Summary
Hier beschrijven we een techniek voor het bestuderen van de hippocampus postnatale neurogenese met de organotypische slice cultuur techniek. Deze werkwijze maakt in vitro manipulatie van volwassen neurogenese en maakt de directe toepassing van farmacologische middelen aan de gekweekte hippocampus.
Abstract
Hier beschrijven we een techniek voor het bestuderen van de hippocampus postnatale neurogenese in de knaagdierhersenen met de organotypische slice cultuur techniek. Deze methode houdt de karakteristieke topografische morfologie van de hippocampus terwijl directe toepassing van farmacologische middelen om de ontwikkeling van de hippocampus dentate gyrus. Daarnaast kan slice culturen worden gehandhaafd voor maximaal 4 weken en dus mogelijk maken om het rijpingsproces van de pasgeboren korrel neuronen te bestuderen. Plak kweken een doelmatig farmacologische manipulatie van hippocampale plakjes met uitsluiting complexe variabelen zoals onzekerheden betreffende de diepe anatomische locatie van de hippocampus en de bloed-hersenbarrière. Daarom wilden we organotypische slice cultures specifiek optimaliseren postnatale neurogenese onderzoek.
Protocol
OPMERKING: Alle dierlijke procedures gelijkvormig aan de diergezondheid en het welzijn richtlijnen van de afdeling Vergelijkende Geneeskunde aan de Universiteit van Toronto.
1. Bereiding van hippocampus Plakjes
- Steriliseren de volgende instrumenten met behulp van de droge autoclaaf bij 125 ° C: Scalpel handvat (# 3) (2), Standard patroon tang, groot (1), Kleine dissector schaar (schuin naar rechts) (1), Micro lepel (lepel en een flatscreen spatel uiteinden) (1), Micro-spatels (afgeronde en afgeronde taps toelopende uiteinden) (2), Fijn penseel (1), Vuur gepolijste Pasteur pipet (2), gaas pleinen, 2 x 2 inch (5).
- Als steriel, zet de instrumenten in een steriele container en houd overdekt tot gebruik. Onmiddellijk voor dissectie, dompel instrumenten in een 70% ethanol oplossing.
- Bereid een 6-well kweekplaat met kweekinsertie alvorens met de dissectie procedure door toevoeging van 1 ml kweekmedium / putje en opslaan van de plaat in de incubator bij 35 ° C eennd 5% CO2.
2. Schik Dissectiemateriaal in steriele laminaire stroming kap
- Spuit de laminaire stroming kap met 70% ethanol en verwijder gesteriliseerde dissectie instrumenten van alcohol. Laat de instrumenten te drogen terwijl het rusten op een steriele petrischaal om het contact tussen de alcohol en de ontleed hersenweefsel te vermijden.
- Borg 5-7 ml gesteriliseerd ijskoude ontleden oplossing in 2 grote steriele petrischalen. Een gerecht zal chill en reinig de kop (vuile), de andere voor het koelen en spoelen van de schepte hersenen (schone). Plaats een gesteriliseerd filtreerpapier in een van de petrischaal deksels voor het ontleden van de hersenen.
- Plaats een kleine, gesteriliseerd filtreerpapier in een van de kleine petrischaal deksel voor het ontleden van de hippocampus. Borg 3-5 ml gesteriliseerd ijskoude ontleden oplossing in 2 kleine, steriele petrischalen. Een gerecht zal de schepte hippocampus te houden, zal men secties te houden tijdens de scheiding van de hippocampus sectiesonder dissectie microscoop.
- Bereid het weefsel chopper met tape een stuk gesteriliseerd filter papier om het uitsnijden en het monteren van een steriele scheermesje. Bevochtig het filter papier met gesteriliseerd ontleden oplossing.
- Spuit een schone bio-tas met alcohol en plaats het in laminaire stroming schone werkbank.
3. hippocampus Dissection
- Spuit de P7 Sprague Dawley rattenpup met 70% ethanol buitenkant van de laminaire stroming schoon bankje en snel onthoofden het dier met behulp van grote steriele chirurgische schaar in de laminaire stroming bankje. Laat het hoofd laten vallen in ijskoude ontleden oplossing in een van de petrischaaltjes.
- In de petrischaal, spoelen het bloed en snel overbrengen het hoofd te gesteriliseerde filterpapier, ventrale zijde naar beneden.
- Met behulp van de scalpel, snijd langs de dorsale oppervlak in het sagittale vlak aan de onderliggende schedel bloot te leggen. Knip de huid, maar niet het onderliggende bot, dat zacht en gemakkelijk door ratten aan Tzijn leeftijd. Zet opzij deze "vuile" scalpel en niet te gebruiken op hersenweefsel.
- Met behulp van de kleine dissector schaar (schuin naar rechts) en een tang, opengesneden de schedel langs pijlnaad van de schedel naar bregma, de anatomische punt op de schedel waar de coronale hechtdraad loodrecht wordt doorsneden door de pijlnaad. Gebruik een tang om de schedel flappen omhoog en weg te trekken van de middellijn van de schedel.
- Plaats de micro lepel op de onderzijde van de hersenen, onder de hersenstam, naar til de hersenen uit de schedel. Til de hersenen naar de oogzenuwen en het reukorgaan op basale oppervlak van de hersenen bloot te leggen. Snijd deze structuren met een kleine schaar om volledig los van de hersenen uit de schedel. Haal en breng de intacte hersenen naar de andere grote petrischaal met ijskoude ontleden oplossing.
- Met behulp van de micro Schep de hersenen om een kleine petrischaal deksel, die een steriele filter papier. Met een steriele Pasteur pipet, spoel de hersenen met enkele druppels dissecting oplossing om weefsel vochtig te houden.
- Met een "schone" scalpel snijden de twee hersenhelften elkaar. Breng de linker hersenhelft naar grote petrischaal met micro lepel en plaats halfrond pia beneden tegen ijskoude ontleden oplossing voor verder gebruik.
- Bekijk de mediale zijde van de rechter hersenhelft en identificeren van de rand fornix, een prominente band van witte stof langs de mediale rand van de hippocampus. Met behulp van een steriel scalpel een sagittale snede door de fornix, maar zorg omdat slechts 0,5 cm van de scalpel tip voldoende om de fornix snijden zal zijn.
- Met behulp van 2 micro-spatels, verwijdert u de eerste hippocampus van rechter hersenhelft door het plaatsen van de rechter-spatel op de hersenstam en het opheffen van de bovenliggende cortex met de linker spatel. Til de cortex aan de laterale ventrikel en mediale oppervlak van de hippocampus onthullen. Een witte gebogen lijn, de fimbria, moet nu zichtbaar.
- Lijn de kromming van spatel met de curvatuur van de fimbria en druk voorzichtig op de spatel onder de fimbria. Schuif de spatel links en rijden langs rostrale-caudale as en til spatel in dorsale richting hippocampus te verwijderen.
- Breng de hippocampus naar een 2 e kleine petrischaal met ijskoude ontleden oplossing. Herhaal dezelfde procedure op de linker hersenhelft aan de linker hippocampus te verwijderen.
- Met een micro spatel voorzichtig de hippocampus dragen aan het weefsel chopper fase. Leg ze naast en evenwijdig aan elkaar en loodrecht op de as van de hakblad. Gebruik een penseel om het weefsel te positioneren en enkele druppels van de oplossing ontleden bovenop de hippocampus.
- Snijd het weefsel in 400 pm plakjes zonder te pauzeren om afzonderlijke segmenten te verwijderen (meestal zullen ze niet houden aan het blad). Na de hele hippocampus is gesneden, gebruik de verfkwast om voorzichtig overdracht van de sectie om een 2 e kleine petrischaal met dissectie oplossing.
- Onder advertentieissecting microscoop, zorgvuldig scheiden de drijvende plakjes met behulp van amicro-spatel en penseel.
- Verwijder de voorbereide cultuur plaat met cultuur insert uit de incubator en plaats in een laminaire stroming kap.
- Met behulp van een brand gepolijst Pasteur pipet, trek 4-5 sneetjes in de pipet en overdracht plakjes aan het apicale oppervlak van cultuur insert membraan. Vervolgens past u de positionering met een penseel en laat ruimte tussen de afzonderlijke secties en de grens van de cultuur insert.
- Met behulp van een steriele Pasteur pipet, verwijder de overtollige ontleden oplossing van apicale oppervlak van het membraan.
LET OP: bij het verwijderen oplossing vermijden, coupes in de pipet. U kunt ook gebruik maken van een gewone pipet (P200 of P1000) met gesteriliseerde pipet tips om langzaam te verwijderen oplossing. - Plaats de kweekplaat met serum bevattend kweekmedium en de hippocampale plakken terug in de incubator bij 35 ° C en 5% CO2.
OPMERKING: Als experiment gesprekkenvoor het genereren van culturen uit meerdere dieren, grondig reinigen van de laminaire stroming schoon bankje tussen dissecties. Terug instrumenten om alcohol oplossing en vervang alle Petri-gerechten, filter papers en steriele scheermesjes voorafgaand aan de tweede dissectie.
4. Het voeden en onderhouden Organotypische Slices
- Feed culturen in een steriele laminaire stroming schoon bankje.
- Voer de eerste voeding van de gekweekte secties 2 dagen na de dissectie. Zuig oude kweekmedium met een gesteriliseerde glazen pipet.
- Gebruik steriele 5 ml serologische pipet 1 ml verse, steriele, serum bevattend medium aan de putjes.
- Vervang voorzichtig de cultuur insert en zorgen om eventuele luchtbellen die onder membraanoppervlak kan gevormd hebben te verwijderen.
- Na de eerste voeding, veranderen medium elke andere dag.
5. Incubatie Tissue segmenten met Thymidine analogen aan Label Pasgeboren Neuronen
- Om te onderzoekende rijping en integratie van dentale granule cellen in de hippocampus, incubeer de organotypische plakjes met een analoog van thymidine, zoals Bromodeoxyuridine (BrdU) of Chlorodeoxyuridine (CldU). Hier gebruiken we CldU vanwege de hogere oplosbaarheid in zoutoplossing.
- Na 3DIV, voeg 1 ui 10 mg / ml CldU voorraadoplossing in zoutoplossing 1 ml kweekmedium voor een eindconcentratie van 10 ug / ml. Als BrdU wordt gebruikt, corrigeer de concentratie verschillen in molecuulgewicht. Medium toe te voegen met CldU tot cultuur putten en incubeer weefsel met CldU-bevattend medium gedurende 2 uur bij 35 ° C.
- Na 2 uur incubatie bij 35 ° C, verwijder de CldU-bevattend medium en vervang regelmatig voedingsmedium normale voedingsschema (hierboven beschreven) te hervatten.
6. Tissue Fixatie en opslag
- Opzetten van een tijdlijn voor het toepassen van behandelingen en de vaststelling van weefselmonsters voordat cultuur experimenten (Figuur 2B). <li> Bij een voorafbepaalde dag na dissectie, bereid de volgende in een laboratorium zuurkast: een bekerglas van 10-50 ml met 4% paraformaldehyde (PFA) in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS); een lege beker voor afgedankte kweekmedium; kleine tang; en een pipet 1000 ml met wegwerp tips.
- Verwijder de cultuur plaat (s) vanaf incubatiekamer en overbrengen in een zuurkast. Kantel de individuele well plaat inserts met een pincet. Vervolgens gebruikt u een pipet om kweekmedium en overdracht te verwijderen om een verwijdering beker. Kantel de cultuur plaat in een hoek om ervoor te zorgen dat alle kweekmedium wordt verwijderd.
- Eindig het verwijderen medium voor één cultuur plaat tegelijk. Als medium is verwijderd, voeg 1 ml van 4% PFA aan elke cultuur goed en sluiten goed plaat met parafilm. Herhaal dit voor kweekplaten als nodig en overdracht platen koelkast bij 4 ° C gedurende 24 uur.
- Na 24 uur, de voorbereiding van de volgende in een zuurkast: 10-50 ml bekerglas met 0,1% natriumazide in PBS; een legebeker voor afgedankte PFA (volg de veiligheidsinstructies wanneer zij zich ontdoen van giftige stoffen); kleine tang; en 1.000 ml pipet met wegwerp tips.
- Volg de procedure die in 6.4 voor het toevoegen van PFA, maar voeg 1 ml PBS met natriumazide plaats. Eenmaal volledig overgedragen, verbinding putjes voor toekomstig gebruik door het wikkelen randen parafilm en bewaren in de koelkast bij 4 ° C.
7. Snijden Tissue voor Immunohistochemistry
- Voeren weefsel snijden met behulp van een vibratome. De volgende reeks stappen helpen maximaliseren van de opbrengst van bruikbare coupes van organotypische culturen.
OPMERKING: Onmiddellijk na hippocampale dissectie en plating van segmenten, het weefsel heeft een dikte van ongeveer 400 pm. Na 2-3 weken in de incubatiekamer zal weefselcoupes begint af te vlakken, hetgeen uiteindelijk een snijdikte van 150-300 urn. - Bereid de volgende items te vinden in hoofdstuk gekweekte weefsel: een # 11 scalpel blade en handvat, een glazen petrischaal met ijskoude PBS, een micro-dissectie tang, en een schone vibratome uitsnijden om weefsel te monteren.
- Gebruik een scalpel zorgvuldig snijden langs de omtrek van de cirkelvormige insert membraan zodat het kan worden losgemaakt van het kunststof inzetstuk behuizing. Verlaat voldoende ruimte tussen de gekweekte slice en de scalpel.
- Breng de vrijstaande insert membraan naar een petrischaal met PBS. Na spoelen met PBS, een tang om het membraan te dragen aan de vibratome montage fase.
- Vervolgens gebruikt de scalpel om overtollig membraan rond gekweekte plakjes te elimineren en weggesneden overtollig materiaal om schone randen te creëren. Deze stap zorgt het membraan vlak en kan gemakkelijk hechten aan het snijoppervlak.
- Plaats 1-2 druppels lijm op de vibratome uitsnijden en verspreid in gelijkmatige laag met behulp van een 22 G naald. Verspreid lijm in een rechthoekige vorm met de lange zijde evenwijdig met het zaagblad van de vibratome. Voer deze stapsnel de lijm uitdroogt.
- Gebruik een tang om de bijgesneden membraan dat de hippocampus plakjes over te dragen aan het uitsnijden en voorzichtig te positioneren het membraan op de lijm en ervoor zorgen dat er geen luchtbellen.
- Zoals de superlijm droogt, overdracht van de vibratome podium met de gelijmde membraan terug naar het PBS met petrischaal. Bereid de vibratome blad en een 48 wells plaat met natriumazide om weefsel secties te slaan.
- Gebruik de vibratome tot 30 urn van de organotypische slice weefsel en overdracht genereren van een 48 wells plaat met natriumazide voor opslag en daaropvolgende immunohistochemische kleuring.
- Verwijzen naar reeds bestaande protocollen voor immunohistochemische kleuring 26,29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bepalen of organotypische culturen geschikt voor volwassen neurogenese onderzoek nodig zou zijn dat zij voldoen aan twee belangrijke criteria: 1) dat de schijfjes te onderhouden karakteristieke morfologische kenmerken van de hippocampus plakjes na 10-21 dagen in vitro (DIV), en 2) dat pasgeboren DGCs kunnen worden gekwantificeerd met behulp van standaard immunohistochemische technieken die gewoonlijk in volwassen neurogenese onderzoek. Ten aanzien van het eerste criterium, Figuur 1A en 1B markeren de bewaarde hippocampus morfologie. Karakteristieke kenmerken, zoals de dentate gyrus (DG), CA1 en CA3 regio's zijn gemakkelijk te herkennen.
Met betrekking tot het tweede criterium, figuur 1C (bovenste paneel) biedt een representatieve steekproef van pasgeboren DGCs co-uiting van de endogene neuronale marker, doublecortin (DCX) in groen en de exogene thymidine analoog, 5-chloor-2'-deoxyuridine (CldU) in rood. Deze neuronen bevinden zich in de sub-granular zone van de hippocampus DG. Om ervoor te zorgen de juiste geboorte datering van neuronen, identificeren we CldU + kernen die co-express DCX. Confocale microscopie te worden gegeven aan dubbel gelabelde neuronen succesvol identificeren omdat kandidaat cellen moeten samen drukken de merker van belang gedurende de Z-as van de cel. Sample data verkregen met een dergelijke dubbele-labelingsopbrengst ongeveer 17% van CldU + cellen die DCX en 35% van CldU + cellen die CABP uitgedrukt in 12 dagen na CldU applicatie uitgedrukt. De DCX waarde is zeer vergelijkbaar, terwijl de CABP waarde is aanzienlijk lager dan vergelijkbare cijfer verkregen in vivo 26. Standaard weefselkweekomstandigheden kan verantwoordelijk zijn voor een relatief laag percentage van de CABP + cellen.
Figuur 2A toont de dissectie stappen die zich van links naar rechts (1-8): ab onthoofding van het dier (1), het verwijderen van de hersenen (2), overdracht van hersenen ijskoude dissectie oplossing (3), ontledenion van hippocampus van links en rechts hemisferen (4), opslaan van ontleed hippocampus in ijskoude dissectie oplossing (5), overdracht van zowel hippocampus tot Stoelting weefsel chopper en snijden bij 400 urn (6) scheiden van afzonderlijke segmenten onder dissectiemicroscoop (7), en plating weefsel aan celkweek inserts (8). Verder gaat op deze manier helpt een steriele omgeving in de hele cultuur proces te behouden.
Tot slot, sinds de tijd-loop van de ontwikkeling is een belangrijk kenmerk van de hippocampus neurogenese, kozen we ervoor om de gekweekte plakjes met CldU incubeer gedurende precies 2 uur na 3 DIV naar label delende neurale stamcellen. De smal tijdvenster voor CldU toediening werd gekozen om de waarschijnlijkheid dat gelabelde neuronen vormde een homogene populatie van cellen op ongeveer dezelfde maturatie fase (figuur 2) verbeteren. Met betrekking tot CldU etikettering, een kritische functie van neurogenese voor hippocampus functie is dat bij een given tijd is er een heterogene populatie van dentate granule cellen op verschillende maturational stadia 27,28.
Figuur 1. Voorbeeld fluorescentie microscoop foto's te markeren bewaard hippocampus morfologie. (A) Organotypische stukje van 12 dagen na de dissectie immunolabeled voor CldU (groen) en CABP (rood), 20x afbeelding lucht composiet (Schaal bar = 500 pm). (B) Monster microfoto van het schijfje van 21 dagen na dissectie immunolabeled voor CldU ( rood) en DCX (groen) (andere kleur-schema van figuur 1A), 20x lucht (Schaal bar = 100 micrometer). (C) Toppaneel. Vertegenwoordiger confocale microscoop foto van cellen co-uiting ClXdU en endogene onvolwassen neuronale marker, DCX. DGCs co-expressie DCX (groen) en CldU (rood) worden geteld als pasgeboren neuronen. Pijl geeft een dubbel-labeled cel bij vroeg ontwikkelingsstadium, 40x olie-immersie (schaal bar = 10 pm). Vergelijkbare cellen zijn waargenomen 10 dagen na de etikettering in vivo 26. Onderste paneel. Representatieve fluorescente afbeeldingen cellen co-expressie CldU (groen) en CABP (rood). Pijl geeft een dubbel-gelabelde cel, 40x fluorescerende microfoto (Schaal bar = 10 micrometer). DG-dentate gyrus. GCL-korrel cellaag. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. (A) Illustratie van de opeenvolgende stappen voor de hippocampus dissectie in laminaire stroming schone werkbank. Stippellijn geeft aan "niet-steriel" (links) en "steriele" (rechts) zones van de dissectie gebied. (B) Timeline voor organotypic slice culturen bereid uit P7 rat pups (start). Notaties geven aan toepassing van thymidine analoog, CldU * en "behandeling", die kunnen bestaan uit verschillende farmacologische middelen geschikt zijn voor de experimentele vraag. Culturen gefixeerd met paraformaldehyde op gewenste verblijftijden van CldU applicatie (Fix culturen). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
| Naam van de Reagens / Equipment | Vennootschap | Catalogusnummer | Opmerkingen / Omschrijving |
| 5-chloor-2'-deoxyuridine (CldU) | MP Biomedicals | 105478 | Gevaarlijke, Kankerverwekkende |
| Celkweek inserts, 30 mm diameter, 0,4 micrometer perts grootte | Thermo wetenschappelijke | 140.660 | Nuclon delta coating op deze pen zorgt voor een betere hechting weefsel en verbetert slice kwaliteit. |
| Conische Centrifugeerbuisjes (steriele) | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Dissector schaar (schuin naar rechts) | Fine Science Tools | 14.082-09 | |
| Minimum essentieel medium (MEM) | Gibco | 11095; vloeistof | Bewaren bij 4 ° C |
| Eclipse Ni-U fluorescentiemicroscoop | Nikon | ||
| Lijm voor tissue | Krazy Glue | KG585 | Met minimale hoeveelheid lijm hechting als weefselresten blootgesteld lijm onbruikbaar voor IHC zijn. |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) (500 ml) | Gibco | 14025-092 | Bewaren bij 4 ° C |
| Paardenserum hitte-geïnactiveerd (500 ml) | Gibco | 16050-122 | Voeg 50 ml porties en bewaar bij -20 ° C |
| Kimwipes | Kimberly-Clarke | TW 31KYPBX | |
| Gewijzigde glazen pipetten (onderkant van Pasteur pipet verwijderd en rand gladgemaakt met bunsenvlam) | |||
| Petrischaal (100 mm x 15 mm) en (60 mm x 15 mm) | Fisher Brand | FB0875712 en FB0875713A | |
| Scalpelmesjes # 11 | Fine Science Tools | 10.011-00 | |
| Scalpel handvat # 3 | Fine Science Tools | 10.003-12 | |
| Serologische pipetten | Sorfa Medische Plastic Co. | P8050 | |
| Standaard Patroon tang | Fine Science Tools | 11.000-12 | |
| Steriele vacuümfilter | Thermo-Wetenschappelijke | 565-0020 | |
| Chirurgische Scharen | Fine Science Tools | 14.054-13 | |
| Spuit gedreven filtereenheid | Millipore Millex | SLGP033RS | |
| Weefsel chopper met beweegbare podium | Stoelting | 51425 | |
| Fijne punt penseel |
Tabel 1. Supplies en reagentia
| Oplossing | Ingrediënten en instructies |
| Dissectie oplossing | a) 500 ml Hank &# 39; s Balanced Salt Solution (HBSS) (Gibco- 14.025-092). |
| b) Voeg 2,2 g D-glucose. | |
| c) Voeg 0,5 g sucrose. | |
| d) Voeg 1,787 g HEPES. | |
| e) Meng gedurende 30 min met magnetische roerplaat. | |
| f) Gebruik pH-meter om de oplossing te waarborgen heeft een uiteindelijke pH = 7,4. | |
| g) Gebruik osmometer tot de uiteindelijke osmolariteit = 320-330 mOsm garanderen. | |
| h) Steriliseer oplossing in een steriele laminaire stroming kap met behulp van vacuüm filtratie door 0,2 um filter. | |
| Serumhoudend kweekmedium: 100 ml Minimum Essential Medium (MEM) (Gibco 11095), 50 ml Paard (Gibco 16050-122), 50 ml HBSS. | a) Voeg het volgende toe aan 50 ml HBSS in de bak en los op in 37 ° C waterbad. Meng met magneetroerder. |
| b) 1,3 g D-glucose. | |
| c) 36 mg MgSO4. | |
| d) 17,6 mg ascorbinezuur. | |
| e) 5 gl 2M CaCl2 voorraadoplossing. | |
| f) Voeg 50 ul Antibiotica-Antimycoticum (100x voorraad, steriel; Gibco 15140-062). | |
| g) 1 ug / ml insuline. | |
| h) Steriliseren bovenstaande oplossing door filtratie door een 0,2 urn filter. | |
| i) Meng gefilterd oplossing met 100 ml MEM en 50 ml serum Paard in laminaire stroming kap. | |
| j) Voeg 50 ml porties in steriele conische centrifugebuizen (Fisher Scientific-14-432-22) en bewaar bij 4 ° C. | |
| 4% paraformaldehyde fixeeroplossing. | a) Bereid fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) door de volgende 300 ml gedestilleerd H2O en mengen op magnetische roerplaat. |
| b) Voeg 2,7 g natrium monobase (NaH 2 PO 4). | |
| c) Voeg 11,5 g natrium Phosphate dibasisch (NaHPO 4). | |
| d) Voeg 9,0 g natriumchloride (NaCl). | |
| e) Verhit ong. 700 ml gedestilleerd H 2 O tot 55 ° C en zet warmte. | |
| f) Voeg 40 g paraformaldehyde (PFA) en roer tot 700 ml water met behulp van magnetische roerplaat. | |
| g) Combineer de PBS (a, b, c, d) en PFA (e, f) oplossingen, breng de pH op 7,4 en vul tot eindvolume van 1000 ml. | |
| 0,1% natriumazide Solution | a) Voeg 1 g poedervormig natriumazide (NaN3) tot 1 liter PBS-oplossing. |
| b) Meng met behulp van magnetische roerplaat en bewaar bij 4 ° C. |
Tabel 2. Oplossingen en Recepten
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Volgende CldU (of BrdU) administratie, kan de tijdlijn van toepassing van farmacologische middelen worden gekozen om pasgeboren DGCs tijdens bepaalde ontwikkelingsstoornissen ramen richten. Bijvoorbeeld kan een hypothetische middel worden toegepast tijdens de tweede week na CldU injectie, die wordt voorgesteld samenvallen met de leeftijd van onvolwassen neuronen die in een ontwikkelingsfase waarin GABA is depolariserende. Toekomstige studies met dit protocol kan de farmacologisch middel en het raam van blootstelling aan "afstemmen" de benadering van de specifieke experimentele rentekwestie passen.
Een belangrijk criterium voor het bepalen dat slice culturen een geldig model voor postnatale neurogenese onderzoek is de mogelijkheid om vlekken en kwantificeren pasgeboren neuronen in de hippocampus. De twee belangrijkste bevindingen ter ondersteuning van deze hypothese was dat microscopische analyse bleek immunohistochemische reactiviteit voor CldU en endogene eiwit markers in dezelfde neuronen.Bij gebruik in combinatie met endogene neuronale merkers thymidine analogen zoals BrdU en CldU zijn krachtige hulpmiddelen voor neurogenese onderzoek.
De toepassing van thymidine analogen, zoals BrdU via intraperitoneale injectie wordt gewoonlijk gebruikt bij neurogenese onderzoek label neuronen die een S-fase van mitose 29. Soortgelijke benaderingen kunnen worden gebruikt in organotypische kweken met bepaalde wijzigingen. Bijvoorbeeld, eerdere studies toegediend BrdU (0,5 uM gedurende 3 dagen) culturen snijden na ~ 14 DIV 18. Het beoordelen van de gegevens in dat document gegevens blijkt dat sommige van de metrieken voor kwantificering neurogenese geen standaard technieken die in het veld neurogenese, dwz stereological kwantificering 30 niet gebruiken. Bijvoorbeeld, bij rapportage de co-expressie van BrdU en Neuronale-kernen (NeuN) positieve cellen, duiden deze een totaal aantal cellen "per kweek" In plaats van kennisatie met betrekking tot weefsel gebied of volume.
Latere studies verbeterd deze wijze snijden de gekweekte plakjes afzonderlijke 10 urn, die visualisatie en immunohistochemie protocollen verbeterd door antilichamen tegen gemakkelijker doordringen de weefselmonsters 31. Stapelbed et al. 28 gemeld dubbele labeling met BrdU (10 uM gedurende 3 dagen) het aantal co-gelabelde cellen per 10 urn gedeelte, maar geen informatie over de vergelijkende gebied of bepaalde hippocampusgebied bestudeerd dwz CA1, CA3 of geen DG. Bovendien analyse van de confocale fluorescentiemicroscopie en afbeeldingen niet overtuigend aangetoond dat hippocampale morfologie succes gehandhaafd.
Belangrijker nog, beide studies gebruikt een periode blootstelling BrdU van 3 dagen, wat nadelen heeft verbonden. BrdU etikettering is sterk geholpen neurogenese studies doordat onderzoekers aan nieuw gedeelde cellen in va volgenrious hersengebieden. Echter, BrdU toxiciteit is ook goed gekarakteriseerd. Het gebruik ervan is aangetoond morfologische en gedragsafwijkingen 32,33 en negatieve effecten op de celcyclus, differentiatie, migratie en overleving van neurale stamcellen 34-36 veroorzaken. De langdurige toediening van BrdU in de eerder genoemde studies kunnen verstorende variabelen hippocampale fysiologie veranderd en terwijl sommige bijwerkingen van BrdU toediening onvermijdelijk kunnen zijn, is onze experimentele protocol ontworpen om een aantal van deze complicaties te beperken door het incuberen van het weefsel met thymidine analogen hebben ingevoerd 2 uur. Daarnaast hebben we ervoor gekozen om CldU plaats van BrdU gebruiken omdat het toonde betere oplosbaarheid dan BrdU bij het opstellen van de incubatie-oplossing. Hoewel de 3 daagse protocol nuttig voor bepaalde experimentele ontwerpen bijvoorbeeld kunnen zijn, het maximaliseren van de etikettering van woekerende cellen, deze 2 uur protocol heeft een voordeel van puls-etikettering van een relatief kleine populatietie van cellen die kunnen worden bestudeerd op gewenste overlevingsduur (zie figuur 2B).
Door het vergelijken van het niveau van de neuronale productie van twee verschillende methoden van BrdU toepassing, Namba et al. Een belangrijke bijdrage geleverd aan de etikettering technieken in organotypische slice culturen 37. De auteurs vergeleken intraperitoneale (IP) injectie van BrdU (50 mg / kg) in postnatale dag 5 (P5) ratten met in vitro culturen die kweekmedium dat 1 uM BrdU gedurende 30 minuten onmiddellijk na explantatie weefsel ontvangen. Zij rapporteren geen statistisch significant verschil tussen in vivo en in vitro begin BrdU injectie in gekweekte weefsel. De auteurs geen duidelijke beelden waarin de hippocampus structuur presenteren maar ze melden BrdU immunoreactiviteit als percentage van de totale cellen in de korrel cellaag. Terwijl zij in dienst stereological tellen, het verstrekken van een maatregel per gebied of het volume waardevol zou zijn. In het algemeen, De geciteerde studies aanwezig organotypic culturen als een grondige uitwerking van postnatale hippocampus slice culturen, met toepassingen voor de studie van neurogenese en farmacologische verstoringen. Met deze techniek kan hippocampale plakken worden gehandhaafd tot 21 dagen in vitro (DIV) en geneesmiddelen kunnen aan het medium worden toegevoegd op elk punt in de kweekperiode om het effect op neurogenese bestuderen.
Ons doel was om een discrete, relatief homogene bevolking van DGCs label door middel van een korte 'pulse' toepassing van CldU gedurende 2 uur. Een algemeen gebruikt strategie voor het bestuderen van neurogenese impliceert identificatie van een neuron maturational stadium via immunohistochemische kleuring van verschillende endogene markers met een thymidine-analoog. Confocale fluorescentiemicroscopie en bevestigde de aanwezigheid van kernen die de thymidine analoge CldU opgenomen en zijn daarom actief mitose ondergaan gedurende de kweekperiode. Figuur 2 in vivo weefsel analyse kan worden aangepast voor slice cultures.
Specifiek, een veelgebruikte methode neurogenese onderzoek immunohistochemische kleuring uitvoert voor het microtubule geassocieerd proteïne, DCX, die sterk tot expressie in onvolwassen neuronen van dag 3-21 en de volwassen neurale marker, Calbindin (CABP), die volledig wordt uitgedrukt volgende 28 dagen na de mitose. Het fenotype van CldU + cellen werd bepaald met behulp van deze endogene markers 26.
Verbeterde werkwijzen voor het handhaven slice cultures gedurende langere perioden kunnen de additionele voordeel dat meer CldU + neuronen van de volwassen, CABP + stadium bereiken. Momenteel een beperking van de organotypische kweek benadering is dat het weefsel continu verandert gedurende de kweekperiode. Bijvoorbeeld, onmiddellijk na de hippocampus dissectie en plating van plakjes, de tissue heeft een breedte van ongeveer 400 pm. Na 2-3 weken in de incubatiekamer zal weefselcoupes beginnen te dun, waardoor een uiteindelijke breedte tussen 250-350 pm. Dit beperkt de hoeveelheid weefsel die kan worden gebruikt voor immunohistochemie en moet worden beschouwd bij het plannen hoeveel dieren te gebruiken voor een project. Additionele experimenten helpen karakteriseren van functionele veranderingen in hippocampale fysiologie die optreden in vitro.
Het protocol voor het snijden en kleuren van de hippocampus plakjes werd ontwikkeld om cellulaire en morfologische veranderingen die plaatsvinden tijdens de kweekperiode te analyseren. Slice culturen de gelegenheid bieden om het effect van verschillende farmacologische middelen te testen als de hippocampus DGCs passeren verschillende ontwikkelingsstadia tijdens de rijping en vertegenwoordigen een waardevol instrument voor toekomstige volwassen neurogenese studies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-chloro-2'-deoxyuridine (CldU) | MP Biomedicals | 105478 | Hazardous, Carcinogenic |
| Cell culture inserts, 30 mm diameter, 0.4 µm pore size | Thermo scientific | 140660 | Nuclon delta coating on these inserts provides better tissue adhesion and improves slice quality. |
| Conical Centrifuge tubes (sterile) | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Dissector scissors (angled to side) | Fine Science Tools | 14082-09 | |
| Minimum essential medium (MEM) | Gibco | 11095; liquid | Store at 4 °C |
| Eclipse Ni-U fluorescent microscope | Nikon | ||
| Glue for tissue | Krazy Glue | KG585 | Use minimum amount of glue to achieve adhesion as any tissue exposed to glue will be unusable for IHC. |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) (500 ml) | Gibco | 14025-092 | Store at 4 °C |
| Horse Serum Heat Inactivated (500 ml) | Gibco | 16050-122 | Make 50 ml aliquots and store at -20 °C |
| Kimwipes | Kimberly-Clarke | TW 31KYPBX | |
| Modified glass pipettes (bottom of Pasteur pipette removed and edge smoothed with Bunsen flame) | |||
| Petri Dish (100 mm x 15 mm) and (60 mm x 15 mm) | Fisher Brand | FB0875712 and FB0875713A | |
| Scalpel blades #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Scalpel handle #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Serological Pipettes | Sorfa Medical Plastic Co. | P8050 | |
| Standard Pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Sterile vacuum filter | Thermo-Scientific | 565-0020 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14054-13 | |
| Syringe driven filter unit | Millipore-Millex | SLGP033RS | |
| Tissue chopper with moveable stage | Stoelting | 51425 | |
| Fine tip paintbrush |
References
- Buchs, P. A., Stoppini, L., Muller, D. Structural modifications associated with synaptic development in area CA1 of rat hippocampal organotypic cultures. Brain research. Developmental Brain Research. 71 (1), 81-91 (1993).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Opitz-Araya, X., Barria, A.
- Muller, D., Buchs, P. A., Stoppini, L. Time course of synaptic development in hippocampal organotypic cultures. Developmental Brain Research. 71 (1), 93-100 (1993).
- Rio, J. A., Heimrich, B., Soriano, E., Schwegler, H., Frotscher, M. Proliferation and differentiation of glial fibrillary acidic protein-immunoreactive glial cells in organotypic slice cultures of rat hippocampus. Neuroscience. 43 (2-3), 335-347 (1991).
- Ziemka-Nalecz, M., Stanaszek, L., Zalewska, T. Oxygen-glucose deprivation promotes gliogenesis and microglia activation in organotypic hippocampal slice culture: involvement of metalloproteinases. Acta Neurobiologiae Experimentalis. 73 (1), 130-142 (2013).
- Subramanian, L., et al. Transcription factor Lhx2 is necessary and sufficient to suppress astrogliogenesis and promote neurogenesis in the developing hippocampus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (27), E265-E274 (2011).
- Strassburger, M., Braun, H., Reymann, K. G. Anti-inflammatory treatment with the p38 mitogen-activated protein kinase inhibitor SB239063 is neuroprotective, decreases the number of activated microglia and facilitates neurogenesis in oxygen-glucose-deprived hippocampal slice cultures. European Journal Of Pharmacology. 592 (1-3), 55-61 (2008).
- Sadgrove, M. P., Chad, J. E., Gray, W. P. Kainic acid induces rapid cell death followed by transiently reduced cell proliferation in the immature granule cell layer of rat organotypic hippocampal slice cultures. Brain Research. 1035 (2), 111-119 (2005).
- Wise-Faberowski, L., Robinson, P. N., Rich, S., Warner, D. S. Oxygen and glucose deprivation in an organotypic hippocampal slice model of the developing rat brain: the effects on N-methyl-D-aspartate subunit composition. Anesthesia and Analgesia. 109 (1), 205-210 (2009).
- Cho, S., Wood, A., Brain Bowlby, M. R. slices as models for neurodegenerative disease and screening platforms to identify novel therapeutics. Current Neuropharmacology. 5 (1), 19-33 (2007).
- Noraberg, J., et al. Organotypic hippocampal slice cultures for studies of brain damage, neuroprotection and neurorepair. Current Drug Targets. CNS And Neurological Disorders. 4 (4), 435-452 (2005).
- Berdichevsky, Y., et al. PI3K-Akt signaling activates mTOR-mediated epileptogenesis in organotypic hippocampal culture model of post-traumatic epilepsy. The Journal Of Neuroscience : The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 33 (21), 9056-9067 (2013).
- Koyama, R., et al. GABAergic excitation after febrile seizures induces ectopic granule cells and adult epilepsy. Nature Medicine. 18 (8), 1271 (2012).
- Staley, K. J., White, A., Dudek, F. E. Interictal spikes: harbingers or causes of epilepsy. Neuroscience Letters. 497 (3), 247-250 (2011).
- Lee, H., Lee, D., Park, C. H., Ho, W. K., Lee, S. H. GABA mediates the network activity-dependent facilitation of axonal outgrowth from the newborn granule cells in the early postnatal rat hippocampus. The European Journal Of Neuroscience. 36 (6), 2743-2752 (2012).
- Raineteau, O., et al. Conditional labeling of newborn granule cells to visualize their integration into established circuits in hippocampal slice cultures. Molecular and Cellular Neurosciences. 32 (4), 344-355 (2006).
- Raineteau, O., Rietschin, L., Gradwohl, G., Guillemot, F., Gahwiler, B. H.
- Kamada, M., et al. Intrinsic and spontaneous neurogenesis in the postnatal slice culture of rat hippocampus. The European Journal Of Neuroscience. 20 (10), 2499-2508 (2004).
- Kim, H., Kim, E., Park, M., Lee, E., Namkoong, K. Organotypic hippocampal slice culture from the adult mouse brain: a versatile tool for translational neuropsychopharmacology. Progress in Neuro-Psychopharmacology & Biological Psychiatry. 41, 36-43 (2013).
- Legradi, A., Varszegi, S., Szigeti, C., Gulya, K. Adult rat hippocampal slices as in vitro models for neurodegeneration: Studies on cell viability and apoptotic processes. Brain Research Bulletin. 84 (1), 39-44 (2011).
- Sadgrove, M. P., Laskowski, A., Gray, W. P. Examination of granule layer cell count, cell density, and single-pulse BrdU incorporation in rat organotypic hippocampal slice cultures with respect to culture medium, septotemporal position, and time in vitro. The Journal of Comparative Neurology. 497 (3), 397-415 (2006).
- Mielke, J. G., et al. Cytoskeletal, synaptic, and nuclear protein changes associated with rat interface organotypic hippocampal slice culture development. Developmental Brain Research. 160 (2), 275-286 (2005).
- Fabian-Fine, R., Volknandt, W., Fine, A., Stewart, M. G. Age-dependent pre- and postsynaptic distribution of AMPA receptors at synapses in CA3 stratum radiatum of hippocampal slice cultures compared with intact brain. European Journal of Neuroscience. 12 (10), 3687-3700 (2000).
- Laplagne, D. A., et al. Functional convergence of neurons generated in the developing and adult hippocampus. PLoS Biology. 4 (12), e409 (2006).
- McDonald, H. Y., Wojtowicz, J. M. Dynamics of neurogenesis in the dentate gyrus of adult rats. Neuroscience Letters. 385 (1), 70-75 (2005).
- Stone, S. S., et al. Functional convergence of developmentally and adult-generated granule cells in dentate gyrus circuits supporting hippocampus-dependent memory. Hippocampus. 21 (12), 1348-1362 (2011).
- Wang, S., Scott, B. W., Wojtowicz, J. M. Heterogenous properties of dentate granule neurons in the adult rat. Journal of Neurobiology. 42 (2), 248-257 (2000).
- Wojtowicz, J. M., Kee, N. BrdU assay for neurogenesis in rodents. Nature Protocols. 1 (3), 1399-1405 (2006).
- Fritsch, R. S. E. R., Weibel, E. R. Stereological Methods, Vol. 1: Practical Methods for Biological Morphometry. Zeitschrift für Allgemeine Mikrobiologie. 21 (8), 630-630 (1981).
- Bunk, E. C., Konig, H. G., Bonner, H. P., Kirby, B. P., Prehn, J. H. NMDA-induced injury of mouse organotypic hippocampal slice cultures triggers delayed neuroblast proliferation in the dentate gyrus: an in vitro model for the study of neural precursor cell proliferation. Brain Research. 1359, 22-32 (2010).
- Kolb, B., Pedersen, B., Ballermann, M., Gibb, R., Whishaw, I. Q. Embryonic and postnatal injections of bromodeoxyuridine produce age-dependent morphological and behavioral abnormalities. The Journal Of Neuroscience : The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 19 (6), 2337-2346 (1999).
- Morris, S. M. The genetic toxicology of 5-bromodeoxyuridine in mammalian cells. Mutation Research. 258 (2), 161-188 (1991).
- Bannigan, J., Langman, J. The cellular effect of 5-bromodeoxyuridine on the mammalian embryo. Journal Of Embryology And Experimental Morphology. 50, 123-135 (1979).
- Breunig, J. J., Arellano, J. I., Macklis, J. D., Rakic, P. Everything that glitters isn't gold: a critical review of postnatal neural precursor analyses. Cell Stem Cell. 1 (6), 612-627 (2007).
- Duque, A., Rakic, P. Different effects of bromodeoxyuridine and [3H]thymidine incorporation into DNA on cell proliferation, position, and fate. The Journal Of Neuroscience : The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 31 (42), 15205-15217 (2011).
- Namba, T., Mochizuki, H., Onodera, M., Namiki, H., Seki, T. Postnatal neurogenesis in hippocampal slice cultures: early in vitro labeling of neural precursor cells leads to efficient neuronal production. Journal of Neuroscience Research. 85 (8), 1704-1712 (2007).
