Protocol
Alle procedures en protocollen werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van de Universiteit van Illinois in Chicago. Experimenten hier beschreven acute niet-overlevingsexperimenten, en er was geen gebruik van oogzalf. Onderhoud van steriele omstandigheden treedt alleen op wanneer chirurgische instrumenten worden gewassen met 70% ethanol in Dih 2 O. Offer ratten aan het einde van de proef plaatsvond via overdosis IV ketamine / xylazine.
1. Voorbereiding van Instrumenten en Chemicaliën
- Bereid voorraadoplossing van 0,05 M van 5-HT HCl in PBS. Verdunnen dan voorraad met PBS tot een uiteindelijke 5-HT-concentratie van 0,203 mM.
- Verdun dronabinol in sesamolie in een concentratie van 20 ug / ul.
- Knip 20 cm lengte van polyethyleen (PE) -50 buis (ID 0,58 mm, 0,965 mm OD). Aan het ene uiteinde van de slang, snijd een schuine tip met een schaar, en aan de andere vierkante uiteinde, steek een 23 g naald. Sluit deze 23 g naald naar een 1 mlspuit en vul deze met 0,3 ml van 50 u / ml heparine.
- Snijd vier stukken van 4-0 gevlochten zijden draad en zet aan de kant.
- Steriliseren chirurgische schaar, 2 gebogen Graefe pincet, en 3 micro klemmen met 70% ethanol in Dih 2 O.
2. catheterisatie van dijader
Protocol voor catheterisatie wordt gewijzigd van Jespersen et al. 21
- Verdoven een Sprague-Dawley ratten met intraperitoneale (IP) ketamine / xylazine (100 mg / kg 10 mg / kg). Knijp de teen van de rat en het observeren elke beweging tot een goed niveau van anesthesie te bevestigen. Scheer het ventrale aspect van de linkerdij en het ventrale aspect van de hals. Zo nodig door de lokale Institutional Animal Care en gebruik Comite, gelden oogzalf tot droog te voorkomen.
- Beveiligde rat in rugligging op een chirurgische boord. Gebruik chirurgische schaar om de huid in de linker achterpoot dij weggesneden.
- Met behulp van een tang, gedrag botte dissection van de oppervlakkige spier om de femorale ader bloot. Gebruik de tang om de ader te scheiden van de femorale slagader, en plaats 2 draden rond de femorale ader.
- Gebruik de gebogen Graefe tang om pull-up de ader om de bloedstroom te stoppen. Met behulp van een 22 G naald, prik de femorale ader en steek vervolgens de afgeschuinde einde van de PE-50 buizen in de ader.
- Controleer of de PE-50 buis correct werd ingevoegd bij het terugtrekken van de plunjer van de injectiespuit. Bloed moet worden gezien die het PE-50 buis. Bind 2 knopen rond de ader en PE-50 buizen met behulp van de 2 draden.
3. 5-HT-geïnduceerde Apneu via intraveneuze infusie
- Plaats een piëzo rekstrookje rond de rat ademhaling meten.
- Instellingen wijzigen voor versterking van het elektronische versterker via versterker software op de computer: om te versterken (100x) en band-pass filter (1-10 Hz) de luchtwegen signalen verkregen uit de spanningsmeter, stelt u "highpas filter" op & #8220, AC @ 1 HZ "en" laagdoorlaatfilter "op" 10 Hz, "en stel de versterking door het invoeren van" 10 "voor de" Initial Gain "en" 100 "voor" Total Gain "..
- Instellingen voor sampling rate veranderen door het openen van "Analog Input" via de opname-software op de computer. Te digitaliseren (500 Hz sampling rate) met behulp van een analoog-naar-digitaal converter, "monster" in "1000 Hz" en de "skip" om de andere opname punt met "1" (effectieve sampling rate van 500 Hz), en vervolgens het signaal op te nemen met behulp van opname-software.
- Verwijder de 1 ml spuit uit de katheter en plaats 500 pl precisie injectiespuit gevuld met 0,203 mM 5-HT in de katheter.
- Plaats de 500 pi precisie glas spuit in een infuuspomp. Trekken 12,5 ug / kg per 350 gl / kg 5-HT oplossing bij een snelheid van 63 ml / uur. Voeren meerdere infusies en observeren apneu in de rat, die wordt gezien als eensa pauze in de ademhaling (≥ 2,5 sec) in de opgenomen respiratoire signalen op de computer monitor.
- Voordat u verder gaat met nek chirurgie, monitoren ademhalingspatroon en controleer pijn reflex uit teen knijpen in de rat. Als de ademhaling onregelmatig is, of als er een pijn reflex uit teen knijpen, beheren van IP ketamine / xylazine (100 mg / kg: 5 mg / kg) en vervolgens opnieuw te bevestigen een goed niveau van anesthesie.
4. Neck Surgery aan Expose nodose Ganglia
- Beveiligde rat in rugligging op een chirurgische boord. Maak een middellijn langssnede behulp van chirurgische schaar in de nek.
- Met behulp van stompe dissectie op de platysma spier (met behulp van 2 micro klemmen om deze spier duidelijk van de operatiewond te houden), bloot de sternohyoideus en omohyoideus spieren. Scheiden deze spieren aan de interne halsslagader en één van zijn takken, de pterygopalatine slagader bloot.
- Let op de nervus vagus als het loopt langs de interne halsslagader en dan langs th e pterygopalatine slagader. Observeren hoe de nervus vagus en pterygopalatine slagader, samen met de glossofaryngeale zenuw (hersenzenuw IX) en de spinale accessoire zenuw (hersenzenuw XI), voert u de achterste gescheurd foramen aan de basis van de schedel.
- Merk op dat de knobbelige ganglion wordt weergegeven als een zwelling van de nervus vagus juiste voordat het in de achterste gescheurd foramen. Merk ook op dat de keelholte en het strottenhoofd zenuw takken komen uit de voorste en achterste aspecten, respectievelijk van de nodose ganglion. 5
- Met behulp van de Graefe tang, scheiden de nervus vagus van de slagaders, en leg een stuk draad rond de nervus vagus. Plaats een klem op de draad naar lichte spanning toe te passen op de nervus vagus, en reinig de nodose ganglion van bindweefsel om minder weerstand te bieden bij het injecteren.
- Herhaal 5-HT geïnduceerde apneu zoals vermeld in paragraaf 3 te bevestigen dat er geen schade is gedaan om de nodose ganglia.
- Vul een 10 ul gasdichte precisie glas spuit aangebracht met een custom-made 28 g half-inch naald met een 35 ° afgeschuinde tip met 5 ul van dronabinol in sesamolie.
- Plaats een micro klem op de draad naar lichte spanning toe te passen op de nervus vagus, en doorboren de nodose ganglion zorg niet te doorboren doorheen. Druk de spuit langzaam (≥ 60 sec) om de volledige inhoud van de spuit te injecteren. Merk op dat sommige van de inhoud spuit uit het ganglion zal lekken.
- Herhaal 5-HT-geïnduceerde apneu zoals vermeld in paragraaf 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 geeft sample ademhaling opname in ratten die infusie van 5-HT tot apneu induceren vóór en na intranodose ganglia injecties dronabinol hadden. 5-HT activeert 5-HT3-receptoren op de knobbelige ganglia die bijdragen aan de Bezold-Jarisch reflex van bradycardie, hypotensie en apnoe. 11,17-19 Intranodose ganglia injecties dronabinol activeren remmende CB receptoren of allosterisch moduleert 5-HT 3 receptoren die de 5-HT geïnduceerde excitatie van de nervus vagus. 16,17,20,22 remmen vóór (figuur 1, bovenste paneel) en na (figuur 1, middelste paneel) halsheelkunde infusie van 5-HT (Figuur 1 , aangeklaagd door rode lijn) lokt een apneu respons gezien als een gebrek aan buik beweging gemeten door de piëzo-elektrische spanningsmeter. Na intranodose ganglia injecties van dronabinol (figuur 1, onderste paneel), leverde IV 5-HT infusie niet ontlokkeneen apneu respons. Na sesamolie injecties (data niet getoond) in knobbelige ganglia voertuig controle ratten, IV 5-HT infusie wekte een apneu respons vergelijkbaar basislijnen. 17
Figuur 1:. Monster opnames van acute 5-HT-indudced apneu experimenten voor en na 100 ug dronabinol in 5 pl sesamolie injecties in de knobbelige ganglia van de vagus zenuwen 17 Respiratory werden opgenomen vóór de operatie (bovenste paneel), na operatie ( middenpaneel), en na nodose ganglia injecties (onderste paneel). Rode lijn duidt IV 5-HT infusie tot apneu veroorzaken. Na sesamolie injecties (data niet getoond) in knobbelige ganglia voertuig controle ratten, IV 5-HT infusie wekte een apneu respons vergelijkbaar basislijnen. 17 Dit cijfer is aangepast Calik et al. 17AU = willekeurige eenheden; RESP = luchtwegen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De kritische stappen voor een succesvolle injectie van neurotransmitters in de knobbelige ganglia zijn: 1) het identificeren en reinigen bindweefsel van de nodose ganglia; 2) bevestiging van de integriteit van de knobbelige ganglia voor injectie; 3) en met behulp van een kleine naald om delicaat injecteren in, maar niet volledig te prikken door, de nodose ganglia.
De nervus vagus innerveert vele organen in de nek en buik, en stuurt belangrijke informatie, zoals de hartslag, bloeddruk, bronchopulmonale irritatie, en gastro-intestinale uitzetting naar het CNS. De knobbelige ganglia van de nervus vagus bevat een uiteenlopende reeks receptoren voor aminozuren, monoamines, neuropeptiden en andere neurotransmitters. 1 Intranodose ganglia injecties van neurotransmitters voor die receptoren de activiteit van de nervus vagus wijzigen zijn gedaan, 16,17 en vormen een uitstekende experimenteel model voor perifere pharmacologi helderencal effecten op de nervus vagus, dat ziekten zoals slaapapneu, gastro-oesofageale reflux, of chronische hoest kan wijzigen. 2-4
Om de nodose ganglia bloot te leggen, wordt de hals chirurgie uitgevoerd en de spieren van de nek worden gescheiden om de interne halsslagader bloot. De nervus zenuwen worden gezien langs de interne halsslagader en de pterygopalatine slagaders. De cellichamen van de unipolaire vagus zenuwen in de nodose en petrosus ganglia, die worden gezien als een zwelling van de vagus zenuwen alvorens de schedel op de achterste gescheurd foramens. 5
Manipulaties van de nodose ganglia zijn belangrijk in zoverre dat de nodose ganglia en nervus zenuwen niet beschadigd tijdens de operatie. Onjuiste en ruwe chirurgische techniek kan de knobbelige ganglia en zenuwtakken, samen met de slagaders en de andere craniale zenuwen beschadigen. In dit protocol aan de nervus vagus te stabiliseren, bieden wij een lichte spanning op de Vagus zenuw via zijden draad aan een micro-clip bevestigd. Dit stelt ons in staat om elke bindweefsel dat zou het moeilijker maken om te injecteren in de nodose ganglion adequaat te reinigen. Bovendien bevestigen wij dat de nodose ganglia intact zijn alvorens de injectie door het induceren van apneu door 5-HT infusie. Om te injecteren in de nodose ganglion, gebruikten we goedkope kleine gauge (28 G, OD 362 micrometer) naalden bevestigd aan een precisie glazen injectiespuit. Omdat injectie diepte te voorkomen doorboren door de knobbelige ganglia een zorg, de afgeschuinde uiteinden van de spuiten werden op maat gemaakt met een verticale hoek van 35 °. Dit verschilt van andere micro-injectie technieken waarbij glas micropipetten worden gebruikt 8-10,14-16 Het voordeel van glas micropipetten is een kleinere tip diameter.; er is echter breukgevaar de punt tijdens de procedure door de breekbaarheid van glas. Bovendien is dure apparatuur nodig om de glazen micropipet, die niet elk lab bezitten trekken. De op maat gemaakte naalden hebben geen risico op het breken, en al waren ze van grotere diameter (362 micrometer) 17 in vergelijking met glas micropipetten (20-100 ui), 8,9,14-16 de naalden waren nog klein genoeg voor nodose ganglia injecties. Bovendien zijn deze naalden waren herbruikbare voor vele experimenten en waren aanzienlijk minder kosten dan de apparatuur die wordt gebruikt om micropipetten trekken.
Vanwege de grootte van de maat naalden voor injectie in knobbelige ganglia, is het belangrijk om beschadiging, indien aanwezig, de knobbelige ganglia. Een evaluatiemethode van schade aan de knobbelige ganglia is door histologische verwerking en microscopie van de knobbelige ganglia. 6-9,13,15 Een tweede methode, die wordt gebruikt in dit protocol, om vagale afferente functie getest vergelijkt elektrofysiologische of gedragsresultaten tussen experimentele en controle groepen injectie. 14-17 dronabinol injecties is aangetoond dat 5-HT geïnduceerde apneu verzwakken ten opzichte control injecties, 17 betekent dat als er enige schade als gevolg van de grotere maat diameter naalden, waren er nog genoeg functionele nodose ganglia cellen die werden geremd door dronabinol. Ook het kwantificeren van de omvang van de verspreiding van de 5 pi dronabinol in olie is niet nodig, omdat functionele resultaten (dat wil zeggen, apneu) waren de belangrijke maatstaf van dit protocol. Het volume dat in dit protocol werd gekozen om brede verspreiding van de oplossing geïnjecteerd in de nodose ganglia garanderen. Op soortgelijke protocollen geïnjecteerde volume niet overmatig verschillend en varieerde 0,1-3 ul. 8,9,14-16 De mate van diffusie van dronabinol olie was voldoende om 5-HT geïnduceerde apneu verzwakken. 17
Wijzigingen in dit protocol zijn mogelijk. Ten eerste, als het voorkomen van schade aan de knobbelige ganglia is noodzakelijk, kleinere naalden (kleinste 33 G) worden gebruikt in dit protocol. Het nadeel van een kleinere gauge naalden is: 1) ze kunnen gemakkelijk worden gebroken of verbogen; 2) zij de inwendige diameter te klein om voor injectie van viskeuze vloeistoffen zoals sesamolie. Bovendien, als diepte plaatsen injecteren belangrijk, meer verticale hoek naalden (tot 45 °) worden gekocht. Echter een verticale hoek maken het moeilijker om de knobbelige ganglia doorboren. Bij injectie van de nodose ganglia, kunnen wijzigen spanning van de nervus vagus worden gewijzigd door met micro klemmen van verschillende grootte. Indien beschadiging van de nervus zenuwen / knobbelige ganglia moet worden voorkomen, dan met kleinere micro klemmen ideaal. Ten slotte kan de injectie van vloeistoffen die neurotransmitters worden gewijzigd via de hoeveelheid en concentratie van de vloeistof ingespoten. In dit protocol, 5 gl was ruim voldoende om de knobbelige ganglia verzadigen.
Een belangrijke beperking van dit protocol is de mogelijkheid prikken door de knobbelige ganglia. Als dit gebeurt, opnieuw een bevestiging dan van de integriteit van de nodose ganglia should worden gedaan. Indien de integriteit van de knobbelige ganglia wordt bevestigd, dan knobbelige ganglia injectie kan herhaald. Echter, als er twijfel is over de integriteit van de nodose ganglia, dan is een experiment met een nieuwe rat zou moeten worden afgerond. 17
De diversiteit van receptoren op de nodose ganglia kan verhogen of remmen afferente zenuw activiteit. Steeds meer bewijs suggereert dat afferente nooit activiteit een belangrijke rol in de menselijke ziekten speelt. 2-4,23 Dit protocol biedt een goedkope manier van lokale toediening van neurochemicaliën de nodose ganglia om hun effect op afferente zenuw activiteit te bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door de National Institutes of Health (Grant 1UM1HL112856).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-HT HCl | MP Biomedicals | 215376591 | 12.5 µg/kg per 350 µl/kg |
| Dronabinol (Marinol) 10 mg Capsules (80 µg/µl) | AbbVie | NDC 0051-0023-21 | Dilute with sesame oil to 20 µg/µl |
| Sesame Oil | Sigma-Aldrich | S3547 | |
| Intramedic Polyethylene-50 | BD | 427411 | Ordered from VWR (Cat. # 63019-047) |
| Graefe Forceps | Roboz | RS-5138 | Two are needed |
| Johns Hopkins Bulldog Clamp | Roboz | RS-7441 | Three are needed |
| Piezoelectric Strain Gauge | Ambu | 813255-100 | |
| Data Acquisition USB Subsystems | DataWave Technologies | ||
| Sciworks Experimenter Software | |||
| CyberAmp | Axon Instruments | ||
| Syringe, 500 µl, Model 1750 TLL | Hamilton Company | 81220 | |
| Syringe, 10 µl, Model 1801 RN | 7659-01 | ||
| Needle, 28 G, Small Hub RN | 7803-02 | Point Style 4, Angle 35, Length 0.5 in |
References
- Zhuo, H., Ichikawa, H., Helke, C. J.
- Carley, D. W., Radulovacki, M. Pharmacology of vagal afferent influences on disordered breathing during sleep. Respir. Physiol. Neurobiol. 164 (1-2), 197-203 (2008).
- Kuo, P., Holloway, R. H. Beyond acid suppression: new pharmacologic approaches for treatment of GERD. Curr. Gastroenterol. Rep. 12 (3), 175-180 (2010).
- Maher, S. A., Dubuis, E. D., Belvisi, M. G.
- Greene, E. C. Anatomy of the rat. , Hafner. (1963).
- Li, Y., Wu, X., Zhou, S., Owyang, C. Low-affinity CCK-A receptors are coexpressed with leptin receptors in rat nodose ganglia: implications for leptin as a regulator of short-term satiety. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 300 (2), 217-227 (1152).
- Powley, T. L., et al. Vagal afferent innervation of the lower esophageal sphincter. Auton. Neurosci. 177 (2), 129-142 (2013).
- Neuhuber, W. L. Sensory vagal innervation of the rat esophagus and cardia: a light and electron microscopic anterograde tracing study. J. Auton. Nerv. Syst. 20, 243-255 (1987).
- Rogers, R. C., Nasse, J. S., Hermann, G. E. Live-cell imaging methods for the study of vagal afferents within the nucleus of the solitary tract. J. Neurosci. Methods. 150 (1), 47-58 (2006).
- Wan, S., et al. Presynaptic melanocortin-4 receptors on vagal afferent fibers modulate the excitability of rat nucleus tractus solitarius neurons. J. Neurosci. 28 (19), 4957-4966 (2008).
- Verberne, A. J., Lewis, S. J., Jarrott, B., Louis, W. J. Bezold-Jarisch reflex is inhibited by excitotoxin-induced destruction of vagal primary afferent neurons. Eur. J. Pharmacol. 139 (3), 365-367 (1987).
- Lewis, S. J., et al. Excitotoxin-induced degeneration of rat vagal afferent neurons. Neuroscience. 34 (2), 331-339 (1990).
- Wallick, D. W., Dunlap, M. E., Stuesse, S. S., Thames, M. D. Denervation of vagal cardiopulmonary receptors by injection of kainic acid into the nodose ganglia in dogs. Auton. Neurosci. 102 (1-2), 85-89 (2002).
- Muroi, Y., et al. Selective inhibition of vagal afferent nerve pathways regulating cough using Nav 1.7 shRNA silencing in guinea pig nodose ganglia. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 304 (11), 1017-1023 (2011).
- Kollarik, M., et al. Transgene expression and effective gene silencing in vagal afferent neurons in vivo using recombinant adeno-associated virus vectors. J. Physiol. 588 (21), 4303-4315 (2010).
- Zhang, Z., Zhang, C., Zhou, M., Xu, F. Activation of opioid mu-receptors, but not delta- or kappa-receptors, switches pulmonary C-fiber-mediated rapid shallow breathing into an apnea in anesthetized rats). Respir. Physiol. Neurobiol. 183 (3), 211-217 (2012).
- Calik, M. W., Radulovacki, M., Carley, D. W. Intranodose ganglion injections of dronabinol attenuate serotonin-induced apnea in Sprague-Dawley rat. Respir. Physiol. Neurobiol. 190, 20-24 (2014).
- Yoshioka, M., Goda, Y., Togashi, H., Matsumoto, M., Saito, H. Pharmacological characterization of 5-hydroxytryptamine-induced apnea in the rat. J. Pharmacol. Exp. Ther. 260 (2), 917-924 (1992).
- Kopczynska, B., Szereda-Przestaszewska, M. 5HT2 and 5HT3 receptors' contribution to modeling of post-serotonin respiratory pattern in cats. Life Sci. 75 (19), 2281-2290 (2004).
- Fan, P. Cannabinoid agonists inhibit the activation of 5-HT3 receptors in rat nodose ganglion neurons. J. Neurophysiol. 73 (2), 907-910 (1995).
- Jespersen, B., Knupp, L., Northcott, C. A. Femoral arterial and venous catheterization for blood sampling, drug administration and conscious blood pressure and heart rate measurements. J. Vis. Exp. (59), (2012).
- Barann, M., et al. Direct inhibition by cannabinoids of human 5-HT3A receptors: probable involvement of an allosteric modulatory site. Br. J. Pharmacol. 137 (5), 589-596 (2002).
- Bonaz, B., Picq, C., Sinniger, V., Mayol, J. F., Clarencon, D. Vagus nerve stimulation: from epilepsy to the cholinergic anti-inflammatory pathway. Neurogastroenterol. Motil. 25 (3), 208-221 (2013).
