Abstract
Neurociencia experimental está siendo testigo de un creciente interés en el desarrollo y aplicación de la novela y, protocolos de circuito cerrado a menudo complejas, donde el estímulo aplicado depende, en tiempo real sobre la respuesta del sistema. Aplicaciones recientes van desde la implementación de sistemas de realidad virtual para el estudio de las respuestas motoras, tanto en ratones 1 y 2 en el pez cebra, para controlar de convulsiones después del accidente cerebrovascular cortical utilizando optogenética 3. Una ventaja clave de las técnicas de bucle cerrado reside en la capacidad de sondeo propiedades dimensionales superiores que no son directamente accesibles o que dependen de múltiples variables, como la excitabilidad neuronal 4 y fiabilidad, mientras que al mismo tiempo, maximizar el rendimiento experimental. En esta contribución y en el contexto de la electrofisiología celular, se describe cómo aplicar una variedad de protocolos de bucle cerrado para el estudio de las propiedades de respuesta de las neuronas corticales piramidal, recorded intracelularmente con la técnica de patch clamp en rodajas de cerebro agudas de la corteza somatosensorial de ratas jóvenes. Como ningún software de código abierto disponibles comercialmente o proporciona todas las características necesarias para llevar a cabo de manera eficiente los experimentos descritos aquí, una nueva caja de herramientas de software llamado LCG 5 fue desarrollado, cuya estructura modular maximiza la reutilización de código informático y facilita la implementación de nuevos paradigmas experimentales. Formas de onda de estimulación se especifican mediante un pacto meta-descripción y protocolos experimentales completos se describen en los archivos de configuración basados en texto. Además, LCG tiene una interfaz de línea de comandos que es adecuado para la repetición de los ensayos y la automatización de los protocolos experimentales.
Introduction
En los últimos años, la electrofisiología celular ha evolucionado desde el paradigma tradicional de bucle abierto empleado en los experimentos de tensión y corriente a los protocolos de fijación de bucle cerrado modernos. La técnica de circuito cerrado más conocido es quizás la pinza dinámica 6,7, lo que permitió la inyección sintética de los canales iónicos dependientes de voltaje artificiales para determinar el voltaje de la membrana neuronal 8, el estudio en profundidad de los efectos de la no-determinista parpadeo en canales iónicos en la dinámica de respuesta neuronal 9, así como la recreación in vitro de realistas en Vivo- como actividad de fondo sináptica 10.
Otros paradigmas de circuito cerrado que se han propuesto incluyen la abrazadera reactiva 11, para estudiar in vitro la generación de actividad persistente autosostenida, y la respuesta sujetar 4,12, para investigar los mecanismos celulares excitabilidad neuronal subyacente.
ONTENIDO "> Aquí se describe un potente marco que permite la aplicación de una variedad de protocolos electrofisiológicos de bucle cerrado en el contexto de grabaciones de patch clamp de células enteras realizadas en rodajas de cerebro agudas. Mostramos cómo grabar voltaje de la membrana somática por medio de grabaciones de patch clamp en las neuronas piramidales de la corteza somatosensorial de ratas jóvenes y aplicar tres protocolos de bucle cerrado diferentes utilizando LCG, una caja de herramientas de software basado en línea de comandos desarrollado en el laboratorio de Neurobiología y Teórica Neuroingeniería.En pocas palabras, los protocolos descritos son, en primer lugar de la inyección automática de una serie de formas de onda de estímulo pinza actuales, relevantes para la caracterización de un gran conjunto de propiedades de la membrana activa y pasiva. Estos se han sugerido para capturar el fenotipo electrofisiológico de una célula en términos de sus propiedades de respuesta a una serie de patrón de formas de onda de estímulo. Conocido como el código e de una célula (por ejemplo, ver & #160; 13,14), una colección de respuestas eléctricas tales es utilizado por varios laboratorios para clasificar objetivamente neuronas sobre la base de sus propiedades eléctricas. Esto incluye el análisis de la relación de transferencia estacionaria de entrada-salida (curva fI), por una técnica innovadora que implica la de lazo cerrado, el control en tiempo real del tipo de cocción por medio de un controlador proporcional-integral-derivativo (PID) , segundo la recreación de realista vivo -como la actividad sináptica en el fondo en preparaciones in vitro 10 y tercero, la conexión artificial en tiempo real de dos neuronas piramidales registradas simultáneamente por medio de un interneuron virtual GABAérgicas, que se simula por el ordenador.
Además, LCG implementa la técnica conocida como activo de electrodo de Compensación (AEC) 15, que permite la aplicación de protocolos de sujeción dinámicos utilizando un solo electrodo. Esto permite compensar los efectos no deseados (unartifacts) del electrodo de registro que surgen cuando se usa para la entrega de estímulos intracelulares. El método se basa en una estimación no paramétrica de las propiedades eléctricas equivalentes del circuito de grabación.
Las técnicas y los protocolos experimentales descritas en el presente documento pueden aplicarse fácilmente en el voltaje de circuito abierto convencional y experimentos corriente con la pinza y se puede extender a otras preparaciones, como extracelular 4,16 o grabaciones intracelulares in vivo 17,18. El montaje cuidadoso de la configuración de la electrofisiología de pinzamiento zonal de célula completa es un paso muy importante para, grabaciones estables de alta calidad. En lo que sigue se supone que una instalación como experimental ya está disponible para el experimentador, y centramos nuestra atención en describir el uso de LCG. El lector se refirió a 19-22 para obtener consejos adicionales acerca de la optimización y depuración.
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Protocol
El protocolo descrito aquí cumple con las recomendaciones y directrices de la Comisión de Ética del Departamento de Ciencias Biomédicas de la Universidad de Amberes. Este protocolo requiere la preparación de material no sensible desde el cerebro de ratas Wistar explantado juveniles, obtenido por técnicas de eutanasia humanitaria aprobados.
1. Preparación del equipo
- Instalar y configurar la adquisición de datos y sistema de estimulación.
- Utilice un ordenador personal (PC) equipado con una adquisición de datos (DAQ) tarjeta apoyado por Comedi para grabar y enviar señales de voltajes de control analógicos al amplificador electrofisiológico.
NOTA: Comedi es un módulo de Linux y la biblioteca que soporta una gran cantidad de tarjetas DAQ de los fabricantes más comunes: visite http://www.comedi.org para más información. - En el caso de un amplificador de patch clamp controlado por ordenador está en uso, emplear un segundo PC, además de la dedicada al amplificadorcontrol.
NOTA: Si bien este último puede ejecutar un sistema operativo convencional, el PC adicional será operativo en tiempo real por medio de un sistema operativo especial. En estas condiciones, es conveniente utilizar un solo monitor, ratón y teclado conectado a la PC adicional, mientras se conecta por una aplicación de escritorio remoto a la PC dedicado. - Descargue la imagen ISO del Live CD que contiene un sistema operativo Linux en tiempo real con LCG preinstalado de http://www.tnb.ua.ac.be/software/LCG_Live_CD.iso y grabarlo en un CD o memoria USB en blanco " .
- Basta con insertar el CD en la unidad de la PC que contiene la tarjeta de adquisición de datos y ponerlo en marcha. Alternativamente, instale LCG desde su repositorio de fuentes en línea en un PC con el sistema operativo Linux (por ejemplo, Debian o Ubuntu). Consulte el manual en línea para obtener detalles sobre el procedimiento de instalación. El manual está disponible en línea en http://danielelinaro.github.io/dynclamp/lcg_manual.pdf.
- Arrancar desde el CD en vivo: this se cargará automáticamente un sistema totalmente configurado. Para ello, coloque el Live CD LCG en la unidad de CD-ROM del equipo e inicie el ordenador desde el CD; seleccionar el kernel de tiempo real (opción por defecto) tan pronto como aparezca el menú de inicio y esperar a que el sistema se inicie.
- Calibrar la tarjeta de adquisición de datos escribiendo en el símbolo del sistema:
sudo comedi_calibrate
o
sudo comedi_soft_calibrate
dependiendo de si la placa de adquisición de datos compatible con el hardware o software de calibración, respectivamente (utilice el comando sudo comedi_board_info para obtener información sobre el tablero). - Ajuste el analógico-digital y digital-analógico factores de conversión apropiado: esto requiere tener acceso al manual del amplificador electrofisiológico celular, y en particular a sus especificaciones en sus factores de conversión.
- Utilice un editor de texto para especificar los valores numéricos correspondientes en el /home/user/.lcg-env archivo, por las variables de entorno AI_CONVERSION_FACTOR_CC, AI_CONVERSION_FACTOR_VC, AO_CONVERSION_FACTOR_CC, AO_CONVERSION_FACTOR_VC.
NOTA: Estos representan la entrada (AI) y de salida (AO) ganancias para pinza de corriente (CC) y la fijación de voltaje (VC) modos, y los factores de conversión entre los comandos de voltaje que proporciona el equipo y la corriente o tensiones generadas por el amplificador , respectivamente. - Como alternativa, utilice el script LCG proporcionado (DE FIND-conversión-factores LCG), para encontrar los factores de conversión de su sistema.
NOTA: Los valores calculados por lcg-encuentra-conversión-factores son conjeturas, que en algunos casos se requieren para ser numéricamente truncado o redondeadas para reflejar los valores exactos de los factores de conversión. - Para utilizar lcg-find-conversión-factores, comience por la conexión de la 'célula de modelo "que a menudo se compra con el amplificador con el cabezal de la platina correspondiente. A continuación, abra un terminal en la máquina Linux en el que está ejecutando el Live CD e introduzca el siguiente comando en el intérprete de comandos:
lcg-encontrar-conversión-factores -i $ HOME / .lcg-env -o $ HOME / .lcg-env
NOTA: En ambos casos (es decir, la modificación manual de /home/user/.lcg-env o uso de LCG-find-conversión-factores), cerrar y abrir el terminal para que los cambios surtan efecto. - Si se utilizan varios cabezales, establecer los factores de conversión a los mismos valores en todos los canales; si eso no es posible, consulte el manual en línea LCG a entender cómo usar múltiples factores de conversión en lcg-estímulo o cómo producir archivos de configuración que mejor se adapten a las necesidades del usuario.
- Utilice un ordenador personal (PC) equipado con una adquisición de datos (DAQ) tarjeta apoyado por Comedi para grabar y enviar señales de voltajes de control analógicos al amplificador electrofisiológico.
2. Preparación de aguda rebanadas de cerebro de la corteza somatosensorial
- Preparación de soluciones para electrofisiología.
- Preparar Fluid Artificial Cerebro-espinal (ACSF) mezclando (en mM) 125 NaCl, 2,5 KCl, 1,25 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO 3, 25 glucosa, 2 CaCl 2, y 1 de MgCl 2. Preparar 10x soluciones madre para reducir eltiempo de preparación en el día del experimento. Preparar 2 L, de los cuales uno se utilizarán para la preparación de las rodajas y el otro para la grabación.
- Saturar la ACSF con 95% O 2 y 5% de CO 2 durante al menos 30 min antes del comienzo del procedimiento.
- Para clamp grabaciones actuales, utilice una solución intracelular (ICS) que contiene (en mM) 115 K-gluconato, 20 KCl, 10 HEPES, 4 ATP-Mg, Na 0,3 2 -GTP, 10 Na 2 -phosphocreatine. Preparar la solución en hielo y filtrar antes del comienzo de las grabaciones para eliminar el riesgo de obstrucción de la pipeta.
- Extracción del cerebro.
- Anestesiar al animal de colocar al animal en una cámara de inducción con 4% de isoflurano y rápidamente decapitar usando una guillotina o grandes tijeras.
- Cortar la piel a lo largo de la línea media y deslícelo a los oídos.
- El uso de un buen par de tijeras de cortar el cráneo a lo largo de la línea media. Mantenga la cuchilla lo más cerca posible a the superficie con el fin de minimizar el daño al cerebro subyacente. Abra el cráneo con un par de pinzas, use una espátula para cortar el nervio óptico y el tronco cerebral y suavemente caer el cerebro en ACSF helada.
- Separar el cerebelo y los dos hemisferios con un bisturí (hoja de 24).
- Retire el exceso de agua de uno de los dos hemisferios y péguelo en una plataforma inclinada utilizando una gota de pegamento. Añadir rápidamente unas pocas gotas de ACSF sobre el cerebro y la transfiere a la cámara de vibratome.
NOTA: En la preparación de cortes sagitales, el ángulo de la plataforma es importante para evitar daños en las dendritas de células piramidales durante el procedimiento de corte.
- Preparación de las rebanadas.
- Coloque la cuchilla sobre el cerebro y deseche la primera 2,5-3 mm. Ajustar la velocidad y la frecuencia para limitar los daños a la superficie de la rebanada mientras que al mismo tiempo reducir al mínimo el tiempo requerido para el procedimiento de corte.
- Ajuste el espesor de 300 μm y comenzar el corte en lonchas. Una vez que la cuchilla ha ido más allá de la corteza, utilizar una hoja de afeitar o una aguja doblada para cortar por encima de la hipocampo y en los bordes de la zona cortical de interés.
- Coloque las rodajas en una cámara de incubación de múltiples pozos mantienen a 32-34 ° C.
- Retirar la hoja y repetir los puntos 2.3.2 y 2.3.3 hasta 5 - se cortan 8 rebanadas. Los mejores rodajas son generalmente aquellos en los que los vasos sanguíneos son paralelas a la superficie.
- Incubar las rebanadas de 30 min después de la última rebanada se coloca en la cámara.
3. patch-clamp grabaciones de Capa 5 piramidales Neuronas
- Coloca una rebanada en la cámara de la grabación y la búsqueda de las células sanas. Estas células generalmente tienen menor contraste, un aspecto liso y no están hinchados.
- Inspeccionar la rebanada bajo el microscopio con la lente de aumento de 40X y la búsqueda de células en la capa 5, que se encuentra aproximadamente 600 a 1000 micras desde la superficie del cerebro. Una vez que se encuentra una célula adecuada, la carga de un tercio de la micropipeta con ICS y colocarlo en el cabezal de la platina.
- En el ordenador personal que ejecuta el Live CD o el sistema operativo preconfigurado Linux, lanzar un shell de comandos (por ejemplo, bash) y en su sistema, escriba el comando lcg-cero. Esto asegura que la tarjeta DAQ no está conduciendo el amplificador.
- Aplicar 30 - 50 mbar de presión positiva presionando sobre el émbolo de una jeringa común, conectada por un tubo a la titular de la pipeta y, con la ayuda del microscopio, coloque la pipeta aproximadamente 100 m por encima de la rebanada.
NOTA: Colocar la pipeta en una posición que permite una ruta directa a la célula diana, preferiblemente utilizando el modo de enfoque de la micromanipulador. - Actuando sobre los controles del amplificador electrofisiología, ajustar el desplazamiento de la pipeta y la salida de un impulso de prueba (10 mV) en el modo de fijación de voltaje.
- Reducir la presión a 10 a 30 mbar (dependiendo del tamaño de la pipeta) mediante la retirada de lapistón de la jeringa; acercarse suavemente la célula y comprobar para la formación de un hoyuelo mediante la observación de la imagen en la pantalla de la cámara de vídeo. Supervisar el impulso de prueba para un aumento de la resistencia en todo momento, al ver la forma de onda mostrada en el osciloscopio conectado al amplificador de electrofisiología (alternativamente se puede utilizar el lcg-seal-test de comandos para controlar la resistencia de la pipeta).
- Suelte la presión y si es necesario aplicar presión negativa suave a la pipeta para ayudar a la formación de sello cuando usted nota un aumento en la resistencia de la pipeta y la formación de un "hoyuelo" en la celda.
- Mientras que las formas de foca, disminuir gradualmente el potencial de mantenimiento de -70 mV.
- Una vez que se ha obtenido un sello gigaohmio, asegúrese de que la corriente de mantenimiento es de entre 0 - 30 pA. Aplicar pulsos cortos de presión negativa (succión) para romper la membrana y establecer la configuración de célula completa. Alternativamente, se puede inyectar impulsos fuertes y breves de tensión (
- Cambiar a modo de pinza de corriente y verifique que el potencial de membrana en reposo es típico de una célula sana. Para las neuronas piramidales corticales utilizando una solución basada potasio-gluconato-, este valor es por lo general entre -65 y -75 mV.
4. Caracterización semiautomática de Propiedades respuesta eléctrica de una neurona
- Crear un directorio para almacenar los datos del usuario. Con el fin de hacer esto al servicio de un script incluido en el LCG vivo CD que crea carpetas según la fecha. Para utilizarlo, escriba en el símbolo del sistema
cd ~ / experimentos
lcg-crear-experimento de la carpeta -s psp, in_vivo_like
Esto creará una carpeta donde se guardarán los datos de esa célula (y un 'psp' y 'in_vivo_like' subcarpetas) y se imprimirá su nombre a la terminalventana; También es posible almacenar información adicional, como la resistencia de la pipeta y el tipo de células usando este script. - Cambie el directorio a la carpeta recién creada con el comando
cd ~ / <carpeta>
El nombre de la carpeta es la que muestra el comando lcg-create-experimento de la carpeta y contará con la indicación de la hora del día actual (es decir, el año-mes-día), como en 20140331A01. - Asegúrese de que el amplificador está configurado para funcionar en modo de pinza de corriente, de que los cables están conectados y el comando de tensión externa del amplificador, si está presente, está habilitada.
- Introduzca el comando lcg-ecodeat el símbolo del sistema. Esto requiere una serie de comandos (es decir, lcg-ap, lcg-vi, lcg-rampa, lcg-tau y LCG-pasos), que se utiliza para caracterizar las propiedades de respuesta básicas de la célula. lcg-ECODE requiere que el usuario especifique dos parámetros: la amplitud de la 1 ms-largo pulso de corriente utilizada para obtener un solo pico en la célula, y la amplitud máxima de la memoria RAM actualp inyecta en la célula para encontrar su reobase.
Utilice la siguiente sintaxis del comando:
lcg-ECODE --pulse amplitud X --ramp amplitud Y
con una elección de los valores X e Y (en Pa) que son suficientes para hacer que el fuego celular en respuesta a un 1 ms-pulso largo y una inyección sostenida de corriente, respectivamente.
NOTA: Estos protocolos requieren realizar la estimación numérica de la 'kernel electrodo' con el fin de utilizar la Compensación del electrodo activo (AEC) 15. Una inyección de corriente ruidosa se utiliza para estimar el núcleo y se pide al usuario que confirme el número de muestras que componen el núcleo. Ver 15 para obtener información detallada sobre el significado del núcleo del electrodo y la forma de elegir el número de muestras del núcleo.
5. La inyección de conductancia a través simulados sinapsis y Simulación de En Vivo -como Antecedentes Actividad
- La inyección de los potenciales postsinápticos excitatorios simulados
- Cambie al directorio en el que se ahorrará el siguiente experimento, escribiendo el comando siguiente en el símbolo del sistema del shell:
psp cd / 01 - Copiar un archivo de configuración LCG al directorio actual y abrirlo con un editor de texto (Nano en este ejemplo), escriba los siguientes comandos en el símbolo del sistema del shell (este archivo de configuración ejemplo se incluye en el código fuente y el live cd) :
cp ~ / local / src / lcg / configuraciones / epsp.xml
nano epsp.xml
NOTA: Esto es simplemente un archivo de texto con diferentes entidades conectadas entre sí. Para más detalles ver la sección de Resultados Representante. - Si es necesario editar el inputChannel, outputChannel, el inputConversionFactor y la outputConversionFactor en este archivo para que coincida con la configuración del usuario.
- Calcule el núcleo del electrodo necesario para realizar la compensación de electrodo activo 'el método utilizado por LCG para realizar solo electrodo pinza dinámica "mediante la emisión de la command
lcg-kernel
Esto le pedirá el número de puntos en el kernel. Una vez más, seleccione un número para que el núcleo del electrodo cubre el extremo de la cola de decaimiento exponencial. - Lleve a cabo el experimento de pinza dinámico utilizando el comando
lcg-experimentar epsp.xml -c - Enumerar los archivos y visualizar los resultados utilizando el comando
ls -l
lcg-trama-archivo -f última
- Cambie al directorio en el que se ahorrará el siguiente experimento, escribiendo el comando siguiente en el símbolo del sistema del shell:
- La inyección de los potenciales postsinápticos inhibitorios simulados
- Crear una carpeta y copiar el archivo epsp.xml a él escribiendo los siguientes comandos en el símbolo del sistema del shell:
mkdir ../02
cp epsp.xml ../02/ipsp.xml
cd ../02 - Edite el archivo de configuración con un editor de texto: cambiar el potencial de inversión sináptica y subir y tiempo de decaimiento constantes del Exp2Synapse modelo de sinapsis a lo siguiente:
parámetros>
<E> -80 </ E>
<TauRise> 0.8e-3 </ tauRise>
<TauDecay> 10e-3 </ tauDecay>
<parámetros>
Salga del editor de texto. - Calcule el núcleo del electrodo y llevar a cabo el experimento como en 5.1, escribiendo los siguientes comandos en el símbolo del sistema del shell:
lcg-kernel
lcg-experimentar ipsp.xml -c - Enumerar los archivos y visualizar los resultados, escribiendo los siguientes comandos en el símbolo del sistema del shell:
ls -l
lcg-trama-archivo -f <filename.h5>
- Crear una carpeta y copiar el archivo epsp.xml a él escribiendo los siguientes comandos en el símbolo del sistema del shell:
- Simulación de in vivo -como actividad de fondo:
- Cambie al directorio en el que desea guardar el siguiente experimento, como se indica anteriormente, escribiendo los siguientes comandos en el símbolo del sistema del shell:
cd ../../in_vivo_like/01 - Copie el archivo de configuración del directorio de origen LCG, escribiendo los siguientes comandos en el símbolo del sistema del shell:
cp ~ / local / src / lcg / configuraciones / in_vivo_like.xml
nano in_vivo_like.xml - Ajustar los parámetros de configuración DAQ para la configuración del usuario, como se describe en 5.1.3 y salga del editor.
- Calcule el núcleo del electrodo y llevar a cabo el experimento como en 5.1, escribiendo los siguientes comandos en el símbolo del sistema del shell:
lcg-kernel
lcg-experimentar in_vivo_like.xml -c -n 10 -i 3
Los interruptores '-n 10' y '3' -i indican que la estimulación se debe repetir 10 veces a intervalos de tres segundos. - Visualice las huellas primas mediante el comando siguiente en el símbolo del sistema del shell:
lcg-trama-archivo -f todo
- Cambie al directorio en el que desea guardar el siguiente experimento, como se indica anteriormente, escribiendo los siguientes comandos en el símbolo del sistema del shell:
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Representative Results
En las secciones anteriores, hemos descrito cómo utilizar la caja de herramientas de software LCG para caracterizar las propiedades electrofisiológicas de las células piramidales L5 y recrear en vivo -como la actividad sináptica en una rebanada preparación. El uso de una interfaz de línea de comandos y el protocolo semi-automatizado favorece la reproducibilidad y la eficiencia del experimento, que puede tener un gran impacto sobre la producción y la calidad de los datos producidos. Además, dado que los datos se guardan de una manera coherente, es fácil de extender el análisis a un objetivo particular. Figura 1 muestra el resultado típico de un experimento en el que las propiedades electrofisiológicas básicas de una célula usando seis protocolos distintos se han caracterizado.
Medición del potencial de acción forma y umbral (Figura 1A): un breve y fuerte pulso de despolarización se inyecta la corriente para medir el potencial de acción de forma promedio. El umbral de pico escalculado como el primer pico de la tercera derivada del potencial de acción 24. La medición de la curva de tensión-corriente (Figura 1B): sub-umbral impulsos de corriente se inyecta en la célula, permitiendo la medición de propiedades de respuesta pasivos tales como resistencia de entrada y la caracterización de sub-umbral corrientes iónicas.
La medición de la corriente mínima suficiente para provocar la cocción sostenida (Figura 1C). La rampa inyectada de corriente permite la caracterización de la célula como un tipo I o tipo II oscilador 25. Medición de la frecuencia de corriente (FI) curva (Figura 1D): la corriente inyectada es una función de la frecuencia de disparo instantáneo y se actualiza cada vez que los picos de células, utilizando el protocolo de bucle cerrado se describe en el 5. Usando esta técnica, una estimación fiable de la curva fI puede obtenerse en menos de 30 seg. Medición de la membrantiempo e constante (Figura 1E): un corto impulso de corriente de hiperpolarización se entrega para medir las propiedades de relajación pasivas de la membrana. Este impulso se ajusta entonces a un doble exponencial para calcular la membrana constante de tiempo (44 ms en este caso).
Coeficiente de adaptación y de respuesta a la despolarización de corriente (Figura 1F): dos valores supra-umbral de corriente se inyectan para medir el coeficiente de adaptación (relación entre los primeros y últimos intervalos inter-pico). La aplicación automatizada de una serie de protocolos como los descritos permite caracterizar cada célula registrada en términos de sus propiedades electrofisiológicas clave y constituye el paso básico para cualquier esfuerzo dirigido a la comparación de diferentes tipos de neuronas y su papel, tanto en la salud y la enfermedad.
Aunque LCG contiene varios scripts que implementan protocolos especializados, la mayor parte de la potencia y flexibilidad de la caja de herramientas residens en la capacidad para describir los experimentos por medio de archivos de configuración. En la Sec. 5 se describe cómo llevar a cabo la abrazadera dinámica para inyectar simulado actividad de fondo en la neurona. Aquí se introduce el concepto de archivos de configuración y entidades. Un archivo de configuración es simplemente un archivo de texto que contiene los nombres y las interconexiones de todos los bloques de construcción básicos (llamados entidades) que se requieren para llevar a cabo un experimento dado; por esta razón, el diseño de nuevos paradigmas de las entidades de conexión es una tarea relativamente fácil, ya que es compartir y reutilizar los paradigmas experimentales. En el experimento mostrado en la Figura 2, se utilizan cinco entidades:
H5Recorder: registra las entidades conectadas a un archivo comprimido. El formato de archivo HDF5 ha sido elegido ya que es apoyado por la mayoría de los lenguajes de programación como Python y MATLAB.
RealNeuron: proporciona una capa de abstracción del aspecto técnico del tiempo real reacuerdo e inyección. Contiene la información sobre la tarjeta de adquisición de datos y realiza la compensación electrodo activo en línea. Cuando un potencial de acción es detectada por cruce de umbral, la neurona real también da salida a una espiga en forma de un evento: esto se puede utilizar por ejemplo para controlar la velocidad de disparo durante el experimento o para interactuar con las sinapsis artificiales.
Poisson: genera espiga trenes siguiente una distribución exponencial con una tasa particular. La semilla de este proceso puede ser fijado de modo que los juicios se pueden reproducir de forma coherente.
SynapticConnection: recibe los picos del generador y las retransmite a la sinapsis apropiado después de un retraso dado.
Exp2Synapse: Modelo de una sinapsis exponencial doble. Contiene el potencial de inversión y el auge y decadencia constantes de tiempo.
Como se mencionó anteriormente, cada entidad está conectado a uno o más de otros to componer un experimento. En el ejemplo de la simulación de una corriente post-sináptica excitatoria descrito en la Sec. 5.1, tanto el RealNeuron y la Exp2Synapse están conectados a la H5Recorder, para guardar en el archivo voltaje de la membrana y la corriente sináptica, respectivamente. La entidad Poisson proporciona picos generados a una frecuencia de 2 Hz a la SynapticConnection, que a su vez entrega los eventos a la Exp2Synapse después de 1 ms. Finalmente, la entidad Exp2Synapse está conectado a la RealNeuron. Usando pequeñas variaciones de este archivo de configuración, como se muestra en las secciones. 5.2 y 5.3, se puede simular corrientes inhibitorias y recrear en vivo -como actividad.
En la Figura 2 se muestra cómo, por medio de una configuración de abrazadera dinámico, se puede estudiar la integración sináptica de una manera controlada mediante la simulación de la corriente inducida en una neurona por sinapsis artificiales. Figura 2A (parte superior) muestra los potenciales post-sinápticos individuales (top ) junto con el injcorrientes ejada. (Azules) trazas rojas denotan excitatorias eventos (inhibitorios). Tenga en cuenta que la corriente inyectada es una función de la tensión de la membrana y del cambio en la conductancia asociado a la activación de la sinapsis virtual.
Mediante la entrega de los trenes de Poisson pico a frecuencias más altas que las sinapsis, in vivo -como actividad de fondo puede ser simulado (Figura 2B y 2D). Incluso durante clavar cuando grandes corrientes se inyectan (trazo negro en la parte inferior de la Figura 2B), los activos garantías de compensación del electrodo que la forma de los picos no se ve afectada (Figura 2C), a pesar de que un solo electrodo se utiliza para inyectar simultáneamente actual y registrar el voltaje de la membrana. Repetición de múltiples ensayos con las mismas formas de onda de conductancia permite extender el trabajo de 23 a un marco más realista, por lo que es posible separar las contribuciones de diferente synaptic corrientes a la fiabilidad y la precisión de la sincronización pico.
La Figura 3 muestra un ejemplo sencillo de red híbrida, obtenida mediante la grabación de forma simultánea a partir de dos células piramidales inconexas y usando un interneuron GABAérgica virtual para simular una forma de inhibición disynaptic, un mecanismo generalizado de que en la corteza cerebral implica la activación de las células de Martinotti. 26, 27 Figura 3A muestra un esquema del montaje experimental: un par de reales, células piramidales inconexas (triángulos negros y rojos) está conectado artificialmente a través de un interneuronas GABAérgicas simulada, modelada como goteras neurona de integración y fuego. La sinapsis que conecta la célula piramidal presináptica de las interneuronas pantallas facilitación homosináptica corto plazo implementado de acuerdo con el modelo Tsodyks-Markram 28, mientras que la sinapsis conectar el interneuronas y la célula piramidal postsináptica es una sinapsis biexponencial con ascenso y decadencia time constantes de 1 y 10 ms, respectivamente.
Los pesos de ambas conexiones se ajustaron para tener una deflexión en el potencial de membrana postsináptica de aproximadamente 2 mV. Figura 3B y 3C muestran la respuesta de la neurona presináptica piramidal a un tren de pulsos intracelulares entregados en 90 Hz y la EPSPS correspondientes en el simulado interneuron:. los parámetros de la conexión sináptica se ajustaron a fin de tener la neurona artificial emiten un pico después de una ráfaga presináptica de 3 - 4 picos en alta frecuencia, como se informó experimentalmente 26,29 Figura 3D muestra el efecto de la inhibición en disynaptic el verdadero célula postsináptica piramidal:. 10 ensayos se superponen, en el que la neurona se estimula con congelado vivo -como actividad de fondo en similar a la descrita en la Figura 2 Nota el aumento de la fiabilidad en respuesta a los tres IPSPs inhibitorios,reflejado en la fluctuación de fase pico más pequeño después de la activación de la célula inhibitoria, como se indica por los guiones rojos por debajo de las trazas de tensión.
Figura 1. Caracterización electrofisiológica de un L5 piramidal neuronas figura salida parcheado del protocolo de código de correo de una célula piramidal típica.; cuantificaciones se realizan de forma automática y no se requiere su posterior edición. (A) Cálculo del umbral del potencial de acción (línea discontinua -50,5 mV). La línea roja es el potencial de acción de forma promedio. (B) Medición de la respuesta pasiva (parte superior) a las corrientes de hiperpolarización (abajo). (C) Respuesta a una creciente despolarizante corriente para medir la corriente reobase (123 pA). (D) frecuencia de disparo como una función de la corriente inyectada, medido utilizando un enfoque de bucle cerrado. Cada punto gris se encuentra en el par(Corriente inyectada, inversa del intervalo interspike). La curva roja es el ajuste lineal de los puntos de datos y la línea discontinua indica el reobase medido en el panel (C). (E) Medida de la membrana constante de tiempo (43,8 ms). (F) La identificación de propiedades activas básicas de la célula revela que la célula es una neurona clavar regular y que hay una adaptación mínima. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Recreación de en Vivo- como actividad utilizando pinza dinámica. (A) Simulación de excitatorio (rojo, Sec. 5.1) y inhibitoria (azul, Sec. 5.2) sinapsis, rastros grises son otras realizaciones del mismo experimento. (B ) (C) Las formas de los picos durante el experimento en (B). (D) trama de la trama de los picos generados a través de 20 ensayos muestra que la neurona puede ser extremadamente fiable y precisa en respuesta a la misma entrada como se ve en 23. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Simulación de inhibición disynaptic través de un interneuron inhibitoria simulada (A) Esquema de la configuración de la grabación:. Las pirámides negras y rojas representan un par de células piramidales reales grabadas simultáneamente. Negro y rojo indican neurona presináptica y postsináptica, respectivamente. El círculo azul representa un interneuronas GABAérgicas virtuales, contactado por la célula piramidal negro, que a su vez inhibe la célula piramidal rojo. (B) Respuesta del real neurona piramidal presináptica a un tren de pulsos entregados a una frecuencia de 90 Hz, indicada por los guiones de naranja por encima de la traza de tensión. Los guiones negros debajo de la traza de tensión indican los tiempos de los potenciales de acción fueron emitidas por la célula presináptica. (C) Respuesta de la interneuron simulado para el tren de espigas emitidas por la célula presináptica. (D)Superposición de 10 trazas de tensión registrados a partir de la célula piramidal postsináptica real en respuesta a la activación de la interneuron simulado. La célula postsináptica se estimuló con congelado vivo -como actividad de fondo en, para obtener la dinámica de tensión fiables. Los guiones rojos debajo de los rastros de tensión indican los tiempos en los que, durante los ensayos sucesivos, las neuronas postsinápticas emitidos un potencial de acción. Tenga en cuenta el aumento de la precisión después de la activación de la interneuronas, indicado por una fluctuación pico menor entre los ensayos.
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Discussion
En este texto un protocolo completo para la aplicación de tiempo real, de circuito cerrado unicelulares experimentos electrofisiológicos fue descrito, utilizando la técnica de patch clamp y una caja de herramientas de software desarrollado recientemente llamado LCG. Para optimizar la calidad de las grabaciones es crucial que la configuración de la grabación sea correctamente conectado a tierra, protegido y libre de vibraciones: esto garantiza el acceso de células enteras estable y duradera de la célula, lo que, junto con la posibilidad de automatizar secciones enteras de los protocolos de estimulación , permite la maximización de la capacidad de producción del experimento.
Dos casos en los que se puede aplicar LCG se han presentado, a saber, la caracterización de una célula en términos de sus propiedades electrofisiológicas (Figura 1), incluyendo el cálculo rápido de la relación de entrada-salida activa de una neurona, y la recreación de in vivo -como actividad en un corte de cerebro (Figura 2). Sucsolicitudes h mostraron cómo construir protocolos distintos y destacaron algunas de las características más destacadas de LCG: su interfaz de línea de comandos hace que sea adecuado para secuencias de comandos, que permite la aplicación automática de una serie de protocolos. Además, como se hizo en la Figura 1, los valores extraídos de un protocolo se pueden utilizar para los parámetros de medida de los protocolos posteriores.
Es posible controlar en tiempo real las características de orden superior de la respuesta de la célula bajo análisis (por ejemplo, su tasa de disparo instantáneo, como se muestra en la Figura 1D) y modificar en consecuencia la estimulación, por ejemplo mediante el uso de un controlador PID para calcular la corriente requerida para mantener una tasa de disparo constante o variable en el tiempo.
La implementación de protocolos de conductancia y de sujeción dinámico con LCG es sencillo y sólo requiere escribir un archivo de configuración de texto, un procedimiento que puede ser automatizado por el uso de sguiones imple. LCG incluye más de 30 entidades que pueden ser interconectados para idear nuevos protocolos experimentales. Describimos cómo utilizar LCG mediante una interfaz de línea de comandos, sin embargo, un lanzador gráfica experimento ha sido diseñado para facilitar a partir de experimentos y el cambio de los parámetros por dejar que los usuarios no experimentados combinan LCG comandos para crear sus propias interfaces gráficas.
Dos cajas de herramientas existentes ofrecen funcionalidades similares a LCG: RELACS y RTXI. El primero es tanto una plataforma para la realización de experimentos electrofisiológicos y para analizar y anotar los datos registrados. La principal diferencia entre LCG y las soluciones existentes es su interfaz de usuario basada en una línea de comandos. Las ventajas de este enfoque son varios: en primer lugar, una interfaz de línea de comandos permite la automatización de tareas estandarizadas y repetitivas mediante secuencias de comandos posiblemente complejas y en segundo lugar, permite la incorporación de pruebas experimentales en flujos de trabajo más complicados implementadasen el lenguaje de scripting de alto nivel, como Matlab o Python.
En resumen, la naturaleza modular de LCG permite ampliar el número de protocolos experimentales disponibles en dos formas: la primera y más sencilla es escribiendo archivos de configuración especiales que utilizan los objetos existentes para llevar a cabo protocolos novedosos. El segundo es mediante la implementación - usando C ++ - nuevos objetos elementales que se pueden utilizar para ampliar aún más las capacidades y características de LCG. Los ejemplos presentados en esta preocupación protocolo el estudio de células individuales en rodajas de cerebro. Sin embargo, los protocolos similares también se pueden emplear con éxito en preparaciones in vivo, para registrar tanto las señales intracelulares y extracelulares, y en preparaciones ex vivo, tales como cultivos neuronales, para grabar, por ejemplo, potenciales extracelulares a través de matrices de múltiples electrodos al tiempo que estimula en cerrado 4 bucle.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue slicer | Leica | VT-1000S | |
| Pipette puller | Sutter | P-97 | |
| Pipettes | WPI | 1B150F-4 | 1.5/0.84 mm OD/ID, with filament |
| Vibration isolation table | TMC | 20 Series | |
| Microscope | Leica | DMLFS | 40X Immersion Objective |
| Manipulators | Scientifica | PatchStar | |
| Amplifiers | Axon Instruments | MultiClamp 700B | Computer controlled |
| Data acquisition card | National Instruments | PCI-6229 | Supported by Comedi Linux Drivers |
| Desktop computer | Dell | Optiplex 7010 Tower | OS: real-time Linux |
| Oscilloscopes | Tektronix | TDS-1002 | |
| Perfusion Pump | Gibson | MINIPULS3 | Used with R4 Pump head (F117606) |
| Temperature controller | Multichannel Systems | TC02 | PH01 Perfusion Cannula |
| Manometer | Testo | 510 | Optional |
| Incubator | Memmert | WB14 | |
| NaCl | Sigma | 71376 | ACSF |
| KCl | Sigma | P9541 | ACSF, ICS |
| NaH2PO4 | Sigma | S3139 | ACSF |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | ACSF |
| CaCl2 | Sigma | C1016 | ACSF |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | ACSF |
| Glucose | Sigma | G7528 | ACSF |
| K-Gluconate | Sigma | G4500 | ICS |
| HEPES | Sigma | H3375 | ICS |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | ICS |
| Na2-GTP | Sigma | 51120 | ICS |
| Na2-Phosphocreatine | Sigma | P7936 | ICS |
References
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