Introduction
ऑप्टिक तंत्रिका केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) ऐसे ऑप्टिक न्युरैटिस, मोतियाबिंद और आघात के रूप में ophthalmologic शर्तों सहित पुनर्योजी अनुसंधान के लिए एक आदर्श स्थान प्रदान करता है। स्टेम कोशिकाओं की एक किस्म के इंजेक्शन या तो axonal गिनती बढ़ती जा रही है और / या अपक्षयी रोगों की रोकथाम, प्रभावकारिता का प्रदर्शन या खो माइलिन की जगह में वादा दिखाया है। 1,2
मानव ऑप्टिक तंत्रिका लगभग 3.0-3.5 मिमी की एक व्यास के साथ chiasm करने के लिए रेटिना से यात्रा लगभग 12 लाख समानांतर एक्सोन मौजूद हैं। 3 प्रयोगशाला में मानव रोगों के लिए मॉडल के लिए, चूहे अक्सर इस्तेमाल किया गया है। वयस्क चूहे ऑप्टिक तंत्रिका लगभग 0.5 मिमी की एक व्यास के भीतर लगभग 100,000 एक्सोन गये हैं। सीएनएस में प्रमुख सीमाओं के 4 एक पुनर्योजी अनुसंधान प्रत्यक्ष कमजोर उपयोग होता है। जानवर के लिए जटिलताओं और शल्य चिकित्सा जोखिम खोपड़ी या कशेरुकाओं हटा रहे हैं जब अधिक है। के लाभ के लिए इसी प्रकाररीढ़ की हड्डी में न्यूनतम इनवेसिव दृष्टिकोण, खोपड़ी प्रस्ताव कम जटिलताओं और एक और अधिक तेजी से वसूली खोलने के बिना 5 प्रत्यक्ष ऑप्टिक तंत्रिका इंजेक्शन।
इस तकनीक को पिछले अध्ययनों में इस्तेमाल किया गया है। 6 इस पांडुलिपि और साथ वीडियो में, हम चूहे ऑप्टिक तंत्रिका में स्टेम कोशिकाओं इंजेक्षन करने के लिए एक न्यूनतम इनवेसिव प्रक्रिया प्रदर्शित करता है।
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Protocol
नोट: सभी पशु प्रक्रियाओं जॉन्स हॉपकिन्स पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया। संज्ञाहरण मशीनों आवश्यक के रूप में वार्षिक निरीक्षण और अंशांकन आवश्यकता होती है।
1. संज्ञाहरण और पोजिशनिंग
- संज्ञाहरण।
- 2-3% isofluorane साथ संज्ञाहरण के तहत सभी सर्जिकल प्रक्रियाओं का प्रदर्शन। पैर के अंगूठे चुटकी और सांस लेने की दर से संज्ञाहरण के उचित स्तर की पुष्टि करें। चूहे एक पैर के अंगूठे चुटकी के जवाब में विमुख होना नहीं है कि जाँच करें।
ध्यान दें: एक ठमकना बहुत देर हो चुकी है कि संज्ञाहरण इंगित करता है और शुरुआत से पहले लंबे समय तक संज्ञाहरण या एक उच्च isofluorane एकाग्रता की आवश्यकता हो सकती है। हर 2 सेकंड संज्ञाहरण का संकेत भी धीमी है 1 सांस से कम एक साँस लेने की दर बहुत अधिक है और isofluorane एकाग्रता की बिजली की आवश्यकता हो सकती है। - प्रक्रिया के दौरान सिर आंदोलन से बचने के लिए आवश्यक के रूप में पशु सुरक्षित। नेत्र शल्य चिकित्सा पर lidocaine की एक बूंद रखें। संज्ञाहरण के तहत, जबकि सूखापन को रोकने के लिए कृत्रिम आँसू हर 10 मिनट का प्रयोग करें। देना0.01 मिलीग्राम / किग्रा अनुसूचित जाति पूर्व ऑपरेशन और उसके बाद हर 6-8 घंटे के buprenorphine का एक इंजेक्शन की जरूरत के रूप में।
- 2-3% isofluorane साथ संज्ञाहरण के तहत सभी सर्जिकल प्रक्रियाओं का प्रदर्शन। पैर के अंगूठे चुटकी और सांस लेने की दर से संज्ञाहरण के उचित स्तर की पुष्टि करें। चूहे एक पैर के अंगूठे चुटकी के जवाब में विमुख होना नहीं है कि जाँच करें।
- पोजिशनिंग।
- एक stereotaxic फ्रेम में चूहों प्लेस और एक हीटिंग पैड के साथ गर्म रहते हैं। आंखों पर जोखिम से बचने के लिए शराब ख्याल रखने के साथ खोपड़ी फर गीले। पोस्ट ऑपरेटिव संक्रमण के जोखिम को कम करने के लिए बाँझ उपकरण और बाँझ तकनीक का प्रयोग करें।
2. आँखों का नियंत्रण
- पार्श्व कंजाक्तिवा में 4-0 सीवन प्लेस और सौम्य कर्षण अनुमति देने के लिए पर्याप्त सीवन के साथ टाई।
3. विच्छेदन
- प्रारंभिक विच्छेदन।
- । चित्रा 1 में दिखाया गया के रूप में एक आकार 10 स्केलपेल का उपयोग कक्षीय रिज overlying त्वचा में एक ~ 1 इंच चीरा त्वचा और अंतर्निहित प्रावरणी वापस लेना और ध्यान से प्रावरणी दूर काटना। शल्य चिकित्सा में अत्यधिक रक्तस्राव रोकने के लिए, प्रावरणी विदारक जबकि रक्त वाहिकाओं को काटने से बचें। Pl के लिए रणनीतिक रूप से प्रयोग करेंaced कपास सुझावों रक्तस्तम्भन प्रदान करने के लिए।
- गहरा विच्छेदन।
नोट: नीचे और सॉकेट के बाहर आंख खींच कंजाक्तिवा पर कोमल कर्षण के साथ, बेहतर कक्षीय पेशी देखने में आ जाएगा। ऑप्टिक तंत्रिका बेनकाब करने के लिए, इस मांसपेशी में कटौती और रेट्रो-कक्षीय वसा हटा दिया जाना चाहिए। वसा खारिज किया जा सकता है और इंजेक्शन के बाद नहीं बदला जाना चाहिए। इस बिंदु से, ऑप्टिक तंत्रिका प्रावरणी ड्यूरा में लिपटे रक्त वाहिकाओं (चित्रा 1) के साथ-साथ, ऑप्टिक तंत्रिका खुद की एक बंडल के रूप में दिखाई जानी चाहिए।- कम दर्दनाक भेदी बनाने के लिए स्केलपेल या एक 31 गेज beveled सुई का उपयोग ड्यूरा में एक छोटा सा चीरा बनाओ।
4. पिपेट इंजेक्टर
- 50-100 माइक्रोन की एक व्यास के लिए एक कांच micropipette खींचो। स्थिरता प्रदान करने के लिए, एक micromanipulator पर micropipette के माउंट और एक प्रेरणा पंप से जुड़ा एक हैमिल्टन सिरिंज को देते हैं।
- मोती ऊपर खींचो (या स्टेम सेल)पहले और बाद में मिथाइल नीले समाधान के 0.5 μl मात्रा के साथ-साथ प्रतिगामी micropipette में एक 0.5-1.0 μl मात्रा में पुनर्गठन किया।
नोट: न्यूनतम प्रति 0.5-2 μl करने के लिए सेट एक प्रेरणा दर ऑप्टिक तंत्रिका आघात से बचाता है।
5. इंजेक्शन
- बस nicked ड्यूरा से ऊपर ऑप्टिक तंत्रिका पर micropipette की नोक कम करें।
नोट: कम से कम नुकसान में ऑप्टिक तंत्रिका परिणामों में कांच टिप के एक छोटे से, लेकिन तेज आंदोलन। संचार पंप शुरू होता है, मिथाइल नीले रंग की डाई इंजेक्ट ऑप्टिक तंत्रिका के क्षेत्र को उजागर करना चाहिए। डाई अवजालतनिका अंतरिक्ष में बाहर लीक बिना ऑप्टिक तंत्रिका भीतर स्थानीयकृत रहना चाहिए। - स्टेम सेल इंजेक्शन पूरा हो गया है जब निर्धारित करने और मिथाइल नीले रंग की दूसरी खुराक इंजेक्ट किया जाता है के रूप में जान फूंकना पंप बंद करने के लिए मिथाइल नीले रंग के दूसरे बैंड का पालन करें। उच्च रोकने के लिए में इंजेक्शन प्रत्येक 1 μl मात्रा के लिए 2 मिनट के लिए ऑप्टिक तंत्रिका के भीतर अभी भी micropipette रखेंmicropipette की वापसी पर दबाव इंजेक्शन।
ध्यान दें: एक वैकल्पिक दृष्टिकोण मैन्युअल रूप से चालाकी से किया जा सकता है कि एक हवा भरी सिरिंज से विंदुक टिप कनेक्ट करने के लिए है। किसी भी तरह से, ऑप्टिक नसों को नुकसान कम करने के लिए अत्यधिक बल से बचें। हम एक-ऑप्टिक तंत्रिका में मात्रा का अधिक नहीं 2 μl इंजेक्शन लगाने की सलाह देते हैं।
6. ऊपर का पालन करें
- तत्काल।
- इंजेक्शन पूरा हो गया है, रक्तस्तम्भन प्रदान करने के लिए प्रयोग किया जाता है किसी भी कपास सुझावों के साथ साथ micropipette हटा दें। 3-0 रेशम के साथ त्वचा सिवनी और नेत्रश्लेष्मला सिवनी को हटा दें।
- वे संज्ञाहरण से उभरने जब तक एक हीटिंग पैड पर गर्म चूहों रखें। यह sternal अवलंबन बनाए रखने के लिए पर्याप्त होश आ गया है जब तक पहुंच के बाहर एक जानवर को मत छोड़ो। पूरी तरह से ठीक है जब तक अन्य जानवरों की कंपनी के लिए सर्जरी आया है कि एक जानवर वापस नहीं है।
- पशु अत्यधिक सुस्ती, गतिभंग, या अस्वाभाविक साँस सहित दर्द के लक्षण प्रदर्शित किया जाता है तोजी, दैनिक तीन गुना तक इंट्रामस्क्युलर buprenorphine (0.05 मिलीग्राम / किग्रा) के साथ उचित एनलजेसिया प्रशासन।
- दीर्घकालिक।
- अगले 24-48 घंटे के लिए, सूजन या मुक्ति घाव से या ऐसे vocalizing, hunched उपस्थिति, गैर-संवारने, या नहीं खा के रूप में दर्द के अन्य लक्षण सहित सर्जरी की जटिलताओं के लिए चूहा पालन। आवश्यक के रूप में एक पशु चिकित्सक या नैतिक इच्छामृत्यु के साथ परामर्श पर विचार करें।
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Representative Results
प्रयोग के समापन पर, चूहों बलिदान किया गया और 4% paraformaldehyde के साथ perfused। ऑप्टिक नसों ध्यान से विच्छेदित और cryostat सेक्शनिंग के लिए बढ़ रहे थे। 2 इवांस नीले रंग की डाई साइट कल्पना करने के क्रम में इंजेक्ट किया गया था, जिसमें कम शक्ति पर एक चूहा पूरी ऑप्टिक तंत्रिका का एक उदाहरण से पता चलता है। तीर इंजेक्शन का सटीक स्थान को पहचानती है। तंत्रिका नीचे डाई की प्रतिबंधित प्रसार द्वारा संकेत के रूप में इस विच्छेदन इंजेक्शन के कुछ ही मिनट के भीतर किया गया था। अन्य इंजेक्शन में, हम कई घंटे के कोर्स पर ऑप्टिक chiasm की ओर डाई की एक धीमी गति से प्रसार मनाया है।
चित्रा 1:। देखने की शल्य चिकित्सा क्षेत्र चूहा इस आंकड़े में बाईं आंख का उपयोग करने के साथ तैनात है। एक चीरा कक्षीय रिज और प्रावरणीय के ऊपर बना हैऊतक आँख के पीछे नीचे विच्छेदित कर रहा है। एक नेत्रश्लेष्मला सिवनी ऑपरेटर खोपड़ी खोलने के बिना देखने में intracranial ऑप्टिक तंत्रिका खींचती है, जो सौम्य कर्षण लागू करने के लिए अनुमति देता है।
चित्रा 2:। इंजेक्ट ऑप्टिक तंत्रिका के सकल विच्छेदन इवांस नीले रंग की डाई का उपयोग, ऑप्टिक तंत्रिका में इंजेक्शन साइट निहायत एक विच्छेदन खुर्दबीन के नीचे देखे जा सकते हैं। इस छवि में, ऑप्टिक तंत्रिका ऑप्टिक तंत्रिका ऊतक के भीतर एम्बेडेड डाई दिखाने के लिए इंजेक्शन स्थल पर काट दिया गया।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lewis rat | Charles River | 4 | Any rat strain will work. |
| Anesthesia machine | Surgivet | CDS9000 | CDS 9000 Small Animal Anesthesia Machine - Pole Mount |
| Infusion pump | Stoelting | 53129 | |
| Dissection microscope | National Optical | 409-411-1105 | |
| Fiber-optic light source | Fisher Scientific | 12-562-21 | |
| Dissection and Stereotaxic Instrument | Stoelting | 51400 | |
| Pipette Puller | Kopf | 750 | |
| Pipettes | World Precision Instruments | 18150-6 | |
| Disposable scalpel blades | Harvard Apparatus | 810-15-021 | |
| Iridectomy scissors | Electron Microscopy Sciences | Uniband LA-4XF |
References
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