Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

En Metode til knudrede Ganglier Injection i Sprague-Dawley Rat

Published: November 25, 2014 doi: 10.3791/52233
Automatic Translation
1,3, 1,2, 1,3
1Center for Narcolepsy, Sleep and Health Research, University of Illinois at Chicago, 2Department of Pharmacology, University of Illinois at Chicago, 3Department of Biobehavioral Health Science, University of Illinois at Chicago

Protocol

Alle procedurer og protokoller blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg fra University of Illinois i Chicago. Eksperimenter beskrevet her er akut non-overlevelse eksperimenter, og der var ingen brug af øjensalve. Opretholdelse af sterile betingelser kun forekommer, når kirurgiske instrumenter vaskes med 70% ethanol i DIH 2 O. Sacrifice rotter i slutningen af ​​forsøget skete via overdosis af IV ketamin / xylazin.

1. Fremstilling af instrumenter og kemikalier

  1. Forbered stamopløsning af 0,05 M af 5-HT HCI i PBS. Derefter fortyndes lager med PBS til en endelig 5-HT koncentration på 0,203 mM.
  2. Fortynd dronabinol i sesamolie ved en koncentration på 20 pg / pl.
  3. 20 cm længde af polyethylen Cut (PE) -50 rør (ID 0,58 mm, OD 0,965 mm). I den ene ende af røret, skæres en affasning spids med en saks, og ved den anden firkantede ende, indsætte en 23 g nål. Tilslut 23 g nål til en 1 mlsprøjte, og fyld den op med 0,3 ml 50 U / ml heparin.
  4. Klip fire stykker 4-0 flettet silke tråd og sæt til side.
  5. Steriliseres kirurgiske sakse, 2 buede Graefe pincet og 3 mikro klemmer med 70% ethanol i DIH 2 O.

2. Kateterisering af lårvenen

Protokol for kateterisation er modificeret fra Jespersen et al. 21

  1. Bedøver en Sprague-Dawley rotte med intraperitoneal (IP) ketamin / xylazin (100 mg / kg: 10 mg / kg). Klem tå af rotte og observere enhver bevægelse for at bekræfte et passende niveau for anæstesi. Barber det ventrale aspekt af venstre lår, og den ventrale aspekt af halsen. Hvis det er nødvendigt af den lokale Institutional Animal Care og brug Udvalg, gælder øjensalve til at forebygge tørhed.
  2. Sikker rotte i liggende stilling på en kirurgisk bord. Brug kirurgiske saks til at klippe væk huden i venstre baglår.
  3. Ved hjælp af en pincet, adfærd stump dissection af den overfladiske muskel for at blotlægge den femorale vene. Brug pincet til at adskille vene fra den femorale arterie, og placere 2 tråde omkring den femorale vene.
  4. Brug buede Graefe pincet til at trække op venen for at stoppe blodgennemstrømning. Ved hjælp af en 22 G kanyle, punktere femorale vene og derefter indsætte den affasede ende af PE-50 rør ind i venen.
  5. Kontroller om PE-50 rør blev indsat korrekt ved at trække sprøjtens stempel. Blod skal ses ind i PE-50 rør. Bind 2 knob omkring venen og PE-50 rør ved hjælp af de 2 tråde.

3. 5-HT-induceret Apnea via IV Infusion

  1. Placer en piezoelektrisk strain gauge omkring rotte til måling åndedræt.
  2. Skift indstillinger for forstærkning af den elektroniske forstærker via forstærker software på computeren: at forstærke (100x) og båndpasfilter (1-10 Hz) de respiratoriske signaler opnået fra strain gauge, indstille "highpas filter" på & #8220; AC @ 1 HZ "og" lavpasfilter "ved" 10 Hz "og indstille forstærkningen ved at indtaste" 10 "til" Initial Gain "og" 100 "for" Total Gain "..
  3. Skift indstillinger for samplingfrekvens ved at åbne "Analog Input" via optagelse software på computeren. At digitalisere (500 Hz samplingfrekvens) ved hjælp af en analog-til-digital-konverter, "prøve" på "1000 Hz" og "springe" hver anden optagelse punkt ved "1" (effektiv samplingfrekvens 500 Hz), og derefter optage signalet hjælp optagelse software.
  4. Fjern 1 ml sprøjte fra kateteret og indsætte et 500 pi præcision glas sprøjte fyldt med 0,203 mM af 5-HT i kateteret.
  5. Placer præcision glassprøjte 500 pi i en infusionspumpe. Indsprøjt 12,5 ug / kg per 350 pi / kg af 5-HT-opløsning ved en hastighed på 63 ml / time. Udfør flere infusioner og observere apnø hos rotter, hvilket ses ensa pause i vejrtrækning (≥ 2,5 sek) på et optaget respiratoriske signaler på computerskærmen.
  6. Før du fortsætter med hals kirurgi, overvåge vejrtrækning mønster og tjekke for smerter refleks fra tå knivspids i rotten. Hvis vejrtrækningen er uregelmæssig eller hvis der er en smerte refleks fra tå knibe, administrere IP ketamin / xylazin (100 mg / kg: 5 mg / kg) og derefter igen bekræfte et passende niveau for anæstesi.

4. halskirurgi til Expose knudrede Ganglier

  1. Sikker rotte i liggende stilling på en kirurgisk bord. Lav en midterlinjen langsgående snit ved hjælp af kirurgiske sakse i nakken.
  2. Ved stump dissektion på platysma muskel (ved hjælp af 2 mikro klemmer til at holde denne muskel klar af det kirurgiske sted) udsætter sternohyoideus og omohyoideus muskler. Adskil disse muskler at udsætte det indre carotidarterie og en af ​​dens grene, pterygopalatinarterien.
  3. Overhold vagus nerve, da den løber langs den interne halspulsåren og derefter langs th e pterygopalatinarterien. Overhold hvordan vagus nerve og pterygopalatinarterien sammen med glossopharyngeal nerve (kranienerve IX) og spinal tilbehør nerve (kranienerver XI), indtast bageste sønderrevne foramen i bunden af ​​kraniet.
  4. Bemærk, at knudrede ganglion vises som en hævelse af vagus nerve lige før den træder de bageste flænget foramen. Bemærk også, at svælg og larynx nerve grene kommer ud for forreste og bageste aspekter af henholdsvis den knudrede ganglion. 5
  5. Brug af Graefe pincet, adskille vagus nerve fra arterierne, og læg et stykke tråd omkring vagus nerve. Placer en klemme på tråden til at anvende mindre spænding på vagus nerve, og rengør knudrede ganglion enhver bindevæv til at give mindre modstand, når injektionen.
  6. Gentag 5-HT-induceret apnø som anført i afsnit 3 for at bekræfte, at ingen skade blev gjort til den knudrede ganglier.
TITEL "> 5. Intranodose Ganglier Injektion af dronabinol

  1. Fyld en 10 pi gastæt præcision sprøjte glas fastgjort med et skræddersyet 28 g halv-tomme sprøjte nål med en 35 ° skrå spids med 5 pi dronabinol i sesamolie.
  2. Placer en mikro klemme på tråden til at anvende mindre spænding på vagus nerve, og punktere knudrede ganglion pas på ikke at punktere gennem det. Tryk sprøjten langsomt (≥ 60 sek) at injicere hele indholdet af sprøjten. Bemærk, at nogle af sprøjtens indhold vil lække ud af ganglion.
  3. Gentag 5-HT-induceret apnø som anført i afsnit 3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1 repræsenterer prøve vejrtrækning optagelse hos rotter, der havde infusion af 5-HT til at inducere apnø før og efter intranodose ganglie injektioner af dronabinol. 5-HT aktiverer 5-HT 3-receptorer på knudrede ganglier, der bidrager til Bezold-Jarisch refleksen af bradykardi, hypotension og apnø. 11,17-19 Intranodose ganglie injektioner af dronabinol aktivere inhiberende CB-receptorer eller allosterisk modulerer 5-HT 3 receptorer, der inhiberer 5-HT-induceret excitation af vagus nerve. 16,17,20,22 før (figur 1, øverste panel) og efter (figur 1, midterste panel) HALSKIRURGI infusion af 5-HT (figur 1 , tiltalt af rød linje) fremkalder en apnø-respons ses som en mangel på maven bevægelse målt med piezoelektriske strain gauge. Efter intranodose ganglie injektioner af dronabinol (figur 1, nederste panel), gjorde IV 5-HT infusion ikke fremkaldeen apnø-respons. Efter sesamolie injektioner (data ikke vist) i knudrede ganglier køretøj kontrolrotter, IV 5-HT infusion fremkaldte et apnø-reaktion sammenlignelig med basislinjer. 17

Figur 1
Figur 1:. Sample optagelser fra akut 5-HT-indudced apnø eksperimenter før og efter 100 ug dronabinol i 5 pi sesam olie injektioner i knudrede ganglier af vagus nerver 17 Respiratory optagelser blev taget før operation (øverste panel), efter kirurgi ( midterste panel) og efter knudrede ganglier injektioner (nederste panel). Røde linje betyder IV 5-HT infusion for at inducere apnø. Efter sesam olie injektioner (data ikke vist) i knudrede ganglier køretøj kontrol rotter, IV 5-HT infusion fremkaldte en apnø-reaktion sammenlignes med basislinjerne. 17 Dette tal er blevet ændret fra Calik et al. 17AU = arbitrære enheder; RESP = luftvejene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De kritiske trin for en vellykket injektion af neurochemicals til knudrede ganglier er: 1) at identificere og rengøring af bindevæv fra den knudrede ganglier; 2) bekræfter integriteten af ​​knudrede ganglier før injektion; 3) og ved hjælp af en lille gauge nål til forsigtigt tilføre, men ikke helt punktering igennem, den knudrede ganglier.

Vagus nerve innerverer mange organer i hals og mave, og det formidler vigtige oplysninger, såsom puls, blodtryk, bronkopulmonal irritation, og mave udspiling til CNS. Den knudrede ganglier i vagusnerven indeholde en bred vifte af receptorer for aminosyrer, monoaminer, neuropeptider og andre neurokemiske stoffer. 1 Intranodose ganglie injektioner af neurochemicals for disse receptorer for at modificere aktiviteten af vagus nerve er blevet gjort før, 16,17 og udgør en fremragende eksperimentel model til at belyse perifere pharmacological virkninger på vagus nerve, der kan ændre sygdomme, såsom søvnapnø, gastroesophageal reflux sygdom eller kronisk hoste. 2-4

At eksponere knudrede ganglier er hals kirurgi udføres og musklerne i nakken adskilles for at blotlægge indre halspulsåre. Vagusnerverne ses løber langs den indre halspulsåre og pterygopalatine arterier. Cellen organer for de unipolære vagus nerver er placeret i knudrede og petrosal ganglier, der ses som en hævelse af vagus nerver før ind i kraniet på de bageste flænget foramens. 5

Manipulationer af knudrede ganglier er vigtige omfang at knudrede ganglier og vagusnerverne ikke beskadiges under kirurgi. Ukorrekt og rå kirurgisk teknik kan beskadige knudrede ganglier og dens nerve grene, sammen med arterier og andre kraniale nerver. I denne protokol, for at stabilisere den vagus nerve, giver vi en svag spænding til vagus nerve via silketråd fæstnet til en mikro klip. Dette gør det muligt for os at tilstrækkeligt rengøre bindevæv, der kan gøre det vanskeligere at tilføre den knudrede ganglion. Desuden har vi bekræfte, at de knudrede ganglier er intakte før du fortsætter med injektion ved at inducere apnø med 5-HT infusion. At tilføre den knudrede ganglion, vi brugte billig lille gauge (28 G, OD 362 um) nåle knyttet til en præcision glas sprøjte. Da injektionsstedet dybde for at forhindre punktering gennem knudrede ganglier var en bekymring, de affasede spidser sprøjterne blev skræddersyet med en mere lodret vinkel på 35 °. Dette adskiller sig fra andre Mikroinjektionsteknikker hvor glasmikropipetter anvendes 8-10,14-16 Fordelen ved glasmikropipetter er en mindre spids diameter.; Men der er risiko for at bryde spidsen under proceduren på grund af skrøbelighed glas. Desuden er dyrt udstyr nødvendig for at trække glasmikropipette, der ikke hver lab kan have. De specialfremstillede nåle har nogen risiko for at bryde, og selv om de var af større diameter (362 um) 17 sammenlignet med glas mikropipetter (20-100 pi), 8,9,14-16 nålene var stadig lille nok til knudrede ganglier injektioner. Desuden disse nåle var genbruges til mange eksperimenter og var betydeligt mindre omkostninger end udstyr, der anvendes til at trække mikropipetter.

På grund af størrelsen af ​​de brugerdefinerede-nåle, der anvendes til injektion i knudrede ganglier, er det vigtigt at vurdere skade, hvis nogen, til knudrede ganglier. En metode til vurdering af skader på den knudrede ganglier er gennem histologisk behandling og mikroskopi af den knudrede ganglier. 6-9,13,15 En anden metode, som anvendes i denne protokol, for at vurdere vagal afferent funktion sammenligner elektrofysiologiske eller adfærdsmæssige resultater mellem eksperimentelle og kontrol injektion grupper. 14-17 dronabinol injektioner har vist sig at svække 5-HT-induceret apnø i forhold til CONTROL injektioner, 17 angiver, at hvis der var nogle skader fra de større diameter brugerdefinerede nåle, der var stadig nok funktionelle knudrede gangliaceller der inhiberet dronabinol. Tilsvarende kvantificere omfanget af udbredelsen af de 5 pi dronabinol i olie er ikke nødvendig, da funktionelle udfald (dvs., apnø) var den vigtige parameter i denne protokol. Den anvendes i denne protokol volumen blev valgt for at sikre vid udbredelse af opløsningen indsprøjtes i knudrede ganglier. I andre lignende protokoller, injiceret volumen var ikke overdrevent forskellige og varierede fra 0,1 til 3 pi. 8,9,14-16 Omfanget af diffusion af dronabinol olie var tilstrækkelig til at dæmpe 5-HT-induceret apnø. 17

Er muligt at ændre denne protokol. Først, hvis forebyggelse beskadigelse af knudrede ganglier er en nødvendighed, mindre gauge nåle (mindste 33 g) kan anvendes i denne protokol. Ulempen ved at bruge en mindre Gauge nåle er: 1) de let kan brydes eller bøjet; 2) at de den indre diameter er for lille til at tillade indsprøjtning af viskose væsker som sesamolie. Desuden, hvis dybde injektionssted er vigtig, flere lodrette vinkel nåle (op til 45 °) kan købes. Dog vil en mere lodret vinkel gør det vanskeligere at punktere knudrede ganglier. Under injektion af knudrede ganglier kan ændre spændingen i vagus nerve ændres ved at placere mikro klemmer af forskellige størrelser. Hvis skader på vagus nerver / knudrede ganglier skal forebygges, derefter bruge mindre mikro klemmer er ideel. Endelig kan injektion af væsker indeholdende neurochemicals modificeres via volumen og koncentration af fluidum, der indsprøjtes. I denne protokol, 5 pi var mere end nok til at mætte knudrede ganglier.

En væsentlig begrænsning af denne protokol, er muligheden for at punktere gennem knudrede ganglier. Hvis dette sker, så re-bekræftelse af integritet knudrede ganglier should gøres. Hvis integriteten af ​​knudrede ganglier bekræftes, så knudrede ganglier injektion kan gentages. Men hvis der er tvivl om integriteten af knudrede ganglier, så et forsøg med en ny rotte skal udfyldes. 17

Mangfoldigheden af ​​receptorer på knudrede ganglier kan øge eller inhibere afferent nerve aktivitet. Stigende tyder på, at afferent aldrig aktivitet spiller en vigtig rolle i sygdomme hos mennesker. 2-4,23 Denne protokol giver en billig metode til lokal administration af neurochemicals til den knudrede ganglier for at studere deres virkning på afferent nerve aktivitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Denne undersøgelse blev støttet af National Institutes of Health (Grant 1UM1HL112856).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-HT HCl MP Biomedicals 215376591 12.5 µg/kg per 350 µl/kg
Dronabinol (Marinol) 10 mg Capsules (80 µg/µl) AbbVie NDC 0051-0023-21 Dilute with sesame oil to 20 µg/µl
Sesame Oil Sigma-Aldrich S3547
Intramedic Polyethylene-50 BD 427411 Ordered from VWR (Cat. # 63019-047)
Graefe Forceps Roboz RS-5138 Two are needed
Johns Hopkins Bulldog Clamp Roboz RS-7441 Three are needed
Piezoelectric Strain Gauge Ambu 813255-100
Data Acquisition USB Subsystems DataWave Technologies
Sciworks Experimenter Software
CyberAmp Axon Instruments
Syringe, 500 µl, Model 1750 TLL Hamilton Company 81220
Syringe, 10 µl, Model 1801 RN 7659-01
Needle, 28 G, Small Hub RN 7803-02 Point Style 4, Angle 35, Length 0.5 in

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhuo, H., Ichikawa, H., Helke, C. J. Neurochemistry of the nodose ganglion. Prog. Neurobiol. 52 (2), 79-107 (1997).
  2. Carley, D. W., Radulovacki, M. Pharmacology of vagal afferent influences on disordered breathing during sleep. Respir. Physiol. Neurobiol. 164 (1-2), 197-203 (2008).
  3. Kuo, P., Holloway, R. H. Beyond acid suppression: new pharmacologic approaches for treatment of GERD. Curr. Gastroenterol. Rep. 12 (3), 175-180 (2010).
  4. Maher, S. A., Dubuis, E. D., Belvisi, M. G. G-protein coupled receptors regulating cough. Curr. Opin. Pharmacol. 11 (3), 248-253 (2011).
  5. Greene, E. C. Anatomy of the rat. , Hafner. (1963).
  6. Li, Y., Wu, X., Zhou, S., Owyang, C. Low-affinity CCK-A receptors are coexpressed with leptin receptors in rat nodose ganglia: implications for leptin as a regulator of short-term satiety. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 300 (2), 217-227 (1152).
  7. Powley, T. L., et al. Vagal afferent innervation of the lower esophageal sphincter. Auton. Neurosci. 177 (2), 129-142 (2013).
  8. Neuhuber, W. L. Sensory vagal innervation of the rat esophagus and cardia: a light and electron microscopic anterograde tracing study. J. Auton. Nerv. Syst. 20, 243-255 (1987).
  9. Rogers, R. C., Nasse, J. S., Hermann, G. E. Live-cell imaging methods for the study of vagal afferents within the nucleus of the solitary tract. J. Neurosci. Methods. 150 (1), 47-58 (2006).
  10. Wan, S., et al. Presynaptic melanocortin-4 receptors on vagal afferent fibers modulate the excitability of rat nucleus tractus solitarius neurons. J. Neurosci. 28 (19), 4957-4966 (2008).
  11. Verberne, A. J., Lewis, S. J., Jarrott, B., Louis, W. J. Bezold-Jarisch reflex is inhibited by excitotoxin-induced destruction of vagal primary afferent neurons. Eur. J. Pharmacol. 139 (3), 365-367 (1987).
  12. Lewis, S. J., et al. Excitotoxin-induced degeneration of rat vagal afferent neurons. Neuroscience. 34 (2), 331-339 (1990).
  13. Wallick, D. W., Dunlap, M. E., Stuesse, S. S., Thames, M. D. Denervation of vagal cardiopulmonary receptors by injection of kainic acid into the nodose ganglia in dogs. Auton. Neurosci. 102 (1-2), 85-89 (2002).
  14. Muroi, Y., et al. Selective inhibition of vagal afferent nerve pathways regulating cough using Nav 1.7 shRNA silencing in guinea pig nodose ganglia. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 304 (11), 1017-1023 (2011).
  15. Kollarik, M., et al. Transgene expression and effective gene silencing in vagal afferent neurons in vivo using recombinant adeno-associated virus vectors. J. Physiol. 588 (21), 4303-4315 (2010).
  16. Zhang, Z., Zhang, C., Zhou, M., Xu, F. Activation of opioid mu-receptors, but not delta- or kappa-receptors, switches pulmonary C-fiber-mediated rapid shallow breathing into an apnea in anesthetized rats). Respir. Physiol. Neurobiol. 183 (3), 211-217 (2012).
  17. Calik, M. W., Radulovacki, M., Carley, D. W. Intranodose ganglion injections of dronabinol attenuate serotonin-induced apnea in Sprague-Dawley rat. Respir. Physiol. Neurobiol. 190, 20-24 (2014).
  18. Yoshioka, M., Goda, Y., Togashi, H., Matsumoto, M., Saito, H. Pharmacological characterization of 5-hydroxytryptamine-induced apnea in the rat. J. Pharmacol. Exp. Ther. 260 (2), 917-924 (1992).
  19. Kopczynska, B., Szereda-Przestaszewska, M. 5HT2 and 5HT3 receptors' contribution to modeling of post-serotonin respiratory pattern in cats. Life Sci. 75 (19), 2281-2290 (2004).
  20. Fan, P. Cannabinoid agonists inhibit the activation of 5-HT3 receptors in rat nodose ganglion neurons. J. Neurophysiol. 73 (2), 907-910 (1995).
  21. Jespersen, B., Knupp, L., Northcott, C. A. Femoral arterial and venous catheterization for blood sampling, drug administration and conscious blood pressure and heart rate measurements. J. Vis. Exp. (59), (2012).
  22. Barann, M., et al. Direct inhibition by cannabinoids of human 5-HT3A receptors: probable involvement of an allosteric modulatory site. Br. J. Pharmacol. 137 (5), 589-596 (2002).
  23. Bonaz, B., Picq, C., Sinniger, V., Mayol, J. F., Clarencon, D. Vagus nerve stimulation: from epilepsy to the cholinergic anti-inflammatory pathway. Neurogastroenterol. Motil. 25 (3), 208-221 (2013).

Tags

Neuroscience neurovidenskab knudrede ganglier vagus nerve EMG serotonin apnø genioglossus cannabinoider
En Metode til knudrede Ganglier Injection i Sprague-Dawley Rat
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Calik, M. W., Radulovacki, M.,… More

Calik, M. W., Radulovacki, M., Carley, D. W. A Method of Nodose Ganglia Injection in Sprague-Dawley Rat. J. Vis. Exp. (93), e52233, doi:10.3791/52233 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter