pakker å opprettholde ønsket mansjettrykket repetitive kort utbrudd av pumping
  5. Fjern iskemi kan leveres kontinuerlig til mellom 5 og 15 min. Den iskemi reperfusjon Protokollen omfatter to perioder på 5 min ischemia med en mellomliggende 5 min reperfusjon.
  6. Tømme mansjetten trykket ved å løsne lufttrykket ventilen. Sjekk temperaturendringen i løpet av iskemi proprotokollen. Slipp mansjetten.
  7. Fortsett med skade eksperimentering. Dyr under påvirkning av anestesi trenger å bli plassert på en varmepute. Fortsett å overvåke dyr før ambulerende. Dyr kan ikke returneres til huset til å gå.

6. Lys Injury - Retinal degenerasjon Model

  1. Mørk tilpasse dyrene over natten (12-15 hr). Umiddelbart etter fjern iskemi condition eller sham fjern iskemi (animalsk restraint) sted dyr i pleksiglass boliger med mat og vann.
  2. Slå på lysstoffrør (1000 lux) plassert over pleksiglass bolig på 9 am i 24 timer. Etter lyseksponering, returnere dyrene å dimme syklisk belysning i 7 dager.

7. Post-fjern iskemi Prosedyrer

  1. Vision vurdering med elektroretinogrammet (ERG):
    Merk: ERG oppsett og flash-protokollen følges Brandli og Stone 26.
    1. Mørk tilpasse dyr over natten (12-15 timer). Undersvakt rødt lys bedøve dyrene ved intraperitoneal injeksjon av ketamin og xylazin (60 mg / kg og 5 mg / kg, henholdsvis). Mydriatic (atropinsulfat 1,0%), hornhinne bedøvelse (proxymetacaine 0,5%).
    2. Påfør hornhinne hydrering (Carbomer polymer) øyedråper umiddelbart til hornhinnen. Påfør eye gel 20 min intervaller for å opprettholde hornhinnen hydrering.
    3. Tegn et løst knyttet tråden rundt øyeeplet for å hjelpe stabile ERG opptak. Overvåke temperaturen med en rektal probe og vedlikeholde dyrets kroppstemperatur på 37 til 37,5 ° C.
    4. Plasser hodet inne i en ganzfeld integrere sfære.
      Merk: ganzfeld er en fullt programmerbar lys stimulus som leverer enhetlige whit blink fra LED til øyet.
    5. Spill elektroretinogrammet ved hjelp av en spesiallaget 4 mm platina positiv elektrode lett berøring av hornhinnen og en 2 mm diameter Ag / AgCl pellet elektroden settes inn i munnen. Referanse begge elektrodene til en nål av rustfritt stålsettes subkutant i rumpen.
    6. Rekord signaler med band-pass innstilling av 0.3-1,000 Hz (-3 dB), med en 2 kHz erverv hastighet (AD Instruments). Etter en stabil ERG opptak er etablert lagt dyret til en 10 min mørk tilpasning før du begynner opptakene.
    7. Følg flash-protokollen som tidligere beskrevet av Brandli og Stone 26.
      1. Programmere varigheten av blitsen (vi brukte blinker 1-2 ms i varighet), og satt sin intensitet til -4,4 til 2,0 log Scot cd.sm -2. Bruk lyse blinker (2,0 log Scot cd.sm -2, 1 ms) for å måle retinal funksjon. I denne studien er det sammenligningen mellom kontroll, lys skader og lys skade med RIP.

8. TUNEL analysen

  1. Avlive dyrene ved intraperitoneal injeksjon av overdose fenobarbital (100 mg / kg). Enucleate øynene og fikse i 4% paraformaldehyde.
  2. Vask øynene i PBS før cyroprotectingØynene over natten i 30% sukrose (vekt / volum). Embed øynene i oktober sammensatte og skjær i 20 mikrometer sagittal delene med en kryostat.
  3. Utfør TUNEL analysen på netthinnens seksjoner med DAPI farging følge protokollen fra Maslim et al. 27
  4. Bruk fluorescens mikroskopi for tunel tellinger av netthinnen. TUNEL-celler ble registrert fra det ytre kjernelaget (onl); det ytterste lag av netthinnen som inneholder fotoreseptoren kjerner. I denne studien ble TUNEL tellinger laget i tre eksemplarer for hvert øye, med fem øyne for hver behandlingsgruppe.
  5. Bruk enveis ANOVA å statistisk sammenligne gruppen betyr av kontroll, lys skade, og lette skader + RIP rotter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En blodtrykksmansjett hevet til over 160 mmHg stopper blodtilførselen til bakben som ses tydelig i figur 1B. Mangelen på vevsoksygenering resulterte i en reduksjon av dyrets fot temperatur i en iskemi-reperfusjon protokoll (figur 2). Foten temperatur (33 ° C) var lavere enn kjernetemperaturen og effektivt redusert i løpet av mansjettrykket høyde (31 ° C) stiger når mansjetten er tom for luft (32 ° C). En enkelt 1000 lux lys skade ble levert til dim hevet albinorotter med eller uten ekstern iskemisk prekondisjonering. Netthinnefunksjon ble registrert og vurdert ved hjelp av elektroretinogrammet (ERG).

ERG er summering av elektriske responser som stammer fra de indre og ytre neuroner i netthinnen for lys stimulering, som vist i figur 3. ERG bølgeform har en tidlig negativ topp som følge av fototransduksjons (minst ca. 10 msek etter light flash) kalt en bølge og en stor positiv peak fra indre netthinne (maks ca 80 msek etter lys flash) kalt b-bølgen. Den mørke-tilpasset ERG fra en normal dim hevet rotte viste en stor fotoreseptoren og indre retinal respons på en lys 2,0 log cd.sm -2 flash (figur 3A). En uke etter lyset skade ERG opptakene hadde en alvorlig reduksjon i amplitude i forhold til kontroller, noe som reflekterer tapet av fotoreseptorer; se Figur 3B. Prekondisjonering hind lem med iskemi ved hjelp av en reperfusjon protokoll av 2 x 5 min rett før iskemi beskyttet fotoreseptorene fra lys skade. De RIP ERG amplituder var større enn lyset skade alene, med en liten nedgang til en bølge se (Figur 3C). Terminal deoksynukleotidyltransferase dUTP nick slutten merking (TUNEL) assay på cryopreserved deler av netthinnen bekreftet en reduksjon av apoptotiske celler i lyse skadede dyr mottar RIP relAtive å hykle-behandlede lette skader dyr (figur 4).

Induksjon av ischemi til bakbenet er avhengig av riktig plassering av mansjetten, som vist i figur 1. En mansjett plasseres under "kneet" ikke beskytte mot lys fotoreseptorer skade som reflekteres i den reduserte ERG amplituder, se figur 3D.

I konklusjonen, når det gis riktig bakben iskemi var i stand til å beskytte netthinnens nerveceller mot lys skade.

Figur 1
Figur 1:. Cuff plassering og effekt av mansjetten trykk over 160 mmHg (A) Viser bakben og foten før mansjettrykket høyde. (B) Viser foten under heving av mansjetten trykk over 160 mmHg. Legg merke til plasseringen av mansjetten over "k nee ". Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2:. Foot temperaturen er redusert i løpet mansjettoppblåsing Inflasjon på mansjetten på bakbenet for 2 x 5 min ved 160 mmHg redusert hudtemperatur under iskemi. (A) viser konsernets gjennomsnittet for 2 x 5 min RIP fot temperaturendringer. (B) Viser en representant fot temperatur (° C) tracing for 2 x 5 min iskemi. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

00 "/>
Figur 3:. RIP bevarer retinal funksjon som demonstrert i ERG sammenlignet med lette skader rotter Eksponering for sterkt lys for 24 timers skader fotoreseptorene i netthinnen. ERG måler helse av indre og ytre retina som en elektrisk respons (mikrovolt [uV]) for å lette stimulering. Den normale reaksjon på retinal 2,0 log cd.sm -2 lys stimulering vist i (A). Fotoreseptor skade fra sterkt lys resulterer i en mindre ERG amplitude (B). RIP var i stand til å redde fotoreseptorene følgende lys skade (C). Feilaktig mansjett plassering under RIP beskytter ikke fotoreseptorene fra skade (D). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

4highres.jpg "width =" 600 "/>
Figur 4: tunel + celletall. Et søylediagram sammenligne konsernresultatet for lett skade, skade + RIP demonstrere redusert apoptose med RIP. TUNEL + celle ble talt over hele span av netthinnen (8000 mm). Topplate: group gjennomsnitt på tunel + celler var lavere for RIP behandlet rotter (210 ± 4,9, n = 5) sammenlignet med lys skade alene (255 ± 10, n = 5), p <0,01, enveis ANOVA. Uskadde netthinne (lyser skade) hadde svært lav (3,0 ± 1,4, n = 5) apoptotiske celler. (A) Representant bilde av overlegen lys skadet netthinnen. (B) Representant bilde av overlegen RIP-lys skadet netthinnen. (C) Representative bilde av dårlig lys skadet retina. (D) Representant bilde av dårligere RIP-lys skadet netthinnen. Klikk her for å se en større versjon av dennefigur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Gnager bakben iskemi ble vellykket indusert med en manuell sphygmomanometer og mansjett levere neuroprotection til fotoreseptorene i netthinnen. Et funn forenlig med iskemisk conditioning indusert beskyttelse av fotoreseptorene mot lys skade 9,28.

I hovedsak fjern iskemi fører kort oksygenmangel til vev. Derfor har fjern ischemisk prekondisjonering mange likhetstrekk med iskemisk kondisjonering eller alternativt betegnet ischemisk toleranse, hypoksiske prekondisjonering, og til en viss grad, anaerob trening. Celler svare på ischemisk utfordring ved å slippe et stort utvalg av proteiner, nukleosid og transkripsjonsfaktorer som enten tilby neurobeskyttelse direkte eller påvirker cellene til å bli tolerante overfor påfølgende metabolsk stress 13.

I litteraturen har fjern iskemi protokoller omfattet en rekke varigheter og frekvenser. Vår lab har testet 5, 10,og 2 x 5 min iskemi protokoller på normal retina-funksjonen 26. Av disse protokollene 2 x 5 min produsert størst ERG amplitudeendring i normale rotter og ble valgt for å teste på en modell av lys skade. Korte og gjentatte 5 min iskemiske hendelser har også vist seg å være forebyggende i periodiske slag hos mennesker, og å redusere infarktstørrelsen i eksperimentell hjerneslag hos griser 17,22. Imidlertid er den mest hensiktsmessige varigheten av ischemisk prekondisjonering sannsynligvis vil være avhengig av dyremodellen som brukes. For eksempel har en reduksjon i infarktstørrelse mot samlings iskemi blitt observert i lengre 2 x 15 min og 3 x 15 min protokoller, men ikke i 3 x 5 min protokoller hos rotter 15.

Tiden mellom IP og iskemisk skade må også vurderes for effektiv neuroprotection. To tidsvinduer er klassifisert for kardio indusert av IP. Dette er den "klassiske condition" vinduet, som oppstår 0-12 timer etter IP og"andre vinduet", som oppstår 3-4 dager etter IP-29. I et fokus hjerneslag modell, ble RIP funnet å være beskyttende på flere tidspunkter, også de utenfor den klassiske og andre windows 15. Men det har vært få studier som har sammenlignet de tidsperioder neuroprotection i RIP og IP.

En videre vurdering for fjern iskemi beskyttelse er timingen av condition, herunder om det er brukt før skade (preconditioning) eller etter skade (postconditioning). De fleste fjern ischemi testing har benyttet til tross for prekondisjonering postconditioning studier har nylig blitt funnet å være beskyttende for både retinal og cerebrale nerveceller 30,31.

Oppsummert er induksjon av nevrobeskyttelse i baklabb ischemisk kondisjonering som er spesifikk for den sykdomsmodell, dyrearter, varigheten av ischemi og timingen av iskemi. En gjennomgang av Kaniora et al. provides ytterligere detaljer om de ulike eksterne iskemi protokoller, herunder arter, RIP protokoller, RIP nettsider, skademodeller, skade resultater og foreslåtte beskyttelsesmekanismer 32.

Den minimalt invasive mansjetten på bakbenet tillater RIP i både våken og dyr forutsatt at kroppstemperaturen opprettholdes. I bedøvede eksperimentering, må opprettholdes dyrets kroppstemperatur for å hindre nedkjøling. Intern temperaturovervåkning vil hindre dyret under hypotermi og hypertermi. Hypotermi og hypertermi er velkjente pre-condition stimuli i begge taktsmodeller og lys skade 33-36. Den Jove fremgangsmåte presenteres kan utføres i våken dyr og dermed hindre kroppstemperatur confounds.

Bedøvelsesmidler kan innføre et annet sett med confounds i RIP eksperimentering. Isofluran kan delta i hjertemuskelen beskyttelse via åpning av ATP-sensitive kalium channels, en lignende beskyttende mekanisme rapportert i ischemisk kondisjone 37. Selv om størrelsen på infarktet i takts modellene er fortsatt stor i humbug-behandlede dyr gitt isofluran, kan den molekylære mekanismen som ligger bak fjern iskemisk conditioning bli maskert av effekten av bedøvelse. Ketamin, en NMDA antagonist, har en rekke beskyttende effekter in vivo 38, inkludert potensial til å hindre excitotoxicity til nevroner, aktivere mTOR sti og slipp BDNF i serum 39-41. Ketamin er blitt rapportert å øke neuronal overlevelse etter hjerneskade hos mennesker og redusere lys skade i gnagerfotoreseptorer 42,43. Undersøkelser i mekanismen av fjern iskemisk condition med våken blodtrykk cuffing vil unngå anestesi forundrer.

Effektiv bakben iskemi er avhengig av riktig plassering av mansjetten, konsistens på mansjetten trykk og mansjett press høyde over systolic blodtrykk som vist i figur 1. En mansjett plassert under "kneet" ikke beskytter fotoreseptorene mot lys skade som reflekteres i redusert elektroretinogrammet (ERG) amplituder. Forskjellen i kondisjone basert på posisjonen av mansjetten er sannsynligvis på grunn av forskjeller i muskelmasse og nærhet til lårarterien. I tillegg bør dyrene være standardisert for alder, vekt, kjønn og kroppstemperatur.

Oppsummert kan fjern ischemi være forårsaket av en ikke-invasiv blodtrykksmansjett, som unngår muskelskader og har fleksibilitet for våken eller bedøvd eksperimentering. Remote iskemisk prekondisjonering er en ny nevrostrategi og denne protokollen vil gjøre videre studier i sine mekanismer og applikasjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gold series DuraShock hand aneroid sphygmomanometer Welch Allyn DS56 Manual Sphygmomanometer
Neonate [size 2] 1 tube, 10 pack Welch Allyn 5082-102-1 Limb blood pressure cuff
Luer lock adaptor Welch Allyn 5082-178 Adaptor for neonatal cuff
Thermistor pod AD Instruments ML 309 skin tempertature unit
Skin temperture probe AD Instruments MLT 422/A
Powerlab, 4 channel acquistion hardware AD Instruments PL 35044
Homeothermic blanket system with flexible probe Harvard Appartus 507222F
Towel optional: awake remote ischemia
Isoflo - 100% Isoflurane (250 ml) Abbot Animal Health 05260-05 optional: inhaltion anaesthetic remote ischemia
Ketamil - ketamine 100 mg/ml (50 ml) Troy Laboratories Pty Ltd optional: injectable anaesthetic remote ischemia
Xylium - Xylazine 100 mg/ml (50 ml) Troy Laboratories Pty Ltd optional: injectable anaesthetic remote ischemia

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Meller, R., Simon, R. P. Tolerance to Ischemia-an Increasingly Complex Biology. Translational Stroke Research. 4 (1), 40-50 (2013).
  2. Sun, J., et al. Protective effect of delayed remote limb ischemic postconditioning: role of mitochondrial K-ATP channels in a rat model of focal cerebral ischemic reperfusion injury. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 32 (5), 851-859 (2012).
  3. Harkin, D. W., D'Sa, A., McCallion, K., Hoper, M., Campbell, F. C. Ischemic preconditioning before lower limb ischemia-reperfusion protects against acute lung injury. Journal of Vascular Surgery. 35 (6), 1264-1273 (2002).
  4. Murry, C. E., Jennings, R. B., Reimer, K. A. Preconditioning with ischemia -A delay of lethal cell injury in ischemic myocardium. Circulation. 74 (5), 1124-1136 (1986).
  5. Barone, F. C., et al. Ischemic preconditioning and brain tolerance - Temporal histological and functional outcomes, protein synthesis requirement, and interleukin-1 receptor antagonist and early gene expression. Stroke. 29 (9), 1937-1950 (1998).
  6. Roth, S., et al. Preconditioning provides complete protection against retinal ischemic injury in rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 39 (5), 777-785 (1998).
  7. Wegener, S., et al. Transient ischemic attacks before ischemic stroke: Preconditioning the human brain? A multicenter magnetic resonance imaging study. Stroke. 35 (3), 616-621 (2004).
  8. Weih, M., et al. Attenuated stroke severity after prodromal TIA - A role for ischemic tolerance in the brain. Stroke. 30 (9), 1851-1854 (1999).
  9. Casson, R. J., Wood, J. P. M., Melena, J., Chidlow, G., Osborne, N. N. The effect of ischemic preconditioning on light-induced photoreceptor injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (3), 1348-1354 (2003).
  10. Ettaiche, M., et al. ATP-sensitive potassium channels (K-ATP) in retina: a key role for delayed ischemic tolerance. Brain Research. 890 (1), 118-129 (2001).
  11. Gross, E. R., Gross, G. J. Ligand triggers of classical preconditioning and postconditioning. Cardiovascular Research. 70 (2), 212-221 (2006).
  12. Heurteaux, C., Lauritzen, I., Widmann, C., Lazdunski, M. Essential role of adenosine, adenosine-A1-receptors, and ATP-senstive K+ channels in cerebral ischemic preconditioning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (10), 4666-4670 (1995).
  13. Dirnagl, U., Simon, R. P., Hallenbeck, J. M. Ischemic tolerance and endogenous neuroprotection. Trends in Neurosciences. 26 (5), 248-254 (2003).
  14. Ren, C., et al. Remote ischemic post-conditioning reduced brain damage in experimental ischemia/reperfusion injury. Neurol Res. 33 (5), 514-519 (2011).
  15. Ren, C., Gao, X., Steinberg, G. K., Zhao, H. Limb remote-preconditioning protects against focal ischemia in rats and contradicts the dogma of therapeutic time windows for preconditioning. Neuroscience. 151 (4), 1099-1103 (2008).
  16. Hu, S., et al. Noninvasive limb remote ischemic preconditioning contributes neuroprotective effects via activation of adenosine A1 receptor and redox status after transient focal cerebral ischemia in rats. Brain Research. 1459, 81-90 (2012).
  17. Jensen, H. A., et al. Remote Ischemic Preconditioning Protects the Brain Against Injury After Hypothermic Circulatory Arrest. Circulation. 123 (7), 714-721 (2011).
  18. Kuntscher, M. V., et al. Ischemic preconditioning by brief extremity ischemia before flap ischemia in a rat model. Plastic and Reconstructive Surgery. 109 (7), 2398-2404 (2002).
  19. Kharbanda, R. K., et al. Transient limb ischemia induces remote ischemic preconditioning in vivo. Circulation. 106 (23), 2881-2883 (2002).
  20. Perl, W., Cucinell, S. A. LOCAL BLOOD FLOW IN HUMAN LEG MUSCLE MEASURED BY A TRANSIENT RESPONSE THERMOELECTRIC METHOD. Biophysical Journal. 5 (2), 211-230 (1965).
  21. Vuksanovic, V., Sheppard, L. W., Stefanovska, A. Nonlinear relationship between level of blood flow and skin temperature for different dynamics of temperature change. Biophysical Journal. 94 (10), L78-L80 (2008).
  22. Meng, R., et al. Upper limb ischemic preconditioning prevents recurrent stroke in intracranial arterial stenosis. Neurology. 79 (18), 1853-1861 (2012).
  23. Souza, M. V. P., et al. Hind limb ischemic preconditioning induces an anti-inflammatory response by remote organs in rats. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 42 (10), 921-929 (2009).
  24. Hixson, F. P., Shafiroff, B. B., Werner, F. W., Palmer, A. K. DIGITAL TOURNIQUETS - A PRESSURE STUDY WITH CLINICAL RELEVANCE. Journal of Hand Surgery-American. 11A (6), 865-868 (1986).
  25. Hamer, P. W., McGeachie, J. M., Davies, M. J., Grounds, M. D. Evans Blue Dye as an in vivo marker of myofibre damage: optimising parameters for detecting initial myofibre membrane permeability. Journal of Anatomy. 200 (1), 69-79 (2002).
  26. Brandli, A., Stone, J. Remote ischemia influences the responsiveness of the retina: observations in the rat. Invest Ophthal Vis Sci. 55 (4), (2014).
  27. Maslim, J., Valter, K., Egensperger, R., Hollander, H., Stone, J. Tissue oxygen during a critical developmental period controls the death and survival of photoreceptors. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 38 (9), 1667-1677 (1997).
  28. Grimm, C., et al. HIF-1-induced erythropoietin in the hypoxic retina protects against light-induced retinal degeneration. Nature Medicine. 8 (7), 718-724 (2002).
  29. Vander Heide, R. Clinically Useful Cardioprotection: Ischemic Preconditioning Then and Now. Journal of Cardiovascular Pharmacology and Therapeutics. 16 (3-4), 251-254 (2011).
  30. Zhou, Y. L., et al. Remote Limb Ischemic Postconditioning Protects Against Neonatal Hypoxic-Ischemic Brain Injury in Rat Pups by the Opioid Receptor/Akt Pathway. Stroke. 42 (2), 439-444 (2011).
  31. Hasegawa, J., Obara, T., Tanaka, K., Tachibana, M. High-density presynaptic transporters are required for glutamate removal from the first visual synapse. Neuron. 50 (1), 63-74 (2006).
  32. Kanoria, S., Jalan, R., Seifalian, A. M., Williams, R., Davidson, B. R. Protocols and mechanisms for remote ischemic preconditioning: A novel method for reducing ischemia reperfusion injury. Transplantation. 84 (4), 445-458 (2007).
  33. Maier, C. M., et al. Optimal depth and duration of mild hypothermia in a focal model of transient cerebral ischemia - Effects on neurologic outcome, infarct size, apoptosis, and inflammation. Stroke. 29 (10), 2171-2180 (1998).
  34. Reith, J., et al. Body temperature in acute stroke: Relation to stroke severity, infarct size, mortality, and outcome. Lancet. 347 (8999), 422-425 (1996).
  35. Barbe, M. F., Tytell, M., Gower, D. J., Welch, W. J. HYPERTHERMIA PROTECTS AGAINST LIGHT DAMAGE IN THE RAT RETINA. Science. 241 (4874), 1817-1820 (1988).
  36. Wang, X. D., et al. Neuronal degradation in mouse retina after a transient ischemia and protective effect of hypothermia. Neurological Research. 24 (7), 730-735 (2002).
  37. Tonkovic-Capin, M., et al. Delayed cardioprotection by isoflurane: role of K(ATP) channels. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 283 (1), H61-H68 (2002).
  38. Pfenninger, E., Himmelseher, S. Neuroprotective effects of ketamine on a cellular level. Anaesthesist. 46, S47-S54 (1997).
  39. Hirose, K., Chan, P. H. BLOCKADE OF GLUTAMATE EXCITOTOXICITY AND ITS CLINICAL-APPLICATIONS. Neurochemical Research. 18 (4), 479-483 (1993).
  40. Welberg, L. Psychiatric disorders: Ketamine modifies mood through mTOR. Nature reviews. Neuroscience. 11 (10), 666 (2010).
  41. Garcia, L. S. B., et al. Acute administration of ketamine induces antidepressant-like effects in the forced swimming test and increases BDNF levels in the rat hippocampus. Progress in Neuro-Psychopharmacology & Biological Psychiatry. 32 (1), 140-144 (2008).
  42. Wassle, H. Parallel processing in the mammalian retina. Nature Reviews Neuroscience. 5 (10), 747-757 (2004).
  43. Hertle, D. N., et al. Effect of analgesics and sedatives on the occurrence of spreading depolarizations accompanying acute brain injury. Brain. 135, 2390-2398 (2012).

Tags

Medisin fjern iskemisk prekondisjonering iskemisk conditioning iskemisk toleranse lys skade nevro mediert nevro hjerneslag retina elektroretinogrammet rotte
Remote Limb iskemisk prekondisjonering: neuroprotective Technique i Gnagere
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Brandli, A. Remote Limb Ischemic… More

Brandli, A. Remote Limb Ischemic Preconditioning: A Neuroprotective Technique in Rodents. J. Vis. Exp. (100), e52213, doi:10.3791/52213 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter