Introduction
Se estima que la mitad de la población de Estados Unidos experimenta una fractura por la edad de 65 años 1. Para los pacientes con fracturas tratadas quirúrgicamente, 500.000 procedimientos implican el uso de un injerto de hueso 2 y se espera que esta cifra aumente con una población cada vez más envejecida 3 . Aunque el hueso es uno de los pocos órganos que tiene la capacidad para sanar completamente sin dejar cicatriz, hay casos en que el proceso falla 3,4. Dependiendo de las circunstancias y la calidad del tratamiento, 30.2% de las fracturas de huesos largos fallar, lo que resulta en la no unión 3,5. Si bien sigue habiendo cierto debate sobre la definición, pseudoartrosis, lesiones óseas críticos de tamaño o no sindicalizados generalmente se refiere a una lesión que no sana durante toda la vida natural de la materia 6. Para fines experimentales, esta duración se acorta el tiempo promedio requerido para la curación completa de una lesión de tamaño medio hueso. Lesiones óseas no sindicalizados se producen por numrazones erous, pero los principales factores incluyen trauma extremo que resulta en una brecha crítica de tamaño, infección, mala angiogénesis, el consumo de tabaco, o la capacidad de regeneración ósea inhibida debido a la enfermedad o la edad de 7 años. Incluso si no uniones son tratados con éxito, puede costar más de $ 60,000 por procedimiento, dependiendo del tipo de lesión y los enfoques utilizados 8.
En casos moderados, se emplea un injerto óseo autólogo. Esta estrategia implica la recuperación del hueso de un sitio donante y la implantación en el sitio de la lesión. Si bien este enfoque es extremadamente eficaz, el volumen de hueso derivado del donante disponible es limitada y el procedimiento implica una cirugía adicional, que se traduce en dolor persistente en muchos pacientes 9,10. Además, la eficacia del injerto de hueso autólogo es dependiente de la salud del paciente. Los sustitutos óseos fabricados con materiales sintéticos o hueso de cadáver procesados son abundantemente disponibles 11-13, pero HÃve limitaciones significativas, incluyendo las propiedades pobres de adhesión de la célula huésped, la reducción de osteoconductividad, y el potencial para el rechazo inmune 14. Por tanto, existe una necesidad urgente de tecnologías de regeneración ósea que son seguros, eficaces y ampliamente disponibles.
Nuestra capacidad para mejorar las estrategias de regeneración de hueso depende fundamentalmente de la capacidad de imitar traumatismo óseo grave en animales de laboratorio, pero la generación y la estabilización de las lesiones óseas grandes es técnicamente difícil. En la mayoría de los casos, grave trauma hueso largo es imitado experimentalmente mediante el establecimiento de un defecto que no se cura de forma natural. Aunque puede variar con la especie 15, esto se logra mediante la eliminación completa de un segmento de hueso que es mayor que 1,5 veces el diámetro de la sección transversal del hueso 16. El hueso se estabiliza luego con un implante metálico para mantener la orientación correcta de los bordes de la fractura y permitir la movilidad. Debido a su pequeño tamaño y la fragilidad desus huesos largos, el establecimiento de este tipo de lesiones en los ratones están más allá de las capacidades de la mayoría de los grupos de investigación. Como tal, los modelos de defectos de huesos largos se limitan a ratas y animales más grandes. Sin embargo, los ratones ofrecen ventajas significativas en investigación que pueden ser modificados y criados como cepas inmunocomprometidos que no rechazan las células y tejidos humanos genéticamente.
Para las aplicaciones basadas en células humanas, los ratones inmunodeprimidos son atractivas para trabajar con ellos porque son fisiológicamente bien caracterizados, fácil de casa, rentables y de fácil analizaron radiográfica como microscópicamente. De suma importancia es que los ratones inmunodeprimidos no rechazan las células de diferentes especies, incluyendo los seres humanos. Su pequeño tamaño también permite el ensayo de un número muy pequeño de células o volúmenes de andamios experimentales en aplicaciones ortopédicas. Se han descrito varios modelos murinos ortopédicos que permitirse diversos grados de estabilidad ósea 17,18. Aquellos systems que resultan en niveles muy altos de estabilidad, tales como fijadores externos y las placas de bloqueo se curan predominantemente por la osificación endocondral intramembranous aunque la curación ha sido reportado 19. Por el contrario, las que permiten algunos micro y / o macro-movimiento, como las que emplean pasadores medulares no fijadas o parcialmente fijos, por lo general se curan con un predominio de la osificación endocondral 20,21. Unión retardada o defectos no sindicalizados de los huesos largos son particularmente difíciles de lograr en los ratones debido al nivel adicional de estabilización requerida. Sin embargo, se ha informado de una serie de enfoques, incluyendo pasadores medulares con clavos entrelazados, placas de bloqueo y fijadores externos 22. Estos sistemas generalmente funcionan bien, pero teniendo en cuenta su diseño complicado que puede ser técnicamente difícil de instalar. Por ejemplo, García et al. 23 ideó un sistema de pasador de enclavamiento elegante para su uso en ratones, pero el procedimiento implica incisiones en dos sitios separadoss y una amplia modificación del fémur para acomodar los pasadores. Estos procedimientos se realizaron bajo un microscopio de disección.
En este documento, se describe un sencillo pasador medular femoral con un collar central diseñado para evitar el cierre de un déficit óseo 3 mm y también delinear los bordes originales del defecto. Mientras que el pasador no se fija en el hueso, el tamaño preciso de pasador y el diámetro de escariado de los resultados cavidad medular en la interferencia suficiente para minimizar el movimiento de torsión (Figura 1). Con una cuidadosa selección de edad endogámica, género y ratones de la cepa emparejados, el resultado es un no-uniondefect hipertrófica altamente reproducible 22 que puede ser fácilmente evaluada radiológicamente. Además regiones de interés pueden ser definidos de forma reproducible después de micro-tomografía computarizada (μCT) para la medición de la formación de hueso de novo y los parámetros histomorphological. Los pasadores se prototipos en nuestro laboratorio utilizando herramientas disponibles.
Figura 1: Principio Experimental resumen esquemática del modelo de defecto segmentario.. El segmento central 3 mm de un fémur murino 9-10 mm se extirpa quirúrgicamente (izquierda). Un tubo de acero quirúrgico de calibre 19 de 3 mm de largo se pasa más de un 9 mm de largo, 22 G tubo de acero inoxidable y se fija con adhesivo en el centro exacto (derecha). El pasador resultante se encaja en los canales medulares de las porciones proximal y distal restantes del fémur con el collar 19 G sustituyendo el segmento de 3 mm de hueso (por debajo de, centro).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOTA: Este protocolo está diseñado para (Nu / J) ratones desnudos hembra (18-25 g, 6 semanas) adquiridos de Jackson Laboratories. Desde cepas de ratones varían ligeramente en función de la anatomía y la tasa de crecimiento, le aconsejamos que la fabricación de pasadores está optimizada para la cepa, el sexo y la edad de los destinatarios antes de su implantación en sujetos vivos. Si las cepas se seleccionan cuidadosamente, el ajuste de interferencia entre el pasador y la cavidad ósea es altamente reproducible. Procedimientos para la vivienda, la alimentación y la cría de animales en general están más allá del alcance de este protocolo, pero todos los ratones fueron alojados de conformidad con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (8ª edición) y las políticas institucionales establecidas por el Cuidado de Animales e Institucional el empleo Comisión (IACUC) y el Departamento de Medicina Comparada (DCM) a Scott y el Hospital Blanca.
1. La fabricación de pernos
- Cortar una longitud de 9 mm de 22 G tubo hipodérmico de acero, y una longitud de 3 mm de tubo de 19 g usando un disco de corte de alta resistencia de fibra de vidrio de diámetro 23,8 mm reforzada montada en una herramienta rotativa. Use pequeños alicates de punta fina para inmovilizar el tubo (Figura 2, arriba). Use protección ocular adecuada y manejar la herramienta rotatoria con cuidado.
- Colocar una pequeña cantidad (aproximadamente 10 l) de adhesivo de cianoacrilato a la mitad del eje de 9 mm. Pasar el collar 3 mm sobre el eje 9 mm hasta que en el centro y girar para distribuir uniformemente el pegamento entre el collar y el eje. Medir las dimensiones con un par de calibradores digitales y comparar con la Figura 1. Dejar reposar durante al menos 15 h (Figura 2A, centro).
- Utilice un disco de esmeril impregnado grano 220 para eliminar las rebabas y pegamento excesivo.
- Uso de la herramienta rotativa, pulir el pasador con un disco de pulido sentido.
- Enjuague con agua desionizada y secar con COMPREaire ssed.
- Prueba de integridad mediante la colocación de una aguja roma hipodérmica 19 G sobre el eje del pasador recién hecho y de empuje contra el collar. Asegúrese de que el collar puede resistir aproximadamente 25 g de peso.
- Enjuague el pasador en salina tamponada con fosfato filtrada de forma estéril (Figura 2B, parte superior). Asegúrese de que el eje del pasador encaja perfectamente en la cavidad medular femoral con el color del collar contra los bordes de corte del hueso (Figura 2C). Varias configuraciones de Prototipos para los fines específicos del estudio y el receptor (Figura 2D). Asegúrese de que los extremos del pasador penetran en el hueso trabecular de la diáfisis a fin de maximizar la fijación y mejorar el ajuste de interferencia (Figura 2E).
NOTA: Se recomienda que el ajuste se ha probado en muestras de hueso antes de la implantación en ratones vivos (por ejemplo, la Figura 2C). - Use un 4 mm diámetro de la fresa punch-biopsia para cortar un cilindrode una gruesa lámina de 5 mm de esponja de gelatina quirúrgica. Utilice un bisturí para cortar el cilindro a 3 mm de longitud y pasar una aguja hipodérmica 20 G a lo largo de la longitud del cilindro para generar un agujero (Figura 2A, a continuación).
NOTA: Hemos encontrado que el posicionamiento de una gelatina o colágeno andamio en el sitio del defecto mejora la retención celular e induce el crecimiento longitudinal a lo largo del eje del hueso. - Pasar el cilindro de espuma de gelatina sobre el pasador y alinearse con el collar (Figura 2B, centro) y en un ciclo de autoclave seco a 120 ° C a 15 psi. La espuma de gelatina se secará y se oscurecen en el color (Figura 2B, más abajo).
2. Técnica quirúrgica
NOTA: El siguiente procedimiento está escrito observando todas las pautas marcadas por la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (8ª edición). Tenga en cuenta todas las políticas adicionalesestablecido por el IACUC local y asegurar un protocolo uso de animales aprobada por IACUC (o equivalente) en su sitio antes de proceder con las siguientes secciones.
Figura 3: Los instrumentos quirúrgicos. (A) kit quirúrgico. Micro-taladro (1), la rueda de corte (2), sutura absorbible (3), sutura exterior (4), hojas de bisturí (5), mango de bisturí (6), alfileres medulares estériles envueltos en papel de aluminio (7), medidor de profundidad medular forma hecha tubo hipodérmico (8), pinzas de nariz fina (9), de ratas de dientes con fórceps (10), agujas de ensanche contundentes (11), conductores de aguja (12), pequeñas pinzas (13), unas tijeras finas (14), periostótomo (15), fórceps modificados Kern (16) (B):. Modificaciones necesarias para producir al estilo Kern hueso-apretones para los ratones.
- Seleccione una sala quirúrgica o procedimiento de laboratorio limpia, con una puerta que se puede cerrar y sin tráfico. Desinfectar un surfac trabajo adecuadoE con un limpiador desinfectante basado cuaternario de grado clínico.
- Mientras que el uso de guantes estériles desechables y bata, configurar un campo estéril de aproximadamente 60 x 90 cm 2 en la superficie de trabajo saneado con cortinas de tela tratado al autoclave.
NOTA: Es recomendable tener un asistente que retire el embalaje exterior y presentar los materiales estériles para la creación de el campo investigador. - Coloque una almohadilla térmica desinfectados instalado en un re-circulación de agua caliente en la cortina y cubrir con cortinas estériles desechables. Calentar un esterilizador de cuentas a la temperatura de funcionamiento (250-265 ° C, esto toma hasta 30 minutos).
- En el campo estéril, organizar el equipo quirúrgico (Figura 3) para facilitar el acceso a todos los componentes. Además, proporcionar una gasa estéril de algodón (2 x 2 pulgadas 2), Q-tips estériles, un recipiente de acero estéril (500 ml) que contiene solución salina estéril (0,9% w / v) aplicadores, y clorhexidina desinfectantes / isopropil alcohol quirúrgico.
- Montar una pequeñaunidad animal anestesia junto al campo estéril con una cámara de inducción y boquilla de cono de conformidad con la orientación veterinaria y el manual de usuario. Utilice el oxígeno de grado clínico como el suministro de gas y el isoflurano, USP.
Figura 4: Procedimiento quirúrgico. (AC) de aproximación y de la exposición del fémur. (DE) Elevación y cortes. (FK) escariado y dimensionamiento de canales medulares.
Figura 5: Procedimiento quirúrgico. (AB) Instalación de alfiler. (CD) de cierre. (E) Imagen típica de correctamente posicionado pasador 24 horas después de la cirugía.
- Coloque un ratón en la cámara de inducción del sistema de anestesia y set la salida a 2 L min -1 O 2 y la concentración de isoflurano al 3% (v / v).
- Compruebe que el ratón está inconsciente dentro de 1 min; elevar la concentración al 4% (v / v) si es necesario. Retire el ratón, el lugar en el campo estéril con la almohadilla colocada debajo y aplicar el cono de la nariz. Transferencia fluya hacia el cono, y reducir el isoflurano al 2,5%, espere 20 segundos más, y prueba de plano quirúrgico adecuado de acuerdo con la política institucional. Por lo general, la falta de un reflejo de la extremidad posterior cuando apretó suavemente es adecuada para determinar la anestesia adecuada.
- Durante todo el proceso, tener un monitor auxiliar para una fuerte respiración regular y coloración rosada de las extremidades y la región de la boca para garantizar un nivel adecuado de oxigenación mientras estaba inconsciente. Ajuste la anestesia en conformidad con la orientación veterinaria y política institucional, si es necesario. Aplicar estéril lágrimas artificiales ungüento lubricante (15% (v / v) de aceite mineral, 83% (v / v) whvaselina ite) a los ojos.
- Ponga el ratón sobre un lado con el miembro trasero mirando hacia arriba en un nuevo paño desechable. Si es necesario, retire la piel con una maquinilla eléctrica o crema depilatoria. Limpie el sitio con solución salina estéril y quitar la cortina adicional con el exceso de piel. Colocar un nuevo paño fenestrado sobre el ratón con el fin de cubrir todas las partes, pero la totalidad de las extremidades posteriores (Figura 4A), pero mantener la vista de la cara y de la pata para supervisar la coloración y la respiración.
- Ubicar los extremos proximal y distal del fémur y la incisión en la piel durante 5-10 mm a lo largo del eje longitudinal (Figura 4B). Se separa la capa de la piel de la fascia con un bisturí # 15, dejando al descubierto una aproximación lateral al fémur mediante el bíceps femoral y vasto lateral. Localizar donde los septos de ambos músculos cumple (que es una línea de tejido blanco contra la coloración rosa del músculo). Con un bisturí, diseccionar cuidadosamente a lo largo de la frontera intermuscular hastaEl fémur es visible (Figura 4B).
- Desarrollar la incisión con un elevador perióstico roma para exponer la totalidad de la diáfisis (Figura 4C). Utilice el ascensor para exponer aún más las centrales de dos tercios del fémur, teniendo cuidado de conservar el paquete neurovascular posterior en el lado medial (Figura 4D). Raspar suavemente el tejido blando del hueso con un bisturí, y seque con un Q-tip o equivalente estéril.
- Localice el centro del fémur con pinzas si es necesario y marca con un bisturí o un marcador estéril, luego marque 1,5 mm proximal y distal del centro. Agarrar suavemente el fémur usando un par de pinzas finas nariz formado previamente en el estilo Kern para evitar una presión excesiva sobre el hueso.
NOTA: Las dimensiones exactas para las modificaciones se proporcionan en la figura 3B. Es aconsejable probar las pinzas en una muestra sacrificados antes de su uso para asegurarse que el hueso no se rompe bajo presión requerirád para la inmovilización durante el corte. - Usando un taladro fino equipado con una rueda de corte con recubrimiento de diamante de grano fino (8 mm de diámetro x 0,1 mm de ancho), hacer el primer corte con el ascensor en lugar de proteger a los tejidos debajo (Figura 4E). Elevar el fémur de corte a 45 ° mientras que sostiene firmemente la extremidad de la diáfisis, hacer el segundo corte, la eliminación de un segmento de 3 mm.
NOTA: La protección de la cara se recomienda en esta etapa. - Con el hueso inmovilizado por fórceps, escariar cuidadosamente las cavidades medulares de cada extremo con una aguja roma hipodérmica 23 G. El uso de un pre-hechos profundidad de calibre a partir de una longitud de tubo de 22 G colocado en la tubería 19 G (Figura 3A, i TEM 8), evaluar la profundidad de la cavidad medular escariado y asegurarse de que es 3 mm (Figura 4F-K) . Si la cavidad medular resiste el medidor de profundidad 22 G, resma de nuevo con una aguja roma hipodérmica 22 G.
- Inserte con cuidado el pasador medular en el proximal distal entonces c medularavities para llevar el fémur de vuelta a su longitud original y establecer un establo brecha de 3 mm (Figura 5A, B). Si es necesario, aplicar una pequeña cantidad de tensión manual para lograr un buen ajuste de interferencia de la varilla con el hueso cortical del fémur. Asegúrese de que el pasador se ajusta perfectamente dentro de las cavidades medulares de ambos lados y los bordes de corte son el hueso a ras con el collar. Si hay un hueco, escariar una vez más con una aguja roma 22 G.
- Vuelva a colocar el músculo y el tejido periférico sobre el perno y cerrar con una continua absorbible 5-0 sutura (Figura 5C). Cerrar incisión de la piel con 5-7 nudo cuadrado nylon 5-0 suturas y sellado con adhesivo quirúrgico (Figura 5D).
3. Procedimientos postoperatorios
- Después de cerrar la incisión de la piel, retirar la anestesia, pero permiten O 2 permanezca fluye hasta que el ratón comienza a moverse; este debe tener menos de 1 min. Si el ratón se mantiene inmóvil después de 5 minutos deO 2 administración, consulte las políticas institucionales en materia de intervención veterinaria.
- Cuando el ratón comienza a moverse, suavemente transferirlo a una jaula que contiene preferiblemente, ropa de cama autoclave seco.
- Publicar un nido de tipo iglú en cada jaula y el ratón se retirará en ella, reduciendo el movimiento. Compruebe que el ratón se recupera la movilidad de las extremidades posteriores 5-10 minutos después de la recuperación de la conciencia.
- Realizar vigilancia postoperatoria diaria de acuerdo con las políticas institucionales. Proporcionar hidratación gelatinizada y comida en el suelo de la jaula para los primeros 5-7 días y administrar analgesia postoperatoria y seguimiento de conformidad con las políticas institucionalmente aprobados.
NOTA: Administramos 0,05-0,1 mg kg -1 buprenorfina 24 con 0,25 ml de solución salina por vía subcutánea, dos veces al día durante los primeros 3 días y, posteriormente, si el ratón no recupera utilidad normal.
- Después de las primeras 24 horas de recuperación, realice las imágenes de rayos X en animales vivos, under anestesia para visualizar la colocación de pin (Figura 4E). Si se dislocó el pasador, considere la cirugía de revisión inmediata.
- En el día 7 después de la cirugía, retire suturas bajo anestesia y la casa en grupos de acuerdo con las políticas ganaderas institucional.
- Después de 2-5 semanas, con humanidad eutanasia a los animales, de acuerdo con la Asociación Americana de Medicina Veterinaria aprobaron métodos para la eutanasia 25.
NOTA: Una inyección intraperitoneal de disponible comercialmente cóctel de barbitúricos-combinación eutanasia es eficaz y humano, pero las políticas institucionales locales sobre la eutanasia deben ser seguidas. - Diseccionar cuidadosamente lejos la extremidad posterior mediante la exposición del fémur proximal y la pelvis del lado medial. Presione suavemente la articulación hacia el interior desde el lado lateral de la extremidad mientras se separa la cabeza del fémur desde el acetábulo (la cavidad de la cadera) con un escalpelo. Cortar restante músculo y la piel con un bisturí afilado o micro-tijeras, liberandotoda la extremidad formar la pelvis. Con un fuerte par de gubia o tijeras pesadas, cortar la extremidad posterior (tibia / peroné) aproximadamente 5 mm por debajo de la articulación de la rodilla.
NOTA: Se recomienda que todas las muestras se almacenan en una manera idéntica antes del análisis. - Quite la piel, pero dejar el músculo en su lugar. Fijar el tejido en formalina al 10% tamponada suplementado con 10 mM CaCl 2 fijador durante 1 semana seguido de almacenamiento en tampón fosfato salino suplementado con 10 mM CaCl 2 por hasta 1 mes antes de la formación de imágenes. Realizar la fijación y almacenamiento a 4 ° C. Alternativamente, escanear las muestras inmediatamente sin fijación.
4. Análisis de las Muestras
NOTA: La consolidación ósea puede ser evaluada por una amplia variedad de metodologías que están más allá del alcance de este protocolo. El siguiente es un método que se ha empleado con éxito utilizando un microCT espécimen (μCT) generador de imágenes. Se recomienda que los siguientes parámetros are probado inicialmente, y optimizado para las necesidades específicas del proyecto.
- Envolver la muestra en una capa delgada de película de sellado de plástico y la posición verticalmente en la cámara de instrumento. Asegúrese de que el fémur es perpendicular a la etapa de la muestra durante toda la exploración. Establezca la exploración a los siguientes parámetros; Tensión = 29 kV, corriente = 661 mu, potencia = 19 W, tamaño de píxel de imagen (m) = 21,00; Rotación de 360 grados = yes; un promedio de marco = en (5); etapa de rotación (grados) = 1.00, movimiento aleatorio = en. Guarde las imágenes como archivos JPEG en una sola carpeta de destino por ciclo (por ejemplo, la figura 6A).
NOTA: La exploración debe ser completa en 57 min. - Utilizar el software de reconstrucción para generar imágenes axiales en base a los siguientes parámetros; suavizado = en (4), la compensación de la desalineación = encendido, reducción de artefactos anillo = en (5), el haz de endurecimiento de corrección (40%), la rotación CS (grados) = 0,00. Ajuste la salida a 2.000-15.000 unidades Hounsfield. Guarde las imágenes como archivos JPEGen una sola carpeta de destino por exploración.
- Usando las imágenes axiales y software analítico, definir la región de interés (ROI) estableciendo primero los bordes proximal y distal del defecto original. Lograr esto seleccionando las secciones que abarcan sólo el collar. Debido a que el cuello es más grueso que el clavo medular, estas secciones se definen fácilmente (Figura 6B, izquierda). Excluir el collar de los cálculos dibujando una zona de exclusión alrededor de él (con un margen de 100 micras) y transferir la zona a cada una de las secciones en el retorno de la inversión (Figura 6B, derecha).
NOTA: los momentos de inercia polar, reconstrucciones 3D y cálculos tales como el volumen de hueso nuevo (Figura 6C, D) fácilmente se puede lograr utilizando el software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Los ratones se recuperan la conciencia y de las extremidades posteriores movilidad 5-10 minutos después de la retirada de la anestesia. Durante los primeros 5 días, es aconsejable para albergar a los ratones individualmente e introducir el enriquecimiento ambiental para evitar el exceso de uso de la extremidad. Para este propósito, los nidos de tipo iglú reducen la necesidad de la construcción del nido y animan descanso. También hemos observado que la provisión de alimentos y de hidrogel en el suelo de la jaula reduce la probabilidad de desplazamiento pin. Durante el período de 5 días, la analgesia debe administrarse según sea necesario de acuerdo con las políticas aprobadas institucionalmente. La pérdida de peso de hasta aproximadamente 15% del peso de pre-operatorio original es posible durante el período postoperatorio 5-día. Veinticuatro horas después de la cirugía, se recomiendan radiografías de la extremidad afectada para evaluar pin-colocación. Los pasadores deben ser completamente insertados en proximal y distal de los canales medulares con los bordes de la ras defecto contra el collar (Figura 2C,2E, Figura 5E, y la Figura 6A). En raras ocasiones (<5% de los casos), los pasadores pueden quedar dislocado en las primeras etapas de protocolos de uso de sanación y animales debe prever la cirugía de revisión si esto ocurre. Si bien es técnicamente difícil de cuantificar el movimiento de torsión en fémures murinos, palpación manual de especímenes confirmó que el movimiento de torsión y longitudinal es marginal después de 7 días como tejido conectivo se acumula alrededor de la clavija. Después de 5 días de monitoreo post-operatorio, los ratones pueden ser devueltos a la vivienda comunal estándar como por políticas aprobadas institucionalmente.
Sin la intervención terapéutica, los bordes del defecto normalmente se extienden 0,5 mm durante 21 días, pero en casos raros, el crecimiento de hueso puede ser de hasta 1 mm (Figura 6A). Arrestos de crecimiento óseo después de este período que las etapas inflamatorias y anabólicos de cese de regeneración que resulta en un defecto no sindical. Después de 14 a 21 días de curación, el volumen of de novo de hueso se puede determinar fácilmente a partir de las imágenes axiales generadas por la exploración μCT. Uso de la exploración, los procedimientos de reconstrucción y selección de ROI axiales descritos en el protocolo, el volumen de hueso nuevo aumenta con el tiempo generado, pero generalmente no exceden de un total de 1 mm 3 en ausencia de la intervención terapéutica (Figura 6C) en comparación con 6- 7 mm 3 en una región anatómica equivalente de fémur ileso. Mientras que las pruebas biomecánicas convencional es técnicamente difícil debido al tamaño de muestra y la naturaleza del método de fijación, el momento polar de inercia (PMI), una estimación de la capacidad de un material para resistir la torsión basada en el área de la sección transversal y la densidad, ha sido demostrado que representan una estimación adecuada de la fuerza en los huesos largos 26,27. Usando este método, las secciones transversales axiales a varias distancias de los bordes de la lesión pueden ser seleccionados para el análisis. Después de 21 días, el PMI de hueso de novo 0,25 mm from la lesión bordes rangos de entre 0,05-0,35 mm 4 en comparación con 0,02 a 0,08 mm 4 en el centro de la lesión que confirma aún más la presencia de pseudoartrosis en los casos no tratados (Figura 6D). El PMI del fémur no lesionado en una ubicación anatómica equivalente normalmente oscila entre 0,5-0,7 mm 4 usando las condiciones descritas aquí.
Figura 6: Los resultados típicos. Exploraciones (A) de rayos X de los fémures en días 7, 14 y 21 después de la cirugía que demuestra el crecimiento interno limitado de hueso Panel B:. Representación esquemática de los parámetros de ROI para la medición ósea volumétrica. Sección transversal axial Representante con una zona de exclusión (EX) sobre el pasador de cuello incluido un margen de 100 micras para excluir la medición de artefactos en la interfase metal-tejido (izquierda). Gammagrafía ósea completa (right, arriba) que demuestra la ROI longitudinal definido por las secciones de hueso entre los bordes del collar con el tejido óseo original, excluido (EX). Los bordes lesión original se encuentran en las secciones axiales utilizando la diferencia entre el diámetro del pasador y el collar (derecha, abajo). (C) mediciones volumétricas típicos en días 7, 14 y 21 después de la cirugía sin la intervención terapéutica (significa con desviaciones estándar, n = 3). (D) las mediciones del PMI en secciones axiales 0,25 mm de los extremos proximal y la lesión distal y punto medio (medios con desviaciones estándar, n = 3). (incluidas en parafina tricrómico manchados E) de Masson sección (izquierda) cortado en la dirección longitudinal demostrando excrecencia ósea que consiste en cartílago (CA) y el hueso esponjoso (b) (barra de escala = 0,5 mm). La posición del campo se indica en el escaneo de rayos X (derecha). (F) no decalcified, metacrilato de metilo incrustado sección coronal del defecto de 1 día de edad, se tiñeron con hematoxilina y eosina (barra de escala = 1,0 mm). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Descalcificación de los tejidos tarda típicamente 10-14 días utilizando condiciones estándar, y se monitoriza fácilmente mediante el escaneo de rayos X. Es aconsejable conservar cierta musculatura en las muestras durante la descalcificación para mejorar la estabilidad durante la manipulación. Después de la descalcificación, pasadores se pueden quitar con cuidado con un escalpelo afilado que permite la inclusión en parafina y la histología. Tinción de Tricrómico de Masson de las secciones longitudinales permite la visualización del crecimiento de hueso endocondral con un borde de ataque del cartílago (CA), seguido de hueso esponjoso (cb) (Figura 6E). Mientras que ocurrirá inevitablemente algún daño durante la disección, la estructura histológica del huesoy el tejido conectivo sigue siendo claro si el pasador se retira cuidadosamente. Alternativamente, metil metacrilato y la incrustación de seccionamiento de secciones no desmineralizadas se pueden realizar con el pasador en su lugar (Figura 6F).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En este documento, se describe un método simple para generar un defecto crítico tamaño pin-estabilizada del fémur murino utilizando estándar de laboratorio y equipo veterinario. Mientras que el montaje de los pasadores y el procedimiento quirúrgico en sí mismo requiere práctica, está dentro de las capacidades de un científico de investigación biomédica bien entrenado o veterinario.
El pasador se coloca en el canal medular sin fijación adicional, haciendo que el procedimiento técnicamente más viable que los enfoques más complicadas que emplean fijadores externos o tornillos de enclavamiento. Si bien puede producirse algún movimiento torsional durante las primeras etapas de curación, esto se reduce al mínimo mediante una cuidadosa atención a la diámetro del pasador y escariado adecuado de la cavidad medular con el fin de lograr un ajuste de interferencia firme entre el implante y el endostio. Con una cuidadosa selección de pura cepa y la congruencia de la edad y el género, el ajuste se hace de forma reproducible robusta dentro de unos pocos días. Sin embargo, wiº el advenimiento de técnicas de impresión en 3D, se espera que el movimiento torsional se puede reducir aún más por versiones más sofisticadas de la clavija que incorporan superficies rugosas y / o de los sitios de fijación de púas. La facilidad de fabricación pin y la disponibilidad de una amplia variedad de tamaños de tubos hipodérmicas también permiten la optimización de la técnica para prácticamente cualquier ratón endogámica adulto, independientemente del fenotipo de hueso natural o experimental.
El diseño único de cuello pin sirve para dos propósitos: (i) para prevenir el estrechamiento aberrante del defecto y el daño de las extremidades hueso a través de deslizamiento longitudinal, y (ii) para proporcionar puntos de referencia que definen los bordes originales del defecto. Como tales mediciones, volumétricas y PMI se pueden hacer fácilmente utilizando un escáner μCT espécimen tal como una SKYSCAN 1174. De hecho, este enfoque permite un nivel de cuantificación que no se obtiene fácilmente con técnicas de fractura de tamaño no estándar críticos que a menudo exhiben variable o Poorly definido lesiones. Mientras que una unidad μCT es preferible para la cuantificación de la curación, la evaluación por evaluación objetiva de las imágenes de rayos X ortogonales o técnicas de análisis de imagen en 2D puede representar alternativas factibles. Debido a su pequeño tamaño y relativamente bajo contenido mineral, extremidades murinos se pueden preparar fácilmente para la histología y se montaron como especímenes enteros para histomorfometría convencional. Esto descarta cuestiones de muestreo con frecuencia se enfrentan los investigadores que realizan análisis histomorfométricos de fracturas de animales grandes.
En los experimentos descritos aquí, el tiempo de curación fue relativamente corto a las 3 semanas, lo que corresponde a la fase rápida, anabólico de la curación del hueso. A partir de entonces, la remodelación ósea es un proceso muy lento 28. Generalmente, si puenteo no se observa después de 4 semanas, es poco probable que ocurra y de acuerdo curación, se observa muy poco crecimiento óseo adicional después de 4 semanas en este sistema. Por otra parte, un hueco de 3 mm cumple con los criterios de clave y un. 16 l para un defecto de tamaño crítico y Garcia et al. demostró que una brecha tan estrecho como 1,8 mm no se cura suficientemente después de 10 semanas y esto podría retrasarse a 15 semanas con pericondrio despojado 23.
Mientras que el tamaño y la fragilidad de los huesos presentan serios desafíos técnicos para la investigación ortopédica, el uso de ratones es ventajoso de muchas maneras. Por ejemplo, hay una variedad de cepas inmunes-comprometidos que permiten la evaluación de células humanas y proteínas sin temor de rechazo inmunológico, y su pequeño tamaño reduce la necesidad de cantidades excesivas de materiales valiosos experimentales, células o compuestos. Esto se ejemplifica por nuestro estudio reciente que demuestra la eficacia de las células madre humanas adultas y sus proteínas extracelulares para osteoregeneration 29. La relativamente corta vida de los ratones también presenta la oportunidad para la investigación sobre el envejecimiento 30 y la gran variedad de cepas puras peRMIT el estudio del genotipo mundial en la curación 31. También hay un número de modelos de enfermedades que son fácilmente establecido en ratones como la diabetes y la osteoporosis 32,33. De la nota importante es la disponibilidad de muchos ratones transgénicos que se pueden utilizar con esta técnica para mejorar nuestra comprensión de la fisiología ósea regenerativa en condiciones de trauma extremo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Damos las gracias al personal y los veterinarios en el Departamento de Medicina Comparada, Temple, Texas Scott & White Hospital, por su asesoramiento y ayuda inestimable durante el desarrollo de esta técnica. Este trabajo fue financiado en parte por el Instituto de Medicina Regenerativa de fondos del programa, Scott & White RGP subvención # 90172, NIH 2P40RR017447-07 y NIH R01AR066033-01 (NIAMS). Se agradece al Dr. Suzanne Zeitouni para las pruebas del manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pin assembly | |||
| Dremel rotary tool | Dremel | 8220 | or equivalent |
| Heavy duty cut off wheel | Dremel | 420 | |
| Surgical tubing 19 G | Small Parts (Amazon) | B000FMZ8LY | OD 1.07 mm, ID 0.889 mm |
| Surgical tubing 21 G | Small Parts (Amazon) | B000FMZ8YQ | OD 0.82 mm, ID 0.635 mm |
| Surgical tubing 22 G | Small Parts (Amazon) | B000FMYLZS | OD 0.719 mm, ID 0.502 mm |
| Surgical tubing 23 G | Small Parts (Amazon) | B000FN0SY0 | OD 0.643 mm, ID 0.444 mm |
| Cyanoacrylate adhesive | Loctite | 1365882 | |
| Emery disc | Dremel | 413 | |
| Rubber polishing point | Dremel | 462 | |
| Felt polishing disc | Dremel | 414 | |
| Gelatin sponge | Surgifoam/Ethicon | 1974 | |
| Punch biopsy cutter | Miltex | 33-34 | |
| Surgery/post-operative | |||
| Warm pad and circulator pump | Stryker/Thermocare | TP700, TP700C, TPP722 | |
| Coverage quaternary spray | Steris | 1429-77 | |
| Bead sterilizer | Germinator/CellPoint Scentific | Germinator 500 | |
| Anesthesia system | VetEquip Inc | 901806 or 901807/901809 | |
| Isofluorane anesthetic | VETone/MWI | 501017, 502017 | |
| Surgical disinfectant | Chloraprep/CareFusion | 260449 | |
| Surgical tools | Fine Science Tools | various | recommend German made |
| Face protection | Splash Shield | 4505 | |
| Rechargable high speed drill | Fine Science Tools | 18000-17 | |
| Diamond cutting wheel | Strauss Diaiond | 361.514.080HP | |
| Absorbable sutures | Covidien | UM-213 | |
| Outer sutures | Ethicon | 668G | or equivalent |
| Vetbond | 3M | 1469SB | or equivalent |
| Hydration gel | Clear H2O | 70-01-1082 | |
| Diet gel | Clear H2O | 72-01-1062 | |
| Buprenorphine | Reckitt and Benckser | 12496-0757-01 | controlled substance |
| Mouse igloos | Bio Serv | K3328, 3570,3327 | |
| Euthanasia cocktail | Euthasol/Virbac | 710101 | controlled substance |
| Analysis | |||
| Live animal imager | Orthoscan | FD Pulse | or equivalent |
| Micro-CT unit and software | Bruker | Skyscan1174 | or equivalent |
| Sealing film/Parafilm M | VWR or Fisher | 100501-338, S37441 | |
| *Generic sources are suitable for all other items such as gause, drapes, protective clothing, animal care equipment. | |||
References
- Brinker, M. R., O'Connor, D. P. The incidence of fractures and dislocations referred for orthopaedic services in a capitated population. J Bone Joint Surg Am. 86, 290-297 (2004).
- Cheung, C.
- Rosemont, I. L. United States Bone and Joint Decade: The burden of musculoskeletal diseases and musculoskeletal injuries. , American Academy of Orthopedic Surgeons. (2008).
- Tzioupis, C., Giannoudis, P. V.
- Marsh, D. Concepts of fracture union, delayed union, and nonunion. Clin Orthop Relat Res. , S22-S30 (1998).
- Spicer, P. P., et al. Evaluation of bone regeneration using the rat critical size calvarial defect. Nat Protoc. 7, 1918-1929 (2012).
- Green, E., Lubahn, J. D., Evans, J. Risk factors, treatment, and outcomes associated with nonunion of the midshaft humerus fracture. J Surg Orthop Adv. 14, 64-72 (2005).
- Kanakaris, N. K., Giannoudis, P. V. The health economics of the treatment of long-bone non-unions. Injury. 38, Suppl 2. S77-S84 (2007).
- Dimitriou, R., Mataliotakis, G. I., Angoules, A. G., Kanakaris, N. K., Giannoudis, P. V. Complications following autologous bone graft harvesting from the iliac crest and using the RIA: a systematic review. Injury. 42, Suppl 2. S3-S15 (2011).
- Boer, H. H.
- Aro, H. T., Aho, A. J.
- Burstein, F. D.
- Kao, S. T., Scott, D. D.
- Boden, S. D. Overview of the biology of lumbar spine fusion and principles for selecting a bone graft substitute. Spine. (Phila Pa 1976). 27, S26-S31 (1976).
- Hollinger, J. O., Kleinschmidt, J. C. The critical size defect as an experimental model to test bone repair materials). J Craniofac Surg. 1, 60-68 (1990).
- Key, J. The effect of local calcium depot on osteogenesis and healing of fractures. J. Bone Joint Surg. (Am). 16, 176-184 (1934).
- Holstein, J. H., et al. Advances in the establishment of defined mouse models for the study of fracture healing and bone regeneration). J Orthop Trauma. 23, S31-S38 (2009).
- Histing, T., et al. Small animal bone healing models: standards, tips, and pitfalls results of a consensus meeting. Bone. 49, 591-599 (2011).
- Cheung, K. M., et al. An externally fixed femoral fracture model for mice. J Orthop Res. 21, 685-690 (2003).
- Hiltunen, A., Vuorio, E., Aro, H. T. A standardized experimental fracture in the mouse tibia. J Orthop Res. 11, 305-312 (1993).
- Manigrasso, M. B., O'Connor, J. P. Characterization of a closed femur fracture model in mice. J Orthop Trauma. 18, 687-695 (2004).
- Garcia, P., et al. Rodent animal models of delayed bone healing and non-union formation: a comprehensive review. Eur Cell Mater. 26, 1-12 (2013).
- Garcia, P., et al. Development of a reliable non-union model in mice. J Surg Res. 147, 84-91 (2008).
- Flecknell, P. A.
- Guidelines on the Euthanasia of Animals. , American Veterinary Medical Association. Schaumburg, IL 60173. (2013).
- Neill, K. R., et al. Micro-computed tomography assessment of the progression of fracture healing in mice. Bone. 50, 1357-1367 (2012).
- Bagi, C. M., et al. The use of micro-CT to evaluate cortical bone geometry and strength in nude rats: correlation with mechanical testing, pQCT and DXA. Bone. 38, 136-144 (2006).
- Hadjiargyrou, M., et al. Transcriptional profiling of bone regeneration. Insight into the molecular complexity of wound repair. J Biol Chem. 277, 30177-30182 (2002).
- Clough, B. H., et al. Bone regeneration with osteogenically enhanced mesenchymal stem cells and their extracellular matrix proteins. J Bone Miner Res. , (2014).
- Lu, C., et al. Cellular basis for age-related changes in fracture repair. J Orthop Res. 23, 1300-1307 (2005).
- Jepsen, K. J., et al. Genetic variation in the patterns of skeletal progenitor cell differentiation and progression during endochondral bone formation affects the rate of fracture healing. J Bone Miner Res. 23, 1204-1216 (2008).
- Thayer, T. C., Wilson, S. B., Mathews, C. E. Use of nonobese diabetic mice to understand human type 1 diabetes. Endocrinol Metab Clin North Am. 39, 541-561 (2010).
- Jee, W. S., Yao, W. Overview: animal models of osteopenia and osteoporosis. J Musculoskelet Neuronal Interact. 1, 193-207 (2001).
