Abstract
En raison du niveau élevé de l'hétérogénéité et de mutations inhérentes dans les cancers humains, les thérapies d'agents simples ou les traitements d'association qui ciblent la même voie, sont susceptibles d'échouer. L'accent doit être mis sur l'inhibition des voies qui sont responsables de la résistance intrinsèque et / ou d'adaptation à la thérapie. Un champ actif de l'enquête est le développement et les tests d'inhibiteurs de réparation d'ADN qui favorisent l'action de, et empêchent la résistance à, couramment utilisé chimiothérapie et la radiothérapie. Nous avons utilisé un protocole selon l'invention pour évaluer l'efficacité de l'inhibition de BRCA2 en tant que moyen de sensibiliser les cellules tumorales à la cisplatine préjudiciable de médicaments de l'ADN. le métabolisme des cellules de la tumeur (acidification et la respiration) a été surveillé en temps réel pendant une période de 72 h à délimiter l'efficacité du traitement sur une base minute par minute. En combinaison, nous avons effectué une évaluation de la fréquence métastatique utilisant une membrane chorioallantoïque d'embryon de poulet (CAM) de modèle d'extravasation et l'invasion. Cetteprotocole répond à certaines des faiblesses des couramment utilisés in vitro et in vivo de méthodes pour évaluer de nouveaux schémas thérapeutiques du cancer. Il peut être utilisé en plus des méthodes communes telles que des tests de prolifération cellulaire, les tests de la mort cellulaire, et les études in vivo de xénogreffes de souris, de discriminer davantage parmi les cibles et agents candidats, et ne choisissez que les candidats les plus prometteurs pour la poursuite du développement.
Introduction
Résistance à la cible et / ou le traitement du cancer cytotoxique est un problème clinique important qui peut conduire à l'échec du traitement, de la rechute acquise, et l'augmentation de la mortalité des patients 1. Compte tenu du degré élevé d'hétérogénéité dans la plupart des tumeurs, ce est une certitude mathématique qu'une tumeur du nombre suffisamment élevé de cellules contient un sous-ensemble de cellules résistantes à des traitements simples ou combinés ciblant les voies moléculaires à laquelle ces cellules dépendent de survie de 2,3. Ces cellules tumorales peuvent être sélectionnées positivement pour pendant le traitement, conduisant à la réapparition de la maladie. Le développement de nouvelles thérapies qui ciblent simultanément différents mécanismes de survie des cellules cancéreuses, soit avant, soit après le choix du traitement à médiation, est donc d'importance clinique.
Un niveau élevé d'instabilité du génome et la mutation dans le génome de la tumeur est une caractéristique fondamentale qui distingue les cellules cancéreuses à partir de cellules hôtes non tumorales 4. Par conséquent, un useful stratégie pour augmenter l'efficacité de la chimiothérapie endommageant l'ADN et d'empêcher le développement de la résistance est active pour inhiber la réparation de l'ADN dans les cellules tumorales 5. Ce est un champ actif de l'enquête et une variété de cibles de réparation d'ADN nouveaux sont à l'étude dans un cadre pré-clinique. Un certain nombre de petites molécules ou des inhibiteurs à base antisens-de ces objectifs ont été élaborés et sont en cours de test 6-8. L'objectif est d'identifier les candidats pré-cliniques les plus prometteurs et d'évaluer la sécurité et l'efficacité dans les essais cliniques.
Le coût élevé des essais cliniques et le risque d'échec (pour une variété de raisons, y compris l'évaluation pré-clinique sous-optimale) sont de formidables obstacles pour progresser dans le développement de nouvelles thérapies neuf. L'utilisation de modèles appropriées et rigoureuses pré-clinique pour évaluer adéquatement nouvelles cibles thérapeutiques et médicaments candidats peut diminuer le taux d'échec élevé de 10 essais cliniques
Certaines méthodes précliniques couramment utilisés pour évaluer l'efficacité des thérapies anticancéreuses sont les suivantes: a) mesure de la capacité à réduire la prolifération des cellules tumorales in vitro (les essais de prolifération cellulaire), b) la réduction induite par un traitement dans la capacité des cellules tumorales à colonies de culture sous forme de tissu (essais de formation de colonie), c) la réduction induite par un traitement dans des cellules tumorales activité métabolique in vitro (transformation de colorant redox), d) induction induit par le traitement d'vitro la mort dans des cellules tumorales (apoptose, nécrose, autophagique, associé avec la mitose et autres) 11, et e) la réduction in vivo de la croissance ou l'ablation de xénogreffes humaines et de souris induite par un traitement de 12 à 14.
Une faiblesse majeure des méthodes énumérées in vitro, ce est qu'aucun d'entre eux fournissent évaluation en temps réel et en continu de l'effet de thérapies candidats. Plutôt, ils fournissent des informations sélectionnées, seulement à des points de temps largement séparésau cours du traitement. Ces mesures ont diminué la capacité de refléter avec précision l'ampleur et le calendrier des réponses des cellules tumorales. In vivo des modèles de xénogreffes de souris sont également limitées par le coût élevé, la longueur de temps pour terminer, et le risque de dosage et de traitement synchronisation sous-optimale (ordonnancement). En outre, il existe des preuves que les modèles rongeurs de xénogreffes sont des prédicteurs limitées d'efficacité clinique chez l'homme, par rapport à l'évaluation in vitro de réponses des cellules primaires de tumeurs humaines et établies des lignées de cellules tumorales humaines à des interventions thérapeutiques candidats 15,16.
Nous avons conçu un nouveau protocole de combinaison pour évaluer de nouvelles combinaisons de médicaments pré-clinique, d'une manière qui répond aux faiblesses des procédures plus communs énumérés ci-dessus. A la place de la prolifération, la formation de colonies, ou de colorant redox essais de conversion, nous avons utilisé un appareil de mesure du métabolisme d'analyser l'adhérence cellulaire, la respiration, et l'acidification en temps réelau cours de la période de traitement 17. En même temps, nous avons étudié les effets de la combinaison d'un traitement in vivo par l'utilisation d'un embryon de poulet membrane chorio-allantoïde de modèle (CAM) de l'invasion et de métastase 18,19. Nous avons utilisé ces méthodes pour évaluer la capacité d'un oligonucleotide antisens (ASO) ciblage BRCA2 pour potentialiser l'efficacité du cisplatine médicament chimiothérapeutique couramment utilisé.
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Protocol
REMARQUE: Le protocole suivant a été conçu pour une utilisation avec des cellules adhérentes. Modifications sont nécessaires pour appliquer la méthode à des cellules non-adhérentes cultivées en suspension. Les expériences CAM décrites dans le protocole sont conçus pour une utilisation avec des cellules qui expriment un marqueur fluorescent (par exemple, la GFP, RFP, etc.). Neuf jours embryons de poulet sont tenus le jour 2 du protocole expérimental pour les expériences de CAM.
1. Préparation et transfection de cellules tumorales avec oligonucléotides antisens (OLS)
- Aspirer milieu du flacon T75 (s) contenant des cellules d'intérêt, laver avec 1XPBS, et ajouter 2 ml de trypsine à 0,25% / EDTA. Ajouter 10 ml de milieu de croissance complet à chaque flacon et transférer les cellules dans une solution dans un tube de 50 ml. Compter les cellules et ajuster le volume de sorte que la concentration finale est 1,0x10 5 cellules par ml.
- Étiquette deux groupes de flacons T25: un groupe contiendront huit flacons étiquetés, 1-8, et seront used pour l'expérience de mesure du métabolisme en temps réel; et le second groupe contient également huit flacons et sera utilisé pour l'expérience de CAM d'embryon de poulet. Ajouter 2 ml de solution de cellules dans chaque flacon et le placer dans l'incubateur (37 ° C, 5% CO 2 O / N).
- Le lendemain matin (jour 0, Temps 0), l'étiquette de trois 5 ml tubes comme suit: le contrôle (non-ciblage ASO ou siRNA), «cible d'intérêt» (ce est à dire, en ciblant ASO ou siRNA) et Lipofectamine 2000 (ou similaire réactif de transfection). Diluer les solutions disponibles ASO à la concentration appropriée du milieu sans sérum dans le tube approprié.
- Ajouter la quantité nécessaire de réactif de transfection au tube approprié et incuber dans un milieu exempt de sérum pendant 5 min. Ajouter la solution de réactif de transfection pour les tubes ASO et incuber pendant 20 min.
- Ajouter 250 ul de solution de réactif ASO de transfection de commande pour chacun des flacons de 1 à 4 dans chaque groupe, et 250pi de «cible d'intérêt 'ASO solution de réactif de transfection à chacun des flacons 5-8 dans chaque groupe. Incuber pendant 4 heures (37 ᵒC, 5% CO 2).
- Pendant l'incubation, effectuer les étapes décrites à la section 2.1. Après l'incubation, ajouter 3 ml de milieu complet à chaque flacon dans le groupe d'essai de CAM et revenir à l'incubateur O / N (37 ᵒC, 5% CO 2). Traiter le groupe de l'expérience du métabolisme selon la description à la section 2.2. Traiter l'expérience de cames selon la description à la section 4.
2. Biocapteur Chip Préparation et ensemencement cellulaire
- Dans un environnement stérile, laver soigneusement six puces de biocapteurs avec 400 pi de PBS. Stériliser les puces avec 400 ul d'éthanol à 70% pendant 20 min. Laver trois fois avec 400 ul de PBS.
- Placez les puces à l'intérieur de tissus stériles culture plats pour éviter la contamination. Placez trois puces dans un plat étiqueté «contrôle», et trois dans un plat étiqueté «cible d'intérêt '.
- Étiqueter deux tubes de 50 ml que «contrôle» et «cible d'intérêt '. Laver les cellules avec du PBS et ajouter un volume approprié de 0,25% de trypsine / EDTA. Attendez jusqu'à ce que les détache de monocouches et de recueillir les cellules dans chaque flacon. Déposer la solution dans le tube approprié.
- Compter les cellules et ajuster le volume de sorte que la concentration finale est 6.0x10 5 cellules / ml. Centrifuger les cellules et remettre en suspension si la concentration initiale est trop faible.
- Ajouter 250 pi de la solution cellulaire pour chaque puce de biocapteur dans le groupe approprié (pour un total de 1.25x10 5 cellules par puce). Effectuez cette tâche un groupe à la fois pour minimiser le risque de confondre les puces. Placez les plats stériles contenant les puces dans une chambre d'humidité pour éviter l'évaporation, et placer les cha d'humiditémbre dans l'incubateur O / N (37 ᵒC, 5% CO 2).
- Le matin suivant (jour 1), aspirer soigneusement le milieu de chaque puce et le remplacer par 250 ul de milieu de croissance supplémenté avec 0,2% de sérum bovin fœtal (FBS) et 1 x pénicilline et de streptomycine (P / S). Incuber pendant 4 heures (37 ᵒC, 5% CO 2).
De préparation du système de mesure et de métabolisme 3. Préparation de la solution
- Durant l'incubation, préparer les solutions de médicament requises et le système de mesure du métabolisme pour le dosage à venir.
NOTE: Le système de mesure du métabolisme contient un total de six modules. Chaque module peut accueillir une puce par expérience.- Subdiviser le dosage dans les groupes expérimentaux suivants: une puce de chacun des «contrôle» et «cible d'intérêt" groupes à recevoir véhicule pendant toute la durée de l'essai; deux puces de chaque groupe pour recevoir le traitement médicamenteux pendant une période de temps définie pendant la uneéssayé, suivie de véhicule au cours de la période de lavage.
- Pour les études drogues de sensibilisation, de modifier la longueur, le calendrier, et la concentration de traitement de la toxicomanie pour répondre à la drogue en question.
NOTE: Pour le cisplatine, les étapes suivantes ont été déterminées empiriquement avec des cellules A549, et peut varier en fonction de la lignée cellulaire. Effectuez toutes les étapes avec le débit par défaut de 4 pi / min.
6 h de croissance à moyen + 0,2% de FBS et 1x P / S
24 h de 6 uM cisplatine en milieu + 0,2% de FBS 1x P / S
24 h de croissance à moyen + 0,2% de FBS et 1x P / S
18 h de croissance à moyen + 0,2% de FBS et 1x P / S
4 h de 0,1% de Triton X-
REMARQUE: Des dérogations à ces étapes, il faudra calcul pour déterminer le volume requis de solutions à moyen et médicaments basés sur le débit souhaité et la durée de l'expérience. Les sections suivantes sont basées sur les étapes décrites ci-dessus.
- Étiquette et remplir quatorze tubes de 50 ml avec 50 ml de croissance à moyen + 0,2% de FBS uned 1x P / S. Placez dans une six portoir de tubes du système de mesure du métabolisme, six dans l'autre, et les deux autres dans un troisième porte-tube qui contient également des tubes avec le cisplatine. Sceller les deux premières grilles d'une membrane perméable à l'air pour empêcher l'évaporation.
- Préparer une solution de 6 uM de cisplatine (du volume approprié) dans un milieu FBS + 0,2% avec 1 x P / S. Distribuer le volume requis de solution de cisplatine marqués en quatre tubes de 50 ml.
- Placer les tubes dans les quatre places restantes dans le rack de tube de mesure troisième métabolisme. Se assurer que les tubes sont placés dans les fentes appropriées qui correspondent aux Biomodules souhaités. Sceller les tubes avec une membrane perméable à l'air.
- Préparer et étiqueter six tubes de 50 ml et les remplir avec 20 ml chacune de solution à 0,1% de Triton-X dans le milieu. La solution Triton-X lyser toutes les cellules restantes et de fournir une valeur «zéro» pour chaque puce. Placer les tubes dans un rack tube quatrième unité de mesure du métabolisme et sceller l'esprith une membrane permable de l'air pour éviter l'évaporation excessive.
- Chargez les jetons dans les Biomodules et initier l'expérience.
Traitement et de drogues injectables 4. CAM Expérience
REMARQUE: Les étapes et la procédure pour la préparation des embryons de poulet pour une expérience de CAM sont décrits ailleurs 19
- Commencer le traitement de la heures après la transfection CAM expérience 48 (Jour 2). Sous-diviser le «contrôle» et «cible d'intérêt" des groupes en deux flacons pour véhicule, et deux pour cisplatine. Aspirer le milieu des flacons et reconstituer avec soit 3 ml de milieu frais, ou 6 uM de cisplatine. Incuber pendant 6 h (37 ᵒC, 5% de CO 2).
- Aspirer le milieu, puis lavez et trypsiniser les cellules; recueillir les cellules trypsinisées en solution en quatre correctement étiquetés tubes de 15 ml.
- Centrifuger les cellules et laver trois fois avec du PBS. Remettre en suspension le culot cellulaire dans 5 ml de PBS uneD compter les cellules.
- Ajuster le volume de sorte que la concentration cellulaire finale est 1,0x10 6 cellules / ml. Transférer la solution cellulaire dans étiquetés tubes de 5 ml pour l'injection, et le placer sur la glace. Retourner doucement les tubes avant l'injection afin de se assurer que les cellules sont bien mélangés.
- Mettez de côté un total de 24 embryons de poulet (vieilles 9 jours) pour injection (6 par groupe). Effectuer l'injection en utilisant une aiguille de verre fixé à un tube flexible relié à une seringue de 1 ml. La personne effectuant l'injection doit être aveugle au groupe de traitement.
- En utilisant un microscope stéréo, injecter 1,0x10 5 cellules dans un volume de 100 ul dans la circulation veineuse de la came. Utilisez, une technique de pulsation lente pour injecter la totalité du volume de cellules. Tamponnez délicatement le site d'injection avec un chiffon doux lingette pour endiguer le flux de sang et d'absorber tout déversement. Étiqueter chaque récipient embryonnaire suivante appropriée chaque injection.
- Confirmer la présence et Distrition de cellules fluorescentes dans le système vasculaire de la CAM après l'injection par les visualiser à l'aide d'un microscope à fluorescence. Prenez note de tous les embryons dans lequel le nombre de cellules tumorales semble faible, ou la distribution est médiocre.
- Placez les embryons de poulet dans une chambre d'humidité et de les stocker dans un incubateur (37 ° C, 60% d'humidité). Attendre 7-9 jours avant d'énumérer foyers métastatiques.
5. métastatique point Enumeration
- Au cours de la période d'incubation de 7-9 jours, surveiller les embryons et jetez les morts. Se assurer que la chambre d'humidité reste humide pendant toute la durée de la période d'incubation.
- En utilisant un microscope stéréo fluorescent à grossissement 20X, balayer la totalité de la surface supérieure de la CAM d'embryons dans un motif régulier, analogue à une grille.
- Comptez le nombre de foyers métastatiques dans chaque champ de vision, alors comptabiliser le nombre pour un total final par embryon. Cela pour les six embryons dans chaque groupe fournira un nombre o moyennef foyers métastatiques par traitement.
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Representative Results
Résultats et chiffres adaptés avec la permission de travaux publiés 22.
BRCA2 inhibition induit une diminution de la respiration dans les cellules tumorales traitées au cisplatine
Les cellules humaines de cancer du poumon A549 traitées avec BRCA2 ciblage ASO et le cisplatine exposé une baisse anticipée et irréversible dans la respiration, par rapport aux cellules qui ont reçu commande ASO et cisplatine seul; après 24 h de traitement par le cisplatine à la différence entre la respiration et de contrôle BRCA2 ASO ASO cellules traitées était de 39% (figure 1A). Fait important, cette diminution de la respiration a commencé avant une goutte détectable dans l'adhésion cellulaire, ce qui suggère que cela se est produit indépendamment des variations du nombre de cellules. La respiration a commencé à diminuer d'environ 10 heures avant la première goutte observable dans l'adhésion, ce qui suggère une baisse de la respiration peut être un événement de formation qui précède la mort cellulaire (figure 1B). Aucune différence dans acidification a été observée lors de l'expérience délai de 72 h, ce qui suggère que BRCA2 ASO et le traitement de cisplatine a peu d'effet sur le métabolisme du glucose (figure 1C).
inhibition de BRCA2 combiné avec un traitement cisplatine diminue la fréquence des métastases
Les cellules cancéreuses pulmonaires humaines A549 ont été traitées avec contrôle ASO ASO ou BRCA2 en présence ou en l'absence de cisplatine, et injectées dans la circulation veineuse de la came (figure 2A). Neuf jours après l'injection, les cellules traitées avec le cisplatine et BRCA2 ASO présentaient une fréquence inférieure de 77% par rapport aux foyers métastatiques des cellules traitées avec le cisplatine et le contrôle ASO, ou BRCA2 ASO seul (figure 2B). Ceci suggère que BRCA2 ASO et le traitement de cisplatine a le potentiel pour diminuer ou prévenir fardeau métastatique chez les patients atteints de tumeurs solides.
Figure 1. suivi en temps réel des cellules A549 adhérence des cellules tumorales, la respiration, et l'acidification. BRCA2 ont été transfectées avec ASO, plaqués sur des puces de biocapteur, et traité avec du cisplatine pendant 24 heures en utilisant le système de découverte Bionas. Les mesures de (A) respiration, (B) l'adhésion, et (C) l'acidification ont été effectuées toutes les 4 min sur une période de 72 heures. Rose = contrôler ASO, bleu = BRCA2 ASO, vert = contrôlent ASO + cisplatine, rouge = BRCA2 ASO + cisplatine. Figure adapté de travail publié avec la permission 22. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Énumération métastatique frefréquence utilisant un modèle de CAM d'embryon de poulet. cellules A549 transfectées avec BRCA2 ASO ont été traités avec le cisplatine pendant 6 heures, puis injecté dans la circulation veineuse d'un embryon de poulet âgé de 9 jours (A). Foyers métastatiques (B) (visualisée à l'aide d'un microscope confocal avec un objectif 40x) ont été comptés neuf jours après l'injection (C). Figure adapté de travail publié avec la permission 22. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
En raison du coût inhérent et le risque associé à des essais cliniques, il est nécessaire de développer une meilleure et plus rigoureuse méthodologie de test pré-clinique pour évaluer adéquatement les nouveaux schémas thérapeutiques anti-cancéreuses. Techniques couramment utilisées toutes les faiblesses actuelles d'exposition qui peuvent limiter leur capacité de distinguer entre cibles thérapeutiques / agents potentiellement prometteurs, et ceux qui peuvent être moins efficaces. Nous avons élaboré un protocole visant à évaluer de nouvelles approches anti-cancer qui aborde un grand nombre des lacunes des méthodes traditionnelles.
Une caractéristique particulièrement importante du protocole décrit est la capacité de mesurer les réponses cellulaires en temps réel, et de suivre les changements dans le métabolisme et le respect minute par minute. Ceci permet l'identification des effets des médicaments, la dose optimale de pointe et une compréhension plus détaillée de l'interaction entre les composants de traitement de la combinaison de médicaments. Simultanément, il donne un aperçu de discrètemaltérations métaboliques te dans les cellules cancéreuses, qui est une information qui ne est pas fourni par comptage cellulaire, l'apoptose, ou dosages colorant conversion. Une limitation de ce dosage est l'incapacité de déterminer avec précision le type de mort cellulaire qui se produit pendant le traitement médicamenteux. Les changements dans la viabilité seront reflétés par des changements dans le respect de la puce de biocapteur, mais cela ne fournissent pas d'informations quant à la manière de la mort cellulaire. Il est également possible d'utiliser la microscopie à fluorescence et les techniques d'imagerie des cellules vivantes pour déterminer des données métaboliques similaires, et ceci peut être utilisé en plus des expériences décrites dans ce protocole 20,21.
En outre, l'utilisation du modèle de CAM d'embryons de poulet pour étudier fréquence métastatique après le traitement est un moyen efficace pour déterminer si une nouvelle cible, un médicament ou combinaison de médicaments diminue la fréquence des cellules cancéreuses qui extravasation et / ou envahissent les tissus environnants. Ce est une question particulièrement pertinente d'un clipoint de vue nique, parce que la maladie métastatique provoque une forte proportion de la mortalité chez les patients atteints de cancer. Un facteur limitant potentiel est que le traitement réel de la drogue ne se produit pas dans la CAM. Au contraire, il se produit ex vivo et les cellules prétraitées sont ensuite injectés dans la CAM. Par conséquent, ce test ne fournit pas de renseignements sur l'absorption de la drogue ou de la distribution in vivo. En outre, les injections intraveineuses de CAM sont techniquement difficiles et nécessitent la pratique significative / expérience.
Nous avons utilisé ce protocole pour évaluer la capacité d'un ASO de BRCA2 ciblage de sensibiliser les cellules tumorales à l'ADN médicament dommageable cisplatine. Les résultats de nos expériences identifiés BRCA2 comme une cible prometteuse pour l'attaque thérapeutique et également fournis justification de la poursuite du développement pré-clinique du BRCA2 ASO comme un médicament candidat. Nous envisageons ce protocole étant utilisé pour identifier de nouvelles cibles pour le traitement de combinaison, en particulier dans le domaine florissant de la DNUne inhibition de la réparation. Nous pensons que ce protocole sera mieux utilisé en plus des techniques les plus courantes dans la biologie du cancer, dans un effort pour évaluer plus rigoureusement nouvelles approches anti-cancer.
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Disclosures
Les auteurs ne ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été rendu possible par des subventions à JK des Centres d'excellence de l'Ontario et le Fonds de la recherche en Ontario.
Nous tenons à remercier Siddika Pardhan et le Dr Peter Ferguson pour l'assistance technique pendant le tournage.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A549 cells | ATCC | CCL-185 | http://www.atcc.org/products/all/CCL-185.aspx |
| AeraSeal film | Carl Roth GmbH | ||
| AMEM | Wisent Bioproducts | 210-011-QK | |
| Antisense oligodeoxynucleotides | Avecia | BRCA2 target sequence: 5' - UAAGGAACGUCAAGAGAUAC - 3' (bases 7241-7259 ) | |
| Axio Zoom V16 Microscope | Carl Zeiss | http://www.zeiss.ca/microscopy/en_ca/products/stereo-zoom-microscopes/axio-zoom-v16.html | |
| Bionas Biosensor Chips | Bionas GmbH and Micronas GmbH | BIS8001D | |
| Bionas Discovery 2500 System | Bionas GmbH | http://www.bionas-discovery.com/prodservices/instruments/system2500/ | |
| Cisplatin | Sigma Aldrich | 479306 | |
| Fertilized chicken eggs | Sourced locally | ||
| Fetal bovine serum | Gibco - Life Technologies | ||
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen - Life Technologies | 12566014 | http://www.lifetechnologies.com/ca/en/home/life-science/protein-expression-and-analysis/transfection-selection/lipofectamine-2000.html |
| PBS | Wisent Bioproducts | 311-010-CL | |
| Trypsin (0.25%)/EDTA | Wisent Bioproducts | 325-043-CL |
References
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