Abstract
近几十年来鼠标已经成为了各种肺部疾病的主要动物模型。在肺气肿或纤维化模型中，必不可少的表型变化，最好是由变化在肺弹性测量评估。到最好的理解小鼠这样的病状底层的具体机制，它是必不可少的，以使功能测量能反映显影病理。虽然有许多方法测量弹性，经典方法是，总肺压力容积（PV）的曲线进行过肺容积的整个范围。这种测量已经取得了对成人肺部几乎所有的哺乳动物物种距今近100年了，这样的PV曲线也是在胎儿肺发育肺表面活性物质功能的发现和了解发挥了重要作用。不幸的是，这样的总的PV曲线还没有得到广泛报道，在小鼠，尽管事实上，它们可以提供对macrosc有用信息在肺的结构变化OPIC影响。尽管局部的PV曲线测量刚刚变化肺容积有时报道，没有绝对的体积的量度，总的PV曲线的非线性性质使得这些部分的那些非常难以解释。在本研究中，我们描述一个标准化的方法来测量总PV曲线。我们然后测试这些曲线来检测在两个常见肺病理学，肺气肿和纤维化改变小鼠肺结构的能力。结果显示，与这些疾病预期的结构性变化一致的几个变量显著的变化。小鼠肺PV曲线的该测量从而提供了一种简单的装置来监视随时间变化的病理生理改变和治疗程序的潜在影响的进展。
Introduction
鼠标是目前各种肺部疾病的主要动物模型。肺气肿或纤维化模型，基本的表型变化，最好通过测量变化肺弹性评估。虽然有许多方法测量弹性，经典方法是总压力容积（PV）曲线从残气量（RV）的测量，以总肺活量（TLC）的那个。这种测量已经取得了对成人肺部几乎所有的哺乳动物物种距今近100年1-3。这样的PV曲线也是在胎儿肺发育4-7肺表面活性物质功能的发现和了解发挥了重要作用。尽管PV曲线的重要性，因为肺的表型的测定，还没有标准的方式来执行这种测量。它已经做了简单的通过充气和放气与离散的步骤肺（等待可变的时间后，每个平衡）或泵的可以连续地充气和放气的肺。的PV曲线往往是做在零和一些用户自定义的肺活量之间的体积范围内，但报道的不同实验室每个压力容积循环的持续时间已经非常可变的，从几秒8变到2小时。一些研究者参考本总肺PV曲线为静态或准静态的，但这些都是质量方面，提供小的洞察力，并且它们在这里不使用。此外，PV曲线并没有被广泛报道，在小鼠，尽管事实上，它可以提供关于在肺结构变化的宏观效应的有用信息。
几个问题导致变异PV曲线收购，包括：通货膨胀和通货紧缩1）速度; 2）压力为游览通胀和通缩;和3）的装置，以确定一个绝对肺容积的测量。在该方法中存在这里，3毫升/分钟的速度被选为一项妥协即，成为不能太短，以反映与正常的通风，而不是太慢关联的动态弹性，以使测量不切实际的，学习大队列时尤为如此。由于标称总肺活量在C57BL / 6小鼠的健康是1.2毫升9的量级，这种速度通常允许两个完整的闭合回路的PV将在约1.5分钟完成。
在其中，PV曲线已经报道了在扩展文献中，使用的峰值充气压力一直非常可变的，从低到20变化到40厘米水柱2 O.这个变异性的一部分可能与物种，但设置的PV曲线压力上限的一个主要目标是充气肺总肺活量（TLC）或最大的肺容积。在TLC在人类是由最大的志愿工作，个人可以做出规定，但不幸的是这可能从来没有在任何动物模型中被复制。因此，在实验PV曲线的最大音量是威慑由最大压力由研究者任意设定开采。我们的目标是建立一个压力，其中所述PV曲线是平坦的，但不幸的是哺乳动物的肺PV曲线的膨胀肢是从不平坦的。所以大多数研究者设定一个压力，其中所述膨胀曲线开始变平基本上，典型30厘米H 2 O在小鼠，然而，PV曲线更为复杂与充气肢双驼峰，并且其中该膨胀肢常常仍然在30厘米水柱2 O 10急剧上升，所以30不是为一个好的结束点PV曲线。出于这个原因，我们使用35厘米的H 2 O为压力极限为鼠标PV曲线，这是在该充气四肢我们已审查所有菌株的开始变平的压力。
由于PV曲线本身很非线性的，光伏环的外观将取决于从弯道开始处的体积。一些商业通风允许用户做大型光伏循环，从初始的F钢筋混凝土，但如果将FRC体积是未知的话，是不可能解读的改变与任何病理，例如PV曲线，因为这些变化可以简单地从开始体积的变化造成的，而不是结构改变在肺中。因此，没有一个绝对量的测量，PV曲线几乎是不可能的解释，因此没有什么效用。虽然，有几种方法来测量肺容积，这些往往笨重，需要特殊的设备。在这里所描述的简单的方法，所述PV曲线的体内脱气过程后从零开始体积。
总之，本文说明了一个简单的方法，以规范肺PV曲线的测量在小鼠肺，并限定可从该曲线被链接到肺的结构来计算几个度量。的PV曲线因此提供肺功能测试具有在能够检测小鼠通讯表型的结构变化的直接应用肺疾病如肺气肿和纤维化。
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Protocol
约翰·霍普金斯大学动物护理和使用委员会批准的所有动物的协议。
1.设备
复合体系建立起来，准备测量的PV曲线示于图1。
- 体积测量：
- 通过使用注射泵用开关，其允许用户在到达压力极限后，迅速扭转泵产生膨胀和收缩的恒定速率。鼠标PV曲线，使用非常抹了油5毫升玻璃注射器与初始体积（前通胀）设置3毫升空气。 3毫升足够大，在几乎所有的鼠标PV曲线来衡量卷。
- 测量由泵输送通过附加的线性差动变压器到泵壳体，具有一小的传感器杆连接到所述移动针筒柱塞的体积。
注意：实证手段来校正在系统中气体压缩光伏立方米下被描述RVE记录部分。
- 压力测量：
- 使用标准的廉价的压力表，射程0-60厘米H 2 O（0-1 PSI）。
- 记录测量：
- 为了记录PV曲线使用任何数字录音机XY能力（ 如 PowerLab系统）。设置一个信道来记录修正量信号和另一信道来记录跨肺压（PTP），以图表的PV曲线。使用一个桥前置放大器连接到主PowerLab系统来测量压力。 0-40厘米水柱2 O校准压力通道，并从0-3毫升校准音量通道。
2.修正了天然气压缩
注意：这是在一个关键的初始步骤中的设置，因为随着压力的增加，气体体积减小，并且空气递送到小鼠的这样的体积会比SYR的位移越来越少英格桶。
- 关闭将光伏系统连接到肺部的活塞，因此没有气体能离开系统。开始输注，并观察是否刻录机上的校正量的信道表示任何可测量的变化，因为压力增加至约40cm 的 H 2 O.如果是这样，那么正确的，因为在接下来的步骤。
- 正确的气体压缩经验从活塞位移测量减去（ 即未修正量）比例通胀压力的一个术语。做一个PowerLab系统的信道（被称为维生素C），这显示数量减去信号系数倍的压力。
- 确定公式中的系数。首先，初步猜测，打开图表记录，并启动泵。由于通胀油管是密封的，调整压力系数倍增，使Vc的通道读取零0-40厘米H 2 O.压力上升如果这样下去，向上或向下，只需调整校正系数，直到横盘在这个压力范围内。这种校正因子将始终是相同的，如果同一3毫升开始在注射器容量不改变。
小鼠3实验测试
- 程序小鼠PV曲线的测量结果。所有的动物协议批准了约翰·霍普金斯大学动物护理和使用委员会。
- 麻醉小鼠（C57BL / 6小鼠在6-12周龄）用氯胺酮（90毫克/千克）和赛拉嗪（15毫克/千克），并由于没有反射运动的确认麻醉。
注意：PV曲线可以在麻醉的小鼠中完成，在不到10分钟，是一个终端程序。 - Tracheostomize小鼠与18G的存根针管。通过一个小切口，在皮肤上的气管，定位气管，然后做一个小切口，在气管，可插入存根针的地方做到这一点。用线扎固定套管。
- 让老鼠呼吸100％的氧气，至少4分钟。这可以是通过自主呼吸从袋中，或用换气名义上设定为0.2ml，在150次呼吸/分钟的潮气量。
- 关闭气管插管，并允许3-4分钟为鼠标吸收所有的氧气。此氧气吸收过程引起的动物，并在肺11的几乎完整的脱气的死亡。通过测量与心电图电极或直接观察心跳停止确认的小鼠死亡。
- 一旦肺的脱气完成并且肺容积为零时，开始充气与室内空气在所述注射器泵的肺以3毫升/分钟的速率。显示器上的数字记录的压力轨迹，并且当它到达35厘米H 2 O，反向泵浦。
- 按照通缩的曲线，直到压力达到负10厘米H 2 O，而此时的气道已经崩溃，捕捉空气中的肺泡防止进一步的减排量。马上倒T他再次泵，使肺reinflate的崩溃航空公司公开赛。这种异构开放是嘈杂看通胀肢体这个第二通货膨胀的初始部分通常明显。
- 当压力再次达到35厘米H 2 O，反转泵方向，并持续到2日通货紧缩肢体达到0厘米H 2 O.放气肺然后停泵。
- 查看的压力和流量，并在PV曲线的PowerLab图表记录。然后分析PV曲线来检测在肺实质不同的肺病理学发生表型的改变。
- 麻醉小鼠（C57BL / 6小鼠在6-12周龄）用氯胺酮（90毫克/千克）和赛拉嗪（15毫克/千克），并由于没有反射运动的确认麻醉。
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Representative Results
虽然为光伏曲线的步骤中演示了仅用于控制健康小鼠的视频中，我们检查了PV曲线来检测小鼠的功能和病理变化与两个不同的常见病症，肺气肿和纤维化的能力。这些传统车型的详细信息在其他地方12,13描述。很简单，麻醉用3％异氟醚后肺气肿是由3个或6ü猪胰弹性蛋白酶灌输到气管引起的，研究3周后，和纤维化是由0.05ü博莱霉素灌输到气管引起的，在此之后的研究2周侮辱。
图2示出了从对照小鼠的典型的PV曲线。从这样的PV曲线，测量变量，很容易进行量化，从小鼠重现的小鼠，并且代表发生在肺部疾病的结构变化。这些列于表1和图2中以图形方式示出表1列出了这些变量，以及图2示出它们是如何从PV曲线测定。每个背后的基本原理是以后讨论。
图3示出从代表控制，肺气肿，和纤维化的小鼠，分别典型的PV曲线。从女性控制和纤维化的小鼠产生的曲线测量变量示于图从在雄性对照小鼠和那些具有2度肺气肿严重性产生的曲线测4.变量在图5的统计呈现 组之间的比较用任何未配对的t-检验（纤维化模型）或评估与Tukey的校正多重比较（肺气肿模型）的单向方差分析和显着性水平进行了分析。一名P <0.01被认为是显著。
这些结果表明，这里所用的方法，以获得测量Ò女肺光伏曲线是在能够检测的变化在这种结构变化已经在临床中描述不同的病状肺的扩张性是有用的。这种方法和分析生成表征PV曲线的不同方面的几个变量。了每个这些测量变量的解释单项代表进行更详细的下一节讨论。
图1：实验设置显示注射泵的体积和压力传感器 ，请点击这里查看该图的放大版本。
图2：代表PV曲线显示如何日表1 C不同的变量被测量。V3，V8和V10是在第一通缩肢体的肺容积在3,8，和10厘米水柱2 O，分别。 V35是体积35厘米的H 2 O和被定义为总肺活量（TLC）。 RV是残留量，定义为被困的气体在第一通货紧缩曲线的连接的数量。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3：从控制，肺气肿和肺纤维化小鼠代表PV曲线暗线段的斜率表明通缩肢体达标，C. 请点击此处查看该图的放大版本。
图4：变化从在控制和纤维化的小鼠中所示的光伏曲线测量的变量是平均值±SEM，N = 9为每个组。在肺纤维化的所有变量都显著不同的控制肺部与P <0.01。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5：变化从在控制和肺气肿小鼠中所示的光伏曲线测量的变量是平均值±SEM，N = 9为每个组。在肺气肿的肺在严重的任程度所有变量均显著不同于控制肺和彼此以P＆＃60; 0.01 请点击此处查看该图的放大版本。
| 测量 | 它量化 | 与病理变化 |
| TLC | “最大”通胀;在35厘米水柱2 O小鼠的肺容积定义 | 增加肺气肿;减少纤维化 |
| RV | 在通货紧缩气道塌陷后被困风量 | 增加肺气肿;减少纤维化 |
| V10％ | 通缩肢体形状 | 随着肺发育;降低了与表面活性剂的抑制作用;增加肺气肿;减少纤维化 |
| Ç | 通缩肢体的准静态斜率 | 增加肺气肿;增减纤维化SES |
| CS | 从通缩肢体= C / V3具体合规 | 减少肺气肿;减少纤维化 |
表1：鼠标PV曲线测不同变量的清单。
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Discussion
在本文中一个简单的可重复的方法已经描述在小鼠中测定表型肺的弹性，总肺的PV曲线的经典方法。这样的曲线是有助于肺表面活性物质的发现及其在肺部提供稳定的重要性。这里，示出了如何在PV曲线也提供以测量在成年小鼠肺有关肺弹性几个变量的装置是有用的。有在所有的变量在两个常用的小鼠模型高度显著变化以产生在小鼠肺中的病理改变。以下部分简要讨论的变化中的每个所测量的变量的意义。
薄层层析是最大的肺容积，或更准确地，该卷在限定的最大压力，其中该充气肢体开始变平的量度。如前所述，一个PV曲线的通胀肢体从来没有真正变平，并且鼠标在这个特别极端行为10。尽管薄层色谱在人中被定义为在一个最大随意吸气努力的末端的体积，在每一个动物模型它被定义为在某个任意的用户定义的压力的体积。用在本文中示出的病理模型中，随着肺气肿逐步增加在TLC观察以及与纤维化的减少。这些观察反映临床表现与每个这些条件，因而所预期在一个有用的小鼠模型。
该房车是反映被困在肺泡的呼吸道接近上最大到期残留空气的一个变量。这个变量从而反映出在人类和动物模型中相同的现象。 RV被称为增加在人类哮喘和慢性阻塞性肺病14,15。这种增加RV被相关的事实，小气道靠近越早对通缩肢带要么增加平滑肌张力或束缚支持从SURR损失ounding肺实质16。在这里使用的两种病理模型，发现相反的作用。有在RV随着肺气肿损伤显著增加，但与纤维化，出现了一个下降RV，因为更严厉的气道和周围肺收于通缩较低的肺容量。
所述％V10是一个已被用来反映对通缩肺的稳定性，和最初用于反映表面活性剂体系17的成熟形状因子。作为胎儿肺成熟，从相对直的曲线是凸朝向卷轴，在V10％18同时增加通缩肢变为1。在成人中的最终形状差异很大的哺乳动物物种中，与V10％75至90％，19变化。所述％V10还已知逐渐减小，肺表面活性物质变得不太有效20,21。在病理模型在这里学习，主要Ç在表面活性剂hanges没有预期，但曲线的形状也依赖于肺组织的弹性。有显著增加％V10肺气肿和纤维化显著下降的事实可能反映了这些结构性变化。虽然这种度量通常不在人类受试者测定，它可以是在动物模型中非常有用，因为相关的肺结构的具体病理改变表型变量。
顺应性（C）的是，可以从非线性PV曲线的任何线性区域而获得的度量。在小鼠中，放气四肢从大多数菌株是3和8厘米水柱2 O之间相当线性的，并且由于这个原因，很容易确定可重现下在该范围内。之一中使用任何斜率测量从PV曲线的关键问题是，该值是高度依赖于压力超过其所测量两者的范围和前述卷历史（ 即，如何节生成曲线），这样的一致性是非常重要的，如果比较将要控制和病理模型之间进行。在本研究中使用的两个病理模型，显著增加下在肺气肿和纤维化显著下跌观察;研究结果，即模仿什么都在人类临床上观察到的。
具体顺应性，CS具有经典被用于校正的事实，一个较大的肺具有相同的结构更小的肺部会在肺容积以上的压力的相同变化更大的变化，从而导致更大的合规22。在Cs也相当于肺弹性的体积弹性模量的倒数。在临床上被测量为遵守FRC分，但由于在鼠标，我们不知道FRC，我们选择使用音量3厘米H 2 O.通过标准化为3厘米水柱2 O的体积（ 即使用体积分数的变化），那么一会计算相同的具体合规的一大或小细胞肺癌，如果大的肺简直包括了更多的相同小细胞肺癌的。结果本文件中表明，在Cs的下降在纤维化模型中，这表明在C中的测得变化不只是由于肺体积为小。相反，肺实质本身是显著硬。在肺气肿模型，但是，在Cs也减少了，这是相对的增加C.这在计算出的铯减少的发生是因为增加的肺体积比增加，C。然而较大，这个数学事实不提供任何深入了解，导致这些变化的结构变化。目前，更多的病理性的见解并不清楚，进一步的实验工作已经超出了本文的方法的范围。
这些变化在PV变量背后的原因依赖于不同型号的病理变化秒。肺气肿，肺泡壁的损失降低整体组织反冲，增加周边空域的大小。残余空域的这个放大将增加空域表面的曲率半径，进一步降低由于表面张力的弹性回缩。这两个因素将导致增加的薄层色谱观察到。在纤维化模型中，胶原蛋白和其它矩阵元素的沉积导致的硬化以及所有组织中可检测临床上的增厚和小鼠作为还原弥散能力13,23。这些病理变化都反映在显著降低TLC。见于肺气肿模型中的RV增加可能导致从束缚支撑气道，它通过在呼气肢较早气道关闭本身表现的降低。在纤维化中，较硬的气道抵抗塌陷直至更低的压力到达预定值期满，从而减小剩余量。合规的变化反映类似的病症，影响肺容积。在实质墙壁弹性元件的损失将导致增加合规，其中在气道和实质胶原沉积会导致更严厉的肺与合规性下降。在肺气肿模型％V10略有增加，并与纤维化的减少是不容易解释。有文献与对比这些结果没有类似的研究。由于弹性反冲肺气肿是低，最大肺容积显然能够保持高于正常甚至随着压力减小，这是通过增加％V10的表现。与纤维化，弹性回缩仍然很高，即使在高压力，所以体积更迅速地从型TLC压力减小降低。这也将是与肺表面活性剂的降解相一致，但是没有文献，其中这是在纤维化评估。因此，虽然％V10尚未用于表型成人肺，此处呈现的结果表明，它可以是能够监视至少两个病理学研究渐进变化敏感的变量。直到更完整的研究完成，然而，在与弹性蛋白酶或博莱霉素的剂量 - 反应关系完成，此变量的灵敏度将保持推测。
纠正的气体压缩的重要性怎么强调也不过分。这是在设置了一个临界的初始步骤中，由于随着压力的增加，气体体积减小，因而空气输送到小鼠的体积会比注射筒的位移越来越少。步骤经验校正这是显示在上面，他的协议。值得注意的是，如果在PV安装体积不发生变化，那么这个经验修正过程仅需要进行一次。并且如果系数被写入时，它可以手动输入在需要时。应当强调，但是，THIS分析只适用，因为肺是从脱气状态开始。如果PV曲线分别从正常呼气末肺容量（FRC）开始，这将是不可能的，以校正所述气体压缩，除非人知道该卷的大小。此外，PV曲线的形状将是相当依赖起始肺容积上，因此，如果有在病理肺观察到的变化从FRC开始，它不会是可能的解释这些变化，直到控制和病理FRCS被称为。这是总是从零肺容积开始另一个优点。最后，值得注意的是，在PV曲线进行小鼠完整胸壁。这简化了整个过程，并极大地减少了错误的可能性，由于扭曲肺形状或手术的错误。幸运的是，一个正常胸壁的存在具有PV曲线9上的影响可以忽略，因此，具有完整的胸部进行的PV曲线提供了一种简单的和可靠的手段评估肺的膨胀性。
总之，本文说明了如何简单地进行在小鼠肺PV曲线的可重现的测量。的PV曲线具有在肺都在动物遗传改变肺以及与其他环境损害文件的结构变化的独特能力。因此，如这里所示，该测量可提供表型洞察与肺气肿和纤维化肺特定结构变化的表现，而且可以类似地使用太评估可能影响肺弹性的任何其他病症。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 55-2226 | Infuse/withdraw syringe pump |
| Pump 22 reversing switch | Harvard Apparatus | 552217 | Included with pump |
| Linear displacement transformer | Trans-Tek, Inc. | 0244-0000 | |
| 5 ml glass syringe | Becton Dickenson | Several other possible vendors | |
| Digital recorder | ADInstruments | PL3504 | Several other possible vendors |
| Bridge amp signal conditioner | ADInstruments | FE221 | |
| Gas tank, 100% oxygen | Airgas, Inc | Any supplier or hospital source will work | |
| Pressure transducer: 0 - 1 psi mV output | Omega Engineering | PX-137 | Range ≈ 0 - 60 cm H2O |
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