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Biology

Indagare le proteine ​​prioniche-come diffusione e tossicità di utilizzare i metazoi Organismo modello Published: January 8, 2015 doi: 10.3791/52321
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Molecular Biosciences, Rice Institute for Biomedical Research, Northwestern University

Introduction

Molte malattie neurodegenerative, tra cui la malattia di Alzheimer (AD), malattia di Parkinson (PD), la sclerosi laterale amiotrofica (SLA), e le encefalopatie spongiformi trasmissibili (TSE), sono associati con le proteine ​​di aggregazione a rischio e sono, quindi, noti collettivamente come misfolding disturbi (PMD ). EST o malattie da prioni costituiscono una classe unica di PMD in che possono essere infettivi in entrambi gli esseri umani e gli animali 1. A livello molecolare, i prioni replicano reclutando e convertendo monomerico α-elica-ricchi PrP cellulari host-codificato (PrP C) nel patologico β-sheet-ricchi PrP Sc conformazione 2,3. Aggregati auto-propagazione della proteina sono stati individuati nei funghi, che condividono caratteristiche importanti con prioni mammiferi 4,5. Inoltre, prioni mammiferi sono in grado di muoversi da cellula-cellula e infettare le cellule naïve 6,7.

Mentre PMD OTHer di TSE non sono infettive, condividono un principio patogenetico comune con malattie da prioni 8,9. Sebbene le proteine ​​legate a ciascuna delle PMD non sono collegati in struttura o funzione, che tutti gli aggregati di forma tramite un processo di cristallizzazione simile chiamati nucleate o seminate polimerizzazione; inoltre semi proteici crescere reclutando i loro isoforme solubili 2,10,11. L'efficienza di auto-propagano varia in vivo, a seconda delle proprietà intrinseche della proteina, che insieme con fattori cellulari aggiuntive come chaperon molecolari fine determinano tassi di nucleazione aggregata, semina, frammentazione e diffusione 12-15. Quindi, deve esistere un equilibrio tra questi fattori, che permette la propagazione efficiente di aggregazione proteica. Questo potrebbe anche spiegare il motivo per cui solo alcuni aggregati amiloidogenici ospitano le caratteristiche di un prione, e, quindi, non tutti i PMD sono infettive. I prioni sembrano rappresentare o 'top-performer'fa ampio spettro di aggregati proteici auto-replicanti, che li rende un potente strumento per studiare PMD 8,13.

Curiosamente, la tossicità associata con aggregati correlati alla malattia ha spesso una componente autonoma non cellulare 16,17. Ciò significa che influenzano cellule vicine che non esprimono il gene corrispondente, in contrasto con un effetto strettamente cella autonoma, il che implica che solo le cellule che esprimono il gene mostra il fenotipo specifica. Ciò è stato dimostrato dal convincente espressione tessuto-specifica o abbattere delle rispettive proteine ​​in numerosi modelli di malattie neurodegenerative 18-26. Diversi meccanismi sono stati proposti come base per questo non-tossicità delle cellule autonome in PMD, compresa la fornitura di nutrienti diminuita, squilibrio nella segnalazione neuronale, glutammato, e neuroinfiammazione 16,27,28. Inoltre, un movimento prione-come aggregati malattie legate tra cellule might contribuiscono a questo aspetto 29,30. Una crescente evidenza suggerisce che le inclusioni proteiche diverse da prioni possono trasmettere dalla cella-a-cella, il che può spiegare la caratteristica diffusione della patologia osservata in molti PMD 30-36. Tuttavia, è ancora da stabilire se vi sia un chiaro nesso causale tra movimento intercellulare di proteine ​​di malattia e l'effetto tossico sulle cellule vicine. Pertanto, una migliore comprensione delle vie cellulari che sono alla base della trasmissione cellula-cellula e cellula tossicità non autonoma è necessaria ed essenziale per lo sviluppo di nuove terapie. Tuttavia, molti aspetti della prionica simile diffusione e cellulari fattori che influenzano la trasmissione da cellula a cellula proteine ​​mal ripiegate in metazoi non sono ben compresi, in particolare a livello degli organismi.

Il nematode Caenorhabditis elegans ha diversi vantaggi che forniscono il potenziale per scoprire nuove sfaccettature di prioni come spreading in metazoi 17. È trasparente, consentendo in vivo inseguimento proteine ​​di fluorescenza contrassegnati nell'organismo vivente. Inoltre, molti processi cellulari e fisiologici colpite dalla malattia sono conservati dai vermi per la salute umana, e C. elegans è anche suscettibile di una grande varietà di manipolazioni genetiche e le analisi molecolari e biochimiche 37-39. Esattamente 959 cellule somatiche formano il ermafrodita adulto con un piano di corpo semplice che ha ancora diversi tipi di tessuti diversi, tra cui muscolari, neuroni e intestino.

Per stabilire un nuovo modello di prione in C. elegans, abbiamo scelto di esprimere esogenamente il ben caratterizzato glutammina / asparagina (Q / N) ricchi di prioni NM dominio del citosolico proteina prionica Sup35 lievito, poiché non ci sono noti proteine ​​prioniche endogene in vermi 4,40. Prioni di lievito sono stati inestimabili nel chiarire i meccanismi di base della replicazione prionica 41-44. Inoltre, NM è l'abetest citosolica proteina prionica simile che ha dimostrato di ricapitolare l'intero ciclo di vita di un prione in colture cellulari di mammifero 45,46. Analogamente, quando espresso in C. elegans, il dominio prione Sup35 adottata notevolmente bene alle diverse esigenze di propagazione in cellule metazoi rispetto alle cellule di lievito, caratteristiche principali esposti di prioni biologia aggregazione 40. NM era associato con una profonda fenotipo tossica, compresa la rottura dell'integrità mitocondriale e dell'aspetto vari vescicole autofagia relative a livello cellulare, così come arresto embrionale e larvale, ritardo dello sviluppo, e un disturbo diffusa dell'ambiente ripiegamento proteico a livello organismal. Sorprendentemente, il dominio prione presenta cella cella tossicità autonome autonomo e non, che colpisce i tessuti adiacenti, in cui non è stato espresso il transgene. Inoltre, il trasporto vescicolare del dominio prione all'interno e tra celle è monitorata in tempo reale <em> in vivo 40.

Qui si descrive come esaminare prioni come la diffusione in C. elegans. Spiegheremo come monitorare il trasporto intra e intercellulare di vescicole che contengono il dominio prione con time-lapse microscopia a fluorescenza. Noi sottolineare l'uso di sensori pieghevoli tessuto-specifici e ubiquitariamente espresso ai giornalisti di stress per valutare gli effetti delle cellule cellule autonome autonome e non sul fitness cellulare. Infine, descriveremo la procedura di uno schermo recentemente eseguito genoma ampio RNA interference (RNAi) per identificare nuovi modificatori di tossicità prioni indotta. In combinazione, questi metodi possono aiutare a prendere in giro a parte percorsi genetici coinvolti nel movimento intercellulare delle proteine ​​e la loro non tossicità delle cellule autonome.

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Protocol

1. Monitoraggio transcellulare Diffusione delle proteine ​​prioniche come in vivo Time-lapse imaging

NOTA: Grow C. elegans wild-type (WT) (N2) e linee transgeniche secondo metodi standard e controllare attentamente la temperatura di coltivazione 47.

  1. Generare linee transgeniche di C. elegans esprimere la proteina prionica simile, taggati con proteina monomerica fluorescente rossa (MRFP). Guarda questo video che illustra come utilizzare microiniezione 48. Per ulteriori dettagli e metodi che descrivono come integrare queste linee extracromosomici, vedi 49.
  2. Preparare popolazioni sincronizzati da deposizione delle uova o imbianchimento secondo metodi standard 50.
    1. La sincronizzazione per la deposizione delle uova
      1. Transfer 10-20 adulti gravide su un piatto e lasciarli depongono le uova per 1 - 2 ore. Rimuovere gli adulti dalla piastra e lasciare che la progenie crescere fino all'età desiderato.
      2. <li> Sincronizzazione per sbiancamento
      1. Raccogliere una popolazione non sincronizzato di adulti gravide e candeggiare con soluzione alcalina ipoclorito (NaOH 250 mM e 1: 4 (v / v) diluizione del candeggiante commerciale in H 2 O). Lavare le uova due volte (218 g per 1 min) con tampone M9 47 (21 MMNA 2 HPO 4 · 7H 2 O, 22 mMKH 2 PO 4, 86 mMNaCl, 1 mMMgSO 4 · 7H 2 O, aggiungere dH 2 O fino a 1 L).
      2. Consentire loro di schiudono in tampone M9 con agitazione O / N a 20 ° C. Sviluppo Worm arresterà nella fase L1 in assenza di una fonte di cibo, lasciando una popolazione sincronizzato. Trasferire L1S sul fresco nematodi crescita media (NGM) piastre seminati con OP50 E. coli, batteri e lasciare che la progenie di sviluppare fino a quando il 47 di età desiderata.
  3. Preparare 2% agarosio (pastiglie in H 2 O) su un vetrino 50 come descritto.
    1. Preparare due kmvetrini croscope con nastro etichettatura posto sopra tutta la loro lunghezza da utilizzare come distanziatori. Inserire un terzo vetrino da microscopio tra loro.
    2. Sciogliere 2% agarosio in H 2 O e pipetta una goccia sul vetrino pulito.
    3. Inserire una quarta diapositiva perpendicolare agli altri tre slitte sulla cima della goccia agar. Premere delicatamente il basso per appiattire il pad allo stesso spessore del nastro di etichettatura.
    4. Lasciare asciugare per 1 minuto prima di rimuovere i distanziali e tirando delicatamente le diapositive a parte. Il pad agar si attacca a uno di loro.
  4. Deporre circa 10 ml di anestetico (levamisolo 2 mM in tampone M9) per il pad e trasferimento ~ 10 animali con un pick filo di platino. Coprire con un vetrino (~ 22 x 22 mm) e prendere le immagini entro 1 ora.
  5. In alternativa, per acquisire i filmati su un periodo di tempo più lungo o di ridurre ulteriormente la possibilità di qualsiasi movimento degli animali, utilizzare una combinazione di anestetico e tallone di immobilizzazione 51.
    1. Preparare 10% agapastiglie rosa (in tampone M9) come descritto 51 e aggiungere vermi a 3 ml soluzione standard di dimensioni nanosfere (perle di polistirene, 100 nm) più 3 ml di anestetico (levamisolo 4 mM in tampone M9). Coprire delicatamente con un vetrino. Per evitare la disidratazione, sigillare il vetrino con VALAP (miscela di uguali quantità di vaselina, lanolina e cera di paraffina).
  6. Immagine immobilizzato vermi utilizzando un microscopio confocale.
    NOTA: I risultati sono ottenuti utilizzando un Spinning disco AF confocale microscopio equipaggiato con una fotocamera EM-CCD e di un software di Microscopia Automation & Image Analysis come MetaMorph e delineano le specifiche di seguito, ma altri sistemi comparabili di imaging confocale possono anche essere utilizzati.
    1. Utilizzare l'obiettivo olio 63X o 100X / 1.4NA e posizionare il vetrino contenente vermi nel supporto microscopio.
    2. Aprire il software. Regolare potenza del laser e filtri per l'imaging MRFP. Utilizzare il laser 561 nm al 10% di potenza e delle emissioni filtro> 600 nm.
    3. Nella scheda "Salvataggio" selezionare o creare la cartella directory in cui devono essere salvati i file. Assegnare un nome al file.
    4. Nella scheda "Lunghezza d'onda", selezionare l'illuminazione adeguata e regolare l'esposizione e il guadagno. Utilizzare "YokoQuad Red" (o un'impostazione illuminazione equivalente per l'imaging MRFP) con una esposizione tra 100 e 300 msec e un guadagno telecamera tra 100 e 300, a seconda del singolo campione (valutata utilizzando l'immagine dal vivo).
    5. Nella scheda "Timelapse" selezionare "Numero di punti di tempo" = 301, "Durata" = 5 min e "Time / Intervallo" = 1 sec.
    6. Sotto la "Journals" tab selezionare Journal: "AFC SET Z HOLD" e "AFC Return to Z HOLD", Type: &# 8220; Speciale "(due volte), punto di partenza:" Inizio ora point "e" End of time point ". Questa opzione autofocus è importante per l'immagine della stessa sezione su un periodo di tempo più lungo.
    7. Quando il setup è stato fatto, premere il tasto "Acquisisci". Il video timelapse è Safed come file TIFF separati.
    8. Aprire tutti i file TIFF di una data serie storica in ImageJ. Andare su "Immagine" → "Stacks" → "Immagini Stacks". Facoltativamente, regolare la luminosità e il contrasto, aggiungere bar dimensioni, ecc esportare il filmato in "File" → "Salvo" → "AVI ..." (per un esempio, vedere Video 1 e 2 corrispondente alla figura 1).

2. Utilizzando pieghevoli Sensori e Reporters stress per Indagare cellulare autonoma e non cellule autonoma influisce sulla Proteostasis e tossicità

  1. Generare linee transgeniche che coesprimere un sensore di piegatura o stress reporter insieme con la proteina prionica simile. Per i metodi su come stabilire croci o generare linee transgeniche, vedi 48,49,52. Vedere la Tabella 1 per un elenco di C. ceppi elegans che possono essere utilizzati.
  2. Preparare popolazioni sincronizzate di animali transgenici e di farle crescere fino all'età desiderata come descritto in precedenza (punto 1.2) 50.
  3. Utilizzando uno stereomicroscopio, esaminare il relativo fenotipo del sensore di piegatura o stress giornalista.
    1. Per il sensore di piegatura, determinare il numero di animali ospitano aggregati di ciascun giorno dopo la sincronizzazione (per esempio, vedere la Figura 2E e F).
    2. Per il giornalista stress, prova se la coespressione dei risultati proteina prionica simile a un aumento di fluorescenza del reporter (per esempio, vedere la Figura 3).

3. Schermo Genome-wide per soppressione di tossicità Prion-indotta in C. elegans

Figura 4
Figura 4. Rappresentazione schematica del protocollo di screening RNAi. Vedere sezione Protocollo 3 per una descrizione dettagliata delle singole fasi.

  1. Sincronizzazione di C. worm elegans e duplicazione di biblioteca RNAi
    1. Per lo schermo RNAi, utilizzare la libreria Ahringer RNAi (o la libreria Vidal RNAi) 53,54. Rearray biblioteca RNAi dall'originale 384 format e in 96 pozzetti riempiendo le piastre con 100 microlitri LB-amp media (50 mg / ml ampicillina in LB) integrati con il 10% di glicerolo e inoculare con un replicatore 96-pin. Coltivare a 37 ° CO / N con agitazione e conservare a -80 ° C.
    2. Mantenere C. elegans WT e linee transgeniche a 20 ° C su NGM piastre seminate con OP50 E. coli secondo metodi standard 47.
    3. Sincronizzare transgenici dominio prione e WT (controllo) nematodi sbiancamento (vedi sezione 1.2).
    4. Lo stesso giorno che i vermi sono sbiancati, preparare mezzi LB integrato con 50 mg / ml di ampicillina. Utilizzare un distributore automatico di reagente per erogare (o pipetta manuale) 65 l di media LB-amp in tutti i pozzetti di una piastra ben 96.
    5. Rimuovere 96 e piastre di libreria Ahringer RNAi da -80 ° C e portarli ad una cappa sterile, foderato con carta da cucina. Rimuovere immediatamente la guarnizione nastro tenendo la piastra capovolta mentre piastre sono ancora congelati, avendo cura di evitare la contaminazione da ghiaccio sulla parte esterna delle piastre. Reinvert i piatti e lasciarli scongelare per circa 30 min.
    6. Immergere una sterile 96 pin replicatore in un RNAi piatto biblioteca, e poi in una nuova piastra LB-amp. Utilizzare un replicatore fresca sterile per ogni piatto. Sigillare tutti i piatti con adesivo nastro di alluminio e restituire le piastre di libreria a -80 ° C. I replicatori possono essere immersi in candeggina, risciacquati,e sterilizzati in autoclave per essere usato di nuovo.
    7. Lasciare piastre RNAi duplicati di crescere O / N in un incubatore a 37 ° C e 300 rpm. Per utilizzare HT115 E. coli batteri ospitanti il vettore vuoto (L4440) come controllo, crescono separatamente in una provetta di coltura e quindi pipettare 65 ml di coltura con una pipetta multicanale in un quarto dei due piastre da 96 pozzetti.
  2. Induzione della produzione dsRNA batterica e l'aggiunta di vermi
    1. Diluire isopropil-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) ad una concentrazione di 5 mM in DDH 2 O. Utilizzare una workstation automatizzata con una testa multicanale per erogare (o pipetta manuale) 10 ml di IPTG diluito in tutti i pozzetti dei batteri RNAi e le piastre di controllo. Richiudere e posizionare le piastre di nuovo nel incubatore. Lasciate che agitare per 3 ore a 37 ° C.
    2. Mentre i batteri sono agitazione, preparare i vermi. Mescolare la / sospensioni verme M9 bene, e pipetta un piccolo campione (~ 5-10 microlitri) di un vetrino da microscopio in vetro. Contareil numero di vermi allo stereomicroscopio e calcolare il numero di worm per ml.
    3. Usando una tecnica sterile, preparare una soluzione integrata M9 (M9 +) con le seguenti concentrazioni finali: 0.20 mg / ml IPTG, 8,0 mg / Colesterolo ml, 50 ug / ml ampicillina, 9,6 ug / ml tetraciclina, 0,0835 mg / ml Fungizone, e 15 vermi per 50 ml.
      1. Fai soluzioni separate per transgenici dominio prioni e vermi WT. Il volume finale della soluzione verme M9 + necessario dipenderà dal numero di piastre RNAi copiati (vedi sotto), oltre a ~ 30 ml di volume morto che rimarrà nel serbatoio, se viene utilizzato un distributore automatico.
    4. Dopo l'induzione 3 ore di produzione dsRNA batterica, prendere i piatti fuori dell'incubatore e lasciarli raffreddare a RT (~ 30 min) per evitare il calore stress agli animali.
    5. Pipettare 50 microlitri dominio prionica soluzione verme transgenico M9 + a ciascun pozzetto di piastre RNAi e una delle piastre di controllo vettoriale vuoti. FareAssicurarsi di miscelare la soluzione verme prima ogni passo come gli animali tendono a sedimentare sul fondo del serbatoio.
    6. Dispensare vermi WT nella seconda piastra di controllo. Lasciare le piastre non sigillati per consentire l'aerazione. Per mantenere la coltura liquida di evaporare, impilare 4 - 5 piatti insieme e avvolgere con un tovagliolo di carta umido e un foglio di alluminio. Incubare a 200 rpm a 20 ° C per 4 giorni.
  3. Punteggio
    NOTA: Dopo 4 giorni in incubatrice, i vermi saranno al secondo giorno di età adulta e sono pronti a schermo. Lasciate che gli animali si abituano a condizioni non si stringono per 30 minuti prima di screening per assicurare botte indisturbati.
    1. Usando una telecamera Falcon 4M60 collegata a un computer con un monitor, schermo visivo per una maggiore botte rispetto di controllo trattati dominio prioni animali transgenici.
    2. Compilare un elenco di visite preliminari per confermare con wrMTrck (vedere la sezione successiva).

4. Conferma di preliminareHits schermo

  1. Motilità test su lastre solide
    1. Preparare piatti con NGM integrati con 100 mg / ml di ampicillina, 12,5 mcg / ml tetraciclina e 1 mM IPTG, secondo metodi standard 47. Se possibile, utilizzare una macchina-piatto versando per assicurare tutte le lastre hanno la stessa altezza dei media, che consentirà un processo di acquisizione di video più snello.
    2. Grow diversi cloni RNAi in ~ 1 ml LB + 50 ug / ml ampicillina, O / N a 37 ° C e 250 rpm.
    3. Il giorno successivo, indurre l'espressione del dsRNA con 1 mM IPTG per 3 ore. Seed le piastre con 150 ml di ogni clone batterico RNAi, si sviluppa in uno strato sottile. Lasciate che i batteri a secco per 2 giorni a temperatura ambiente al buio. Preparare 3 piastre per RNAi clone.
    4. Sincronizzare la popolazione verme sbiancando secondo metodi standard 50 (vedere paragrafo 1.2), e lasciare che le uova si schiudono O / N in M9 media.
    5. Prelevare un campione della sospensione senza fine e determinare la quantità di nematodes per microlitri al stereomicroscopio. Poi, pipetta la quantità corretta di M9 più vermi in ogni piatto sperimentale in modo che contenga 25-30 vermi L1. Crescere i nematodi a 20 ° C per 4 giorni, fino a raggiungere i vermi giorno 2 di età adulta.
  2. L'analisi quantitativa del verme motilità con il plugin wrMTrck per ImageJ
    NOTA: I video sono stati registrati usando uno stereomicroscopio a 10X di ingrandimento con un Hamamatsu Orca-R2 fotocamera digitale C10600-10B e il software di imaging PCI Simple Hamamatsu.
    1. Accendere la fotocamera e il software semplice di imaging PCI. Clicca su "Live" per consentire la regolazione delle condizioni di imaging.
    2. Impostare le condizioni video come segue: Guadagno = 0; Light Mode = Alta; Velocità Index = 1; Binning = 2. Fare clic su "Auto Exposé" e quindi regolare le condizioni di luce, spostando gli specchi microscopio e di luminosità e contrasto quadranti.
      NOTA: Il video deve avere un alto contrasto senza essere Sovraesposed, in modo che gli animali appaiono come figure nere su sfondo luminoso.
    3. Clicca su "Time Scan" e scegliere una cartella e un nome di file. Impostare "Campo Delay" a 20 msec e "Stop a Time" per 30 sec. Premere "Live Review" per scegliere la zona della piastra di registrazione (dove la maggior parte vermi). Toccare la piastra 3 o 4 volte sul palco, subito confermare la sua posizione nel campo della visualizzazione e premere "Start".
    4. Dopo il film termina la registrazione, fate clic destro sull'immagine e scegliere "Esporta Montage Sequence" per esportare il filmato da un formato ad un .cxd .avi.
  3. Analizzando i video motilità
    1. Aprire il software ImageJ, vai alla scheda "Plugins", poi "wrmtrck" e selezionare "Batch wrMTrck". Selezionare la directory contenente tutti i file da analizzare.
    2. Nella finestra di immissione principale wrMTrck_Batch, caricare i valori di input, come specificato nel Figure 5C. Spiegazione per ciascuno dei parametri si trovano nelle istruzioni che accompagnano il plugin. Fare clic su "OK" e consentire l'esecuzione di analisi del movimento.
    3. Per curare i risultati e confermare che tutte le tracce rilevate sono da vera C. elegans ed eliminare artefatti, aprire tutti i file .txt creati per ogni film e copiare le informazioni in un file di software di analisi dei dati. Aprire le "* _labels.zip" i file creati ed eseguire il conseguente "* _labels.tif" per controllare manualmente ed eliminare le tracce di vermi falsi.

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Representative Results

Monitoraggio intercellulare diffusione di proteine ​​prioniche come in vivo time-lapse imaging

Transgenici C. Linee elegans esprimono il dominio prione sono particolarmente adatti per l'analisi di alcuni aspetti di proteine ​​prioniche come, ad esempio, la trasmissione di cellule-cellula e cellula non tossicità autonomo. La trasparenza degli animali consente il monitoraggio di fluorescente contrassegnati proteine ​​dall'interno dell'organismo vivente in ogni fase della vita. Approfittando di questo, il movimento delle proteine ​​prioniche come attraverso cellule e tessuti utilizzando un microscopio a fluorescenza vengono visualizzati. Un obiettivo olio 63X o 100X / 1.4NA è necessario per risolvere le strutture vescicolari. È importante sottolineare che il dominio prione deve essere etichettato con MRFP, per rimanere fluorescente visibile all'interno di queste vescicole acide presumibilmente 40. Proteina fluorescente gialla (YFP), che viene spesso utilizzato come un tag, is non adatto perché si spegne in un ambiente a basso pH 40,55. Strain AM815 esprime RFP-tagged R2E2 (una forma altamente aggregazione incline e tossiche del dominio prione NM) che si accumula in vescicole tubolari, mentre il tag RFP solo rimane solubile (Figure 1A e B). Usando imaging in vivo time-lapse, si potrebbe osservare che queste vescicole tubolari sono trasportati all'interno e tra le celle 40 (Figura 1C e D, Video 1 e 2) [posto collegamenti a video 1 e 2 qui].

Utilizzando sensori pieghevoli e giornalisti di stress per studiare gli effetti delle cellule autonome autonome e non-cellulari su proteostasis e tossicità

I prioni sono in grado di attraversare proteine ​​correlate sementi e disturbare l'ambiente ripiegamento delle proteine ​​cellulari. Questo può essere rivelata attraverso la coespressione di adeguato senso pieghevolers. Sensori pieghevoli sono proteine ​​metastabili non essenziali che dipendono una rete proteostasis funzionale piegare correttamente. Alcuni esempi sono il ben noto luciferasi lucciola e le proteine ​​che ospitano sensibili alla temperatura (ts) mutazioni 56-66. Un'interruzione di proteostasis conduce misfolding del reporter, che può essere rilevata da esame visivo di aggregati o dall'esposizione del rispettivo fenotipo mutante ts a temperature permissive. Tratti di polyglutamine (polyQ) con una lunghezza sulla soglia di aggregazione (circa 40 residui) sono spesso usati perché presentano un'aggregazione età-dipendente 67-69. Esordio più precoce di aggregazione rivela un ambiente piegatura compromesso. Qui, abbiamo impiegato un mutante prione RΔ2-5 che rimane solubile quando espresso in C. elegans muscolo parete del corpo cellule (BWM) e dell'intestino 40 (Figura 2A e C). Su espressione simultanea con R2E2 in cellule BWM, RΔ2-5 reaaggregati dily (Figura 2B), rivelando una cella effetto autonoma R2E2 sull'ambiente ripiegamento delle proteine. L'effetto capillare sul proteostasis e induzione di misfolding tutti tessuti può essere valutata mediante espressione del sensore di piegatura in un tessuto distinta che non esprime la forma altamente aggregazione inclini del dominio prione. R2E2 è stato espresso in un promotore specifico di cellule BWM (mio-3p), mentre RΔ2-5 è stato espresso in un promotore specifico-intestinale (VHA-6p). Aggregazione di RΔ2-5 intestinale dimostra che R2E2 colpisce il ripiegamento delle proteine ​​in maniera autonoma non cella 40 (Figura 2D). Invece di utilizzare RΔ2-5, in cui gli aggregati possono essere rilevati solo ad alta risoluzione, l'uso di polyQ44 espressa nell'intestino (Q44i) permette la visualizzazione di aggregati a bassa risoluzione allo stereomicroscopio (Figura 2E e F). Inoltre, questo permette una quantificazione di animals con aggregati, nonché una quantificazione del numero di aggregati.

Per indagare cella tossicità non autonoma del dominio prione, abbiamo esaminato tessuti che non esprimono R2E2 mediante microscopia elettronica confinante verificando che l'espressione del dominio prione in cellule muscolari porta ad una cella interruzione non autonomo dell'integrità mitocondriale in tessuti adiacenti, quali come l'intestino 40. Risultati disfunzione mitocondriale in aumento specie reattive dell'ossigeno (ROS) e lo stress ossidativo. Un modo non invasivo per visualizzare l'induzione della risposta allo stress ossidativo è quello di utilizzare uno stress ossidativo giornalista inducibile 70. Il ceppo CF1553 esprime la proteina verde fluorescente (GFP) sotto il stress ossidativo promotore inducibile sod-3 70. Quando attraversato agli animali che esprimono il dominio prione R2E2 nelle cellule BWM, il reporter è stato significativamente upregulated in cellule BWM così come in numerosi tessuti non BWM ( La tabella 1 fornisce una lista di C. elegans ceppi esprimendo sensori pieghevoli e giornalisti di stress che possono essere utilizzati in modo analogo.

Schermo genome-wide per la soppressione della tossicità prioni indotta in C. elegans

La tossicità fenotipo complesso del dominio prione espresso in C. elegans è particolarmente interessante per la mancanza di tossicità discernibile osservato in più modelli in vitro 71 prioni. Questo modello potrebbe rivelare nuovi percorsi che possono influenzare la tossicità associata a prioni in metazoi. Per risolvere questo problema, abbiamo proiettato per geni che, quando RNAi-esaurita, migliorerebbero il difetto motilità degli R2E2 animali transgenici. Controllo trattati WT vermi possono essere usati come co positivantrol, anche se la maggior parte dei geni candidati non fornirà un completo salvataggio movimento fenotipo, a causa della penetranza RNAi variabile e l'elevata tossicità del transgene. Gli animali sono stati trattati per 4 giorni con RNAi, dal primo L1 stato di larva al giorno 2 di età adulta. A quel punto, la botte di animali R2E2 non trattati è molto più lento rispetto alla botte di animali WT, il che è importante perché stiamo screening per un miglioramento della motilità. F1 progenie sarà presente (~ L1S), ma è facile distinguere dalla generazione P0. Soltanto la generazione P0 è segnata. Questa schermata iniziale è visivo e non quantitativa e quindi, una soglia bassa è stato utilizzato per identificare colpi preliminari, il che significa che ogni clone RNAi batterica che sembrava aumentare la batosta di animali-prioni esprimono stato rianalizzato in un test di scansione quantitativa. Figura 4 delinea il principali passi della configurazione dello schermo. L'alta risoluzione della fotocamera Falcon 4M60 permesso una proiezione visiva di un Quarter della piastra alla volta su uno schermo di computer, che ha permesso la schermata da completare in modo più efficiente. Mentre utile, questo non è necessario. L'esame visivo del verme botte può essere eseguita anche mediante uno stereoscopio a basso ingrandimento (10X).

Conferma di visite preliminari schermo

Schermi High Throughput vengono eseguite come un approccio che consente effetti ampie analisi del genoma per ottenere un elenco primario di geni candidati che possono essere raffinati con metodi complementari. Convalida dei risultati dello schermo è quindi essenziale per eliminare eventuali falsi positivi, che potrebbero derivare dal compiere uno schermo con un solo campione sperimentale per RNAi. R2E2 animali transgenici sono stati alimentati con i cloni RNAi di colpi primarie e misurato la loro velocità su piastre NGM il secondo giorno di età adulta, come una lettura quantificabile di motilità e diminuito la tossicità. Abbiamo usato il plugin wrMTrck per ImageJ, sviluppato nel nostrodi laboratorio, che identifica con precisione C. elegans in video e segue il loro movimento. Il plugin wrMTrck e script per l'analisi automatizzata sono open-source e disponibile al pubblico a http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html, con istruzioni dettagliate su come usarlo. Dopo aver scaricato, copiare l'intera cartella wrMTrck nella cartella Plugins di ImageJ. Questo protocollo descrive il metodo wrMTrck_Batch, preferito per l'analisi di un gran numero di video alla volta, ma le istruzioni per un manuale, film di film, di analisi sono disponibili con il plugin download. WrMTrck_Batch converte un video originale (Figura 5A) in un formato binario con sfondo sottrazione e ogni vite senza fine viene assegnata una traccia. Ciascuno dei video trasformati possono essere visualizzate con queste tracce sovrapposte, in modo da eliminare eventuali manualmente manufatti che sono stati erroneamente identificati come vermi (e. G., Traccia 1 nella Figura 5B). Un modo efficace per eliminare lo sfondo di arte ifacts (indicati con una freccia in Figura 5B) è scegliere con attenzione la dimensione minima e massima degli oggetti da identificare (Figura 5C). Dalle differenti uscite del plugin wrMTrck, usiamo le lunghezze al secondo (BLPS) parametro che misura la velocità media di ciascun animale, rappresentata dalla lunghezza di ogni traccia divisa per la lunghezza del corpo di ciascun oggetto, normalizzando quindi per differenze di potenziale dimensioni dei nematodi (Figura 5D). Utilizzando questo metodo, abbiamo identificato 35 soppressori di tossicità prioni indotta (sopt) che ha aumentato il fenotipo motilità in R2E2 esprimere C. elegans ad almeno 133% e fino al 256% rispetto ai vermi vettore trattati vuoti (Figura 6). Questi geni sopt rappresentano l'ultima hit che hanno portato da parte dei nostri sforzi di screening ad alto rendimento confermato.

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Figura 1. Il dominio prione si diffonde tra le cellule e tessuti in C. elegans da trasporto vescicolare. (A) Compresso confocale z-pile di nematodi che esprimono RFP nel muscolo parete del corpo (BWM) cellule (RFPm). (B) Compresso confocale z-pile di nematodi esprimere la variante altamente tossico e aggregazione NM prona, R2E2 , in cellule BWM (R2E2m). Le frecce indicano vescicole tubolari, freccia indica aggregato. (C + D) Serie Time-lapse di animali esprimere RFPm (C) e R2E2m (D). Le frecce indicano le aree di movimento vescicolare. RFPm presenta per lo più una colorazione diffusa. Anche quando RFPm si trova in vescicole, questi si muovono appena. R2E2m localizza a numerose vescicole che sono trasportati all'interno e tra le cellule. Barre di scala: 10 micron. I video di accompagnamento 1 e 2 [link posto per Video 1 e 2 qui] corrispondono al 1C figure e D,rispettivamente.

Figura 2
Figura 2. sensori pieghevoli rivelano l'effetto diffuso del dominio prione su proteostasis. (A + B) Coexpression di R2E2m promuove aggregazione RΔ2-5m. Immagini confocale di (A) di controllo RΔ2-5m e (B) RΔ2-5m coespressi con R2E2m nelle cellule BWM. (C + D) Muscle espressi R2E2m promuove aggregazione RΔ2-5i intestinale. (C) confocale immagine di controllo degli animali esprimendo RΔ2- 5i in cellule intestinali. (D) immagine confocale di animali che esprimono R2E2m in cellule BWM e RΔ2-5i nell'intestino. Barre di scala: 10 micron (E + F) R2E2m induce non cella aggregazione autonoma di Q44i (E) immagini fluorescenti rappresentativi di Q44i e Q44i; animali R2E2m 4 giorni dopo il trasferimento sincronizzato lar L1..vae su piastre freschi OP50 testa di serie NGM. L'espressione in cellule di R2E2 BWM porta ad un inizio precoce di aggregazione Q44i nell'intestino. (F) Quantificazione di animali con aggregati (in%) nei giorni indicati dopo la sincronizzazione. Barre di errore rappresentano SD Questa cifra è stata modificata da 40.

Figura 3
Figura 3. Il sod-3p :: GFP giornalista lo stress trascrizionale rivela che il dominio prione provoca cella cella induzione autonome autonomo e non di stress ossidativo. (A + B) Immagini rappresentative fluorescenti (utilizzando lo stesso tempo di esposizione) di sod-3p :: GFP esprimere animali di controllo (A) e sod-3p :: GFP;. Animals R2E2m (B) il giorno 2 di età adulta (C) L'espressione in cellule di R2E2 BWM porta ad una induzione del reporter non solo nella cella BWMs (I), ma anche a livello intestinale (II), cordone nervoso (III), faringe e testa neuroni (IV).

Figura 5
Figura 5. Analisi di movimento senza fine con il plugin wrMTrck per ImageJ. (A) Esempio di un film d'ingresso generato utilizzando un ingrandimento appropriata (~ 10X) per monitorare diversi animali alla volta. (B) "*" file _labels.tif sono una potenza di wrMTrck_Batch e consentire curation manuale dei risultati delle analisi. La freccia indica un oggetto che è stato correttamente escluso dall'analisi causa di una scelta appropriata dei parametri minimi e massimi di dimensioni. (C) Finestra di immissione di wrMTrck_Batch, mostrando i parametri utilizzati per questo protocollo. Questi parametri devono essere regolati in base alle singole impostazioni del microscopio e del cinema. (D) risultati di uscita da movemeanalisi nt di (B), con la colonna BLPS evidenziato in giallo. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 1
Figura 6. vermi R2E2 trattati con cloni RNAi che sono supressors di prioni indotta tossicità (sopt) mostrano una maggiore motilità. La motilità è indicato come relativo BLPS rispetto al controllo negativo (vuoto vettore). Vengono mostrati tutti statisticamente significativi (studente t-test) cloni RNAi identificati nella schermata HTP. stella nera rappresenta il colpo mostrato come esempio in figura 5. I risultati sono da 3 film, con 17 <n <53 tracce per condizione. Barre di errore rappresentano SEM. </ P>

Tabella 1. C. elegans ceppi esprimendo sensori pieghevoli e giornalisti di stress.

Nome Strain genotipo Commenti Fonte Strain
Sensori pieghevoli
transgeni
AM140 unc-54p :: :: polyQ35 YFP espressione di polyQ35 specifico muscolo-, età aggregazione dipendente CGC o Morimoto lab
AM141 unc-54p :: :: polyQ40 YFP espressione muscolo-specifica di polyQ40, age aggregazione dipendente CGC o Morimoto lab
AM801 unc-54p :: :: RΔ2-5 YFP espressione muscolo-specifica di nucleazione incompetente dominio prioni Morimoto lab
OG412 VHA-6p :: :: polyQ44 YFP intestino-specifica espressione di polyQ44, età aggregazione dipendente CGC
AM809 VHA-6p :: RΔ2-5 :: GFP; Myo-2p :: mCherry specifiche espressione-intestinale di nucleazione incompetente dominio prioni Morimoto lab
AM47 F25B3.3p :: :: polyQ40 cfp espressione specifica dei neuroni di polyQ40, tipo di cellula di aggregazione specifico Morimoto lab
AM982 unc54p :: :: luciferasi YFP espressione muscolo-specifica di WT luciferasi lucciola Morimoto lab Myo-3p :: luciferasi :: GFP; rol-6 espressione muscolo-specifica di WT luciferasi lucciola Behl lab
SNG-1p :: luciferasi :: GFP; rol-6 espressione muscolo-specifica di WT luciferasi lucciola Behl lab
FUH55 unc54p :: Fluc :: EGFP; rol-6 espressione muscolo-specifica di WT luciferasi lucciola Hartl lab
FUH134 unc54p :: FLUCSM :: EGFP; rol-6 espressione muscolo-specifica di R188Q mutante lucciola luciferasi Hartl lab
FUH135 unc54p :: FLUCDM :: EGFP; rol-6 espressione muscolo-specifica di R188Q + R261Q doppio mutante lucciola luciferasi Hartl lab
FUH48 F25B3.3p :: Fluc :: EGFP; rol-6 espressione specifica dei neuroni di WT lucifera lucciolase Hartl lab
FUH136 F25B3.3p :: FLUCSM :: EGFP; rol-6 espressione specifica dei neuroni di R188Q mutante lucciola luciferasi Hartl lab
FUH137 F25B3.3p :: FLUCDM :: EGFP; rol-6 espressione specifica dei neuroni di R188Q + R261Q doppio mutante lucciola luciferasi Hartl lab
ts mutanti
CB1402 unc-15 (e1402) I Paramyosin (ts), sensibile alla temperatura Unc-paralizzato, Let CGC
CB1157 unc-54 (E1157) I Miosina (ts), sensibile alla temperatura Unc CGC
CB1301 unc-54 (E1301) I Miosina (ts), sensibile alla temperatura Unc CGC
CB286 unc-45 (E286) III Unc-45 (ts), sensibile alla temperatura, movimento lento Unc, Egl CGC
HE250 unc-52 (e669su250) II Perlecan (ts), sensibile alla temperatura Unc, paralisi rigida CGC
SD551 let-60 (ga89) IV Ras (ts), sensibile alla temperatura Muv, Ste, Let, Lva, Osm CGC
CX51 DYN-1 (ky51) X Dynamin (ts), sensibile alla temperatura Unc CGC
CW152 gas-1 (fc21) X Gas-1 (ts), sensibilità EtOH termosensibile CGC
ZZ26 unc-63 (x26) I Acetilcolina recettore (ts), temperatura di resistenza levamisolo sensibile CGC
giornalisti di stress
CL2070 HSP-16.2p :: gfp; rol-6 stress termico; Cyto UPR CGC
TJ375 HSP-16.2p :: GFP stress termico; Cyto UPR CGC
TJ3000, TJ3001 HSP-16.2p :: GFP; CBR-unc-119 (+) stress termico; Cyto UPR CGC
AM446 hsp70p :: GFP; rol-6 stress termico; Cyto UPR Morimoto lab
AM722 hsp70p :: mCherry; Myo-2p :: cfp stress termico; Cyto UPR Morimoto lab
AM799 hsp90p :: GFP stress termico; Cyto UPR Morimoto lab
OG497 HSF-1p :: HSF-1 :: gfp; CBR-unc-119 (+) stress termico; Cyto UPR CGC
CF1553 sod-3p :: GFP; rol-6 lo stress ossidativo CGC
KN259 sod-3p :: GFP; rol-6 lo stress ossidativo CGC
CL2166 gst-4p :: GFP :: nls lo stress ossidativo CGC
LD1171 GCS-1p :: GFP; rol-6 lo stress ossidativo CGC
LD1 SKN-1p :: SKN-1 :: GFP; rol-6 lo stress ossidativo CGC
IG274 nlp-29p :: GFP stress osmotico CGC
BC20309 mtl-1p :: GFP lo stress di metallo Baillie lab
BC20342 mtl-2p :: GFP str metalloess Baillie lab
BC20314 elt-2p :: GFP lo stress di metallo Baillie lab
SJ4005 HSP-4p :: GFP UPR ER CGC
SJ4100 HSP-6p :: GFP UPR mito CGC
SJ4058 HSP-60p :: GFP UPR mito CGC

CGC: Caenorhabditis Genetics Centro; ts = temperatura sensibili; UPR risposta = proteine ​​spiegato; cyto = citosolico; mito = mitocondriale; ER = reticolo endoplasmatico.

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Discussion

I metodi descritti qui aiutano a illustrare la diffusione e la cella di tossicità autonoma cella complesso autonomo e non di proteine ​​prioniche-like. Abbiamo recentemente scoperto che un dominio citosolico prioni aggregazione incline è ripreso in vescicole di membrana in un processo di autofagia correlato. Un sottoinsieme specifico di queste vescicole trasporta il dominio prione all'interno e tra cellule e tessuti 40. La chiave per monitorare il loro movimento nel animale vivente è che la proteina deve essere etichettato con MRFP, perché solo le proteine ​​MRFP-taggati erano visibili in queste vescicole presumibilmente acidi. Utilizzando lo stesso approccio, stiamo studiando il potenziale comportamento prione-come alcune proteine ​​correlate alla malattia, come la superossido dismutasi 1 (SOD1) (legato alla SLA), l'alfa-sinucleina (collegato a PD) o TAR proteina-DNA-binding 43 (TDP-43) (legato alla SLA). Sebbene questo trasporto intercellulare entro vescicole sembra essere usato da più altre proteine, ci potrebbe essere unpercorsi SUPPLEMENTARI che permettono la diffusione.

L'uso di sensori pieghevoli ben caratterizzati è un potente strumento per monitorare effetti sulla proteina cellulare pieghevole ambiente in C. elegans 63-66. Qui abbiamo dimostrato come utilizzare l'età accumulo dipendente delle fluorescenti Tagged proteine ​​aggregazione inclini espresso sotto promotori tessuto-specifici per monitorare visivamente la capacità di piegatura dei tessuti diversi simultaneamente. Altre possibilità per studiare la rete proteostasis organismal includono l'uso di proteine ​​mutanti ts endogene. Queste proteine ​​metastabili funzionano normalmente alla temperatura permissiva (15 ° C), ma misfold e diventare non funzionali alla temperatura restrittiva (25 ° C), esponendo la loro caratteristica fenotipo mutante. In presenza di una proteina incline aggregazione o durante l'invecchiamento, i ts fenotipo mutante viene esposto anche in condizioni permissive 63-66. Alcuni di questi mutanti ts sono espressi in oolo un sottoinsieme di tessuti o fenotipi tessuto-specifiche presentano, rendendo questi particolarmente utile per testare per la cella cellula autonoma e non effetti proteotoxic autonome. Ad esempio, un mutante ts di LET-60, un membro della famiglia protooncogene RAS-GTP binding, Ras (ts), è ubiquitaria espresso, ma mostra mutante tessuto-specifica fenotipi 63,66. Utilizzando questo ts mutante, l'effetto delle espansioni polyQ sul proteostasis cellulare ha dimostrato di essere cellule autonoma 63. Espressione dei polyQ in background genetico di ras (ts) rivela solo il fenotipo mutante specifica per il tessuto in cui è espressa la proteina. L'esposizione di molteplici fenotipi mutanti indicherebbe che una proteina ha effetti non-cellulari proteotoxic autonome.

Inoltre, per verificare gli effetti sulle vie stress cellulare, c'è una grande selezione di reporter in vivo di stress fluorescenti a C. elegans 72. Questi sono di solito di trascrizioneAL giornalisti che esprimono la proteina fluorescente verde (GFP) sotto un promotore di stress-inducibile, come HSP-16.2p o sod-3p, che riportano sullo stress, rispettivamente, 72 termica o ossidativa. Utilizzando reporter appropriate in combinazione con le proteine ​​prioniche simile, si può monitorare un potenziale di induzione di risposte allo stress in tessuti diversi da quello che esprime il rispettivo transgene. Un avvertimento, tuttavia, è che questi reporter di stress spesso non sono sufficientemente sensibili per rivelare sottili upregulation di un dato percorso (osservazioni non pubblicate).

Sulla nostra ricerca per verificare se i geni che influenzano la non tossicità delle cellule autonome anche colpiscono proteine ​​diffusione, abbiamo iniziato con lo screening per i geni che, quando abbattuto, avrebbe migliorare i difetti di movimento. Utilizzando valutazione visiva dei tassi di nuoto come-out lettura, siamo riusciti a comodamente test ~ 25 piastre per sessione e effettuare due giri di questo protocollo a settimana, con conseguente completamentodella schermata iniziale entro 6 settimane. La conferma dei risultati, mediante analisi quantitativa del movimento senza fine su piastre solide, in triplicato, utilizzando wrMTrck è stata eseguita in un ulteriore 3 settimane. Un avvertimento, però, è che utilizzando strisciando in lastre invece di nuoto in mezzi liquidi come una lettura-out si potrebbe perdere alcuni geni candidati, come il nuoto e la scansione non sono movimenti identici e possono essere influenzati da percorsi distinti 73. Così, se alcuni geni candidati non possono essere confermate su lastre solide, devono essere nuovamente testati in mezzi liquidi, dove il nuoto può essere quantificata contando la frequenza botte entro un dato tempo.

Il protocollo di screening descritto qui utilizza automatizzato workstation di gestione dei liquidi, che riduce notevolmente la variabilità. Lo svantaggio è che è necessario un eccesso di fluidi per il serbatoio dei robot, che potrebbe non essere sempre fattibile. Questa impostazione di screening può essere facilmente adattato ad altri schermi in C. elegans </ Em> che l'uso botte come schermo-out.This lettura non è stato progettato per identificare i geni che influenzano direttamente la cellula non diffondere o tossicità autonoma del dominio prione, come genoma schermi di grandi dimensioni dovrebbero essere semplici nel design, in modo tale da eseguire in modo tempestivo. Difetti motilità possono provenire non solo da muscolare, ma anche da danno neuronale e da un certo numero di altri difetti del gene 53. Quindi, usando questa lettura, potremmo trovare non solo modificatori di tossicità muscolo-specifico. Attualmente stiamo testando i geni candidati per i loro effetti sul dominio prioni diffusione e non cellule tossicità autonoma utilizzando i metodi descritti in precedenza. Questi esperimenti finalmente rivelare se transcellulare diffusione di aggregati proteici è direttamente legata alla tossicità osservata in altri tessuti o se la trasmissione di cellule-cellula e cellula non tossicità autonomi possono essere disaccoppiati.

Presi insieme, i metodi descritti possono essere utilizzati per esaminare il potenziale prcomportamento di ioni-come delle proteine ​​a livello cellulare e organismal utilizzando C. elegans.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
Nanosphere size standards 100 nm ThermoScientific 3100A
Levamisole Sigma L-9756
IPTG Sigma 15502-10G
Ahringer RNAi library Source BioScience LifeSciences  http://www.lifesciences.sourcebioscience
.com/clone-products/non-mammalian/c-elegans/c-elegans-rnai-library/
Equipment
Sorvall Legend XTR Refrigerated Centrifuge, 120VAC ThermoScientific 75004521 http://www.coleparmer.com/Product/Thermo_Scientific_Sorvall_Legend_
XTR_Refrigerated_Centrifuge_120
VAC/EW-17707-60
96 pin replicator  Scionomix   http://www.scinomix.com/all-products/96-pin-replicator/
HiGro high-capacity, incubating shaker  Digilab http://www.digilabglobal.com/higro
Multidrop Combi Reagent Dispenser  Titertrek http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/titertek.htm
Biomek FX AP96 Automated Workstation  Beckman Coulter http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/biomek_multi.htm
Innova44 shaker New Brunswick http://www.eppendorf.com/int///index.php?sitemap=2.3&pb=d78efbc05310ec
04&action=products&contentid=1&
catalognode=83389
M205 FA  Leica http://www.leica-microsystems.com/de/produkte/stereomikroskope-makroskope/fluoreszenz/details/product/leica-m205-fa/
ORCA-R2 C10600-10BDigital CCD camera Hamamatsu http://www.hamamatsu.com/jp/en/community/life_science_camera/product/search/C10600-10B/index.html
Spinning Disc AF Confocal Microscope  Leica http://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/life-science-research/fluorescence-microscopes/details/product/leica-sd-af/
Falcon 4M60 camera  Teledyne Dalsa  http://www.teledynedalsa.com/imaging/products/cameras/area-scan/falcon/PT-41-04M60/
Software
MetaMorph Microscopy Automation & Image Analysis Software Molecular Devices http://www.moleculardevices.com/products/software/meta-imaging-series/metamorph.html
Hamamatsu SimplePCI Image Analysis Software Meyer Instruments http://meyerinst.com/imaging-software/hamamatsu/index.htm
ImageJ NIH http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html
wrMTrck plugin for ImageJ http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html
C. elegans strains
N2 (WT) Caenorhabditis Genetics Center (CGC) http://www.cgc.cbs.umn.edu/strain.php?id=10570
AM815                                                    rmIs323[myo-3p::sup35(r2e2)::rfp] Morimoto lab available from our laboratory 
See table 1 for a source for folding sensor and stress reporter strains

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Biologia Cellulare Numero 95, malattie neurodegenerative malattie proteine ​​misfolding prioni come la diffusione cell-to-cell trasmissione aggregazione proteica non-tossicità delle cellule autonome proteostasis
Indagare le proteine ​​prioniche-come diffusione e tossicità di utilizzare i metazoi Organismo modello<em&gt; C. elegans</em
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Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M.… More

Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans. J. Vis. Exp. (95), e52321, doi:10.3791/52321 (2015).

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