Introduction
Glaucoma primário é uma doença ocular devastador que afeta um número estimado de 60,5 milhões de pessoas em todo o mundo 1, o que pode levar à perda da visão que altera a vida e cegueira 2. A investigação sobre os mecanismos da doença e desenvolvimento de novas terapias para o glaucoma, são dependentes de bons modelos da doença que recapitulam algumas das características da patologia.
Apresentamos aqui um modelo de glaucoma rato com base no método de Samsel et al., 3 O objectivo geral desta técnica é a de aumentar a pressão intra-ocular (PIO) do olho através da injecção de microesferas magnéticas para a câmara anterior, e utilizando um anel magnético, directa -los para o ângulo iridocorneal. Isto impede escoamento do humor aquoso, o que aumenta a pressão intra-ocular, levando a lesão neuronal e perda de células. O protocolo foi desenvolvido para tentar fornecer um modelo mais simples, induzível do glaucoma.
Este protocolo pode ter algumas vantagenssobre as técnicas existentes. Modelos genéticos de ratinho, tais como o DBA / 2J estão disponíveis, que não requerem procedimentos para iniciar; no entanto, estes podem ter um início imprevisível da progressão da doença 4. Em contraste, os modelos indutíveis, a maioria dos quais se baseiam em elevar a PIO cirurgicamente em roedores, tem a vantagem de que a iniciação pode ser controlado pelo utilizador. Alguns destes métodos podem ter inconvenientes da sua própria no entanto, incluindo a ser tecnicamente desafiante 5, e pode requerer múltiplos procedimentos para manter 6 a PIO elevada.
Em contraste, o método inducible detalhado neste manuscrito é uma técnica simples, eficaz e reprodutível, que produz estáveis, aumentos robustos na pressão, com necessidade mínima de reinjeção. Além disso, ele não envolve equipamento caro, e requer apenas habilidade cirúrgica básicos para realizar. Este protocolo pode ser apropriado para os leitores que estão à procura de criar um inducible tecnicamente menos exigentesmodelo de glaucoma em seu laboratório.
Protocol
Declaração de Ética: Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com cuidado e uso Comitê de animal Institucional (IACUC), e foram aprovados de acordo com as diretrizes do Reino Unido Home Office ( http://goo.gl/FLkirW , acessado pela última vez a 10 de Junho de 2014) e da Declaração de ARVO para o Uso de Animais em Oftalmologia e Vision Research ( http://goo.gl/4LFOjD , acessado pela última vez dia 10 de junho de 2014).
1. Ocular Hypertension Indução
- Induzir glaucoma experimental, elevando a pressão intra-ocular (PIO) por meio de injecção unilateral de microesferas paramagnéticas para a câmara anterior de ratos Brown Norway, com base no método de Samsel et al. Outros 3 ratos pigmentados pode ser adequado, embora estes teriam de ser validado em primeiro lugar pelo utilizador.
- Casa 250-300 g femininoratos ex-criador Brown Noruega em um ambiente com pouca luz constante (40-60 lux) para minimizar flutuações diurnas em IOP 7, com acesso a comida e água ad libitum.
- Tome medidas de PIO basal em animais acordados 8 antes da anestesia e injeção talão, usando um tonômetro de rebote calibrado para uso no olho de rato 9. PIO é tomada como a média de cinco leituras.
- Anestesiar ratos com 37,5 mg / kg de cetamina e 0,25 mg / kg de cloridrato de medetomidina entregue intraperitonealmente. Confirme profundidade da anestesia, testando reflexos nos pés traseiros do animal, antes da aplicação de iodo povidona (veja o passo 1.5), e injeção de talão (veja o passo 1.8). Administrar 0,5% de cloridrato de proparacaína para analgesia.
Nota: Não dilatar a pupila em qualquer fase. Isso vai ajudar as contas para resolver melhor no ângulo iridocorneal, e impedir a ligação à lente. Aplicar pomada ocular para evitar o ressecamento da córnea on-operado un olho contralateral. - Wash o olho operativa com 5% de povidona iodo na água 10 5 min antes da injecção.
- Após 5 min, o pavio de iodo povidona fora com gaze estéril, e lavar o olho com solução salina estéril a 0,9%. Mantenha o olho úmido durante a anestesia com a aplicação regular de solução salina estéril.
- Coloque um ímã toroidal em torno do olho.
- Injecte 25 ul de uma solução contendo 30 mg / ml de gama-irradiação esterilizado 8 mm microesferas magnéticas em Solução Salina Equilibrada de Hank (HBSS) para a câmara anterior, usando uma agulha 33 G chanfrada.
- Para preparar os grânulos, lavagem por re-suspensão, seguida de centrifugação de 3 vezes a 10.000 xg durante 5 minutos com 1 ml de HBSS, antes de fazer a final / solução de 30 mg ml. Manter condições estéreis por toda parte.
- Para injecção, ter o cuidado de evitar a inserção da agulha para a íris, para minimizar o risco de trauma íris. Isto pode ser evitado por orientar a agulha tangente à superfície da córnea, como paralelaa íris possível. Isso também irá ajudar a minimizar a perda de talão do local da injeção.
NOTA: Injectar pérolas a um ritmo acelerado para garantir uma distribuição uniforme em todo o ângulo iridocorneal, o que é fundamental para o aumento da pressão intra-ocular. Além disso, armazenar os grânulos, agulhas e anéis magnéticos separadamente, de modo que os grânulos não formarem aglomerados, o que os torna difíceis de carregar para dentro da seringa e injectar, e a agulha não se torna magnetizado.
- Deixar a agulha no lugar durante 1 min pós-injecção para assegurar que os grânulos resolver no ângulo iridocorneal para impedir a drenagem aquosa a partir da rede trabecular. Um pouco ângulo a agulha depois de as contas tenham estabelecido inicialmente para permitir algum vazamento do humor aquoso, para minimizar aumentos transitórios da pressão intra-ocular. No final da cirurgia, o expulsar através da agulha com o primeiro tampão de fosfatos salino (PBS), em seguida etanol a 70%, seguido por água destilada, para assegurar o uso continuado da agulha em procedimentos separados. Alternativamente, pode-se utilizaragulhas descartáveis, se a combinação correta de calibre e seringa está disponível. Opcionais: agulhas podem ser afiada usando um beveller para prolongar o seu uso.
- Nesta fase, se necessário, retire o ímã, e usá-lo para desenhar grânulos em áreas de cobertura incompleta.
- Deixe o ímã no lugar em torno do olho por mais 10 minutos após a injecção de assegurar contas de resolver bem no ângulo iridocorneal.
- Anestesia reversa usando 0,25 mg / kg de cloridrato de atipemezole.
- Administrar o cloranfenicol, ou outra pomada de antibiótico, por exemplo, gentamicina ou terramicina topicamente para evitar a infecção, e 0,5% de cloridrato de proparacaína para analgesia. Deixe os animais para se recuperar em uma esteira de calor até que recuperar o movimento, então a transferência para uma caixa quente e abastecimento com a nutrição adicional, como um suplemento alimentar ou dieta regular umedecido até a recuperação é completa. Analgesia sistêmica ou local deve ser dada aos animais que apresentam sinais de dor 24 horas após a cirurgia. Se these os sintomas persistirem apesar do tratamento, os animais devem ser humanamente abatidos.
- Use o olho contralateral como controle não operado.
- Efectuar as medições de IOP cada 2-3 dias após a administração do grânulo, e em seguida cada 2-3 dias utilizando um tonómetro rebote calibrado para utilização no olho de rato 9.
- Os critérios para a inclusão de olhos em estudos pode ser: se: 1) o IOP é elevada acima da pressão de controlo contralateral por 5 mmHg, e 2) não excede 60 mmHg.
- Olhos, onde a pressão de retorno à linha de base (normalmente de 1 semana de pós-injecção) não devem ser incluídos nos estudos, no entanto, é possível re-injectar grânulos em olhos que não conseguem desenvolver PIO elevada se desejado.
- Eutanásia animais por asfixia com CO 2 no final da experiência.
- Dissecar olhos e nervos ópticos, e fixar em 4% de paraformaldeído (PFA) durante a noite, para posterior análise histológica.
2. Avaliar Retinal Neuron Danos Utilizando TUNEL Staining
- Para quantificar células em apoptose em todo mount retinasuse o ensaio deoxynucleotidyl terminais mediada-transferase dUTP nick-rotulagem (TUNEL), de acordo com as instruções do fabricante.
- Dissecar a retina a partir da taça para os olhos, para lavagem de 3 x 5 min em 0,3% de Triton X-100 em solução salina de fosfato tamponada (PBS-T).
- Permeabilizar o tecido em 3% de T-PBS durante 2 h.
- Pré-equilibrar retinas em Tampão de Equilíbrio de 10 min, antes da incubação em solução de reacção TUNEL durante 1 hora a 37 ° C.
- Lave o tecido para 3 x 5 min em 0,3% T-PBS, lavar em 0,3% T-PBS contendo 5 mM DAPI, e flat-montagem em meios de montagem.
- Para quantificar TUNEL núcleos positivos usar um microscópio confocal para ter 10 mm z pilhas através da camada de células ganglionares com ampliação de 20x. Tome 3 imagens em cada uma das quatro pétalas, em locais próximos do nervo óptico, em meados da década de periferia, e na periferia longe da retina, dando um total de 12 imagens por toda Mount, a amostragem cerca de 7.000 células. Critérios morfológicos discriminados não neuronal (endotelial e da glia) células a partir de células neuronais.
- Selecionar áreas para imagens usando apenas o canal DAPI, e os investigadores de máscara para os grupos de tratamento.
3. Avaliação Optic Nerve Damage Usando Toluidine azul Coloração
- Fix nervos ópticos durante a noite em solução de Karnovsky a 4 ° C.
- Tratar as amostras durante 2 horas em 1% (w / v) de tetróxido de ósmio e, em seguida desidratar em etanol a 100%.
- Incubar nervos ópticos em óxido de propileno durante 30 min, e em colocar uma mistura de óxido de propileno de 50:50: durante a noite araldite.
- Alterar esta solução a 100% de araldite, seguido por incubação durante a noite a 60 ° C.
- Corte cortes semifinos seções (0,75 mm de espessura) e mancha com 1% de azul de toluidina / bórax (TB) em etanol a 50% antes do exame por microscopia de luz.
4. Análise estatística
- Realizar ana estatísticalisa usando um pacote de software estatístico adequado. A two-way ANOVA com teste post-hoc de Newman-Keul pode ser usado para calcular a significância estatística para IOP muda ao longo do tempo.
- Um valor de p inferior a 0,05 pode ser considerado significativo.
Representative Results
A injecção de contas magnéticas para o ângulo iridocorneal induziu consistentemente um aumento prolongado e robusto em pressão (Figura 1), que foi prontamente observável no primeiro ponto temporal, 3 dias após a injecção. Além disso, o aumento da pressão foi mantida durante toda a duração da experiência, e, embora o tempo de curso terminado aos 18 dias pós-injecção, outros relataram que a pressão persistir a longo prazo 3. A média da PIO média em toda a extensão da experiência para o controle, os olhos não talão injectados foi de 19,7 ± 0,3 mmHg, em comparação com 40,5 ± 2,8 mmHg para os olhos injetados com pérolas (P <0,001). Além disso, o pico de pressão intra-ocular aumentada de 22,8 ± 0,3 mmHg, para 49,9 ± 2,3 mmHg.
Para determinar se a elevação da pressão intra-ocular conduz à morte das células ganglionares da retina, foi realizada a coloração TUNEL em retinas, e histologia em secções transversais do nervo óptico (Figura 2). Na retina observou-se um aumento no TUNEL coloração (Figura 2A) nos olhos com injeção de talão com PIO elevada. O número de células apoptóticas aumentou cerca de 15 vezes, de 1,6 ± 0,5 células em controlos contralaterais, para 24,5 ± 0,5 células em retinas hipertensos (Figura 2B; P <0,05). Além disso, nos olhos em que as esferas magnéticas foram injectados mas não aumentou a pressão (provavelmente devido ao bloqueio incompleto do ângulo iridocorneal), os números de células positivas TUNEL não foram significativamente diferentes das dos controlos não injectados (P> 0,05). Isto sugere que a morte celular foi relacionado com o aumento de pressão, não devido à toxicidade directa das microesferas magnéticas. Finalmente, foram investigadas patologia do nervo óptico no modelo de glaucoma, e vi acumulação de azul de toluidina em muitos dos axónios, indicando degeneração destes processos celulares (Figura 2C).
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Figura 1. A elevação da pressão intra-ocular usando microesferas magnéticas. A injecção de microesferas magnéticas para a câmara anterior induzida, um robusto aumento significativo na pressão intraocular (PIO) em comparação com o controlo contralateral, olhos não injectados. Unidades do eixo Y = milímetros de mercúrio (mmHg). Dados = média ± SEM. * = P <0,001; N = 12. Este valor foi modificado a partir Foxton et al, Am.. J. Pathol 182 (4):. 1379-1390.
Figura 2. Elevação da pressão intra-ocular, por injecção de microesferas magnéticas para o ângulo iridocorneal, morte neuronal induzida na camada de células ganglionares (GCL). (A) Imagens representativas de retinas de controle (à esquerda) e glaucoma (à direita) olhos manchados de núcleos apoptóticos por TUNEL (verde;setas brancas) e DAPI (azul), com indicação do número de núcleos apoptóticos aumentada como IOP Rose. (B) Quantificação de células TUNEL positivas no GCL, mostrando que os olhos com PIO elevada (no meio), tinham células significativamente mais apoptóticos em comparação com controle (esquerda). Em contraste, nos olhos com injeção de talão onde a pressão não subir (à direita), não foi observado aumento significativo na coloração TUNEL. Dados = média ± SEM. * = P <0,05; N = 7-8 (C) Imagens representativas de coloração nervo óptico, o que demonstra um aumento na acumulação azul de toluidina (setas pretas) em axônios danificados do glaucoma (à direita), mas não controlam os olhos (esquerda).. Barras de escala = 50 um. Este valor foi modificado a partir Foxton et al., Am. J. Pathol 182 (4):. 1379-1390.
Discussion
Aqui demonstramos um método para a indução de PIO elevada em ratos, por injecção de microesferas magnéticas para dentro da câmara anterior do olho. Este método é simples de realizar, e requer pouca experiência cirúrgica, ou horas de prática e requinte. Além disso, o procedimento é eficaz; raramente exigindo mais do que uma única injecção de grânulos para induzir um aumento forte e robusta em pressão (cerca de 10% a taxa de re-injecção). Isto pode fornecer uma vantagem sobre os métodos induz�eis existentes, como a veia episceral tecnicamente desafiador esclerose 11 modelo, ou protocolo de fotocoagulação a laser 6, o que pode exigir vários procedimentos para manter levantadas IOP.
Para que o método seja bem sucedido no entanto, existem alguns pequenos passos críticos que precisam de ser tomadas. Em primeiro lugar, é útil utilizar um íman em forma de toroidal para desenhar grânulos no ângulo iridocorneal. Este passo é uma modificação do protocolo original, where os grânulos foram injectados na câmara anterior, e, em seguida, movidos à mão livre em torno do olho 3. Usando um ímã toroidal significa que microesferas deve resolver uniformemente ao redor do ângulo, exigindo redistribuição manual do mínimo. Em segundo lugar, a taxa de injecção deve ser rápido - muito lento e os grânulos irão acumular-se predominantemente de um dos lados do ângulo, que conduz a uma cobertura incompleta, e, potencialmente, qualquer subida da pressão. De um modo geral, porém, o método é suficientemente simples para que o utilizador pode facilmente efectuar modificações ao protocolo, tais como a variação do tamanho ou do volume das partículas de microsferas, talvez para tentar alterar o grau de elevação da PIO.
No entanto, uma desvantagem potencial do método é que se tem pouco controlo sobre a extensão da hipertensão, em que cerca de 5-10% dos casos observamos subiu acima de 60 mmHg. Aumentos excessivos na IOP pode ser muito destrutivo para os tecidos da retina, e pode fazer a estudar os mecanismos e biologia da morte celular desafiando. No entanto, o método produz uma patologia neuronal coerente, tanto na retina e nervo óptico, que pode ser manipulado farmacologicamente 12. Isto pode tornar o modelo atractivo para o desenvolvimento de novas terapias para o tratamento de glaucoma. Além disso, porque as esferas são direccionadas para o ângulo iridocorneal, esta deixa livre o eixo visual de imagens em tempo real do disco óptico ou da retina. Prevemos que este modelo será adaptado e utilizado para futuras aplicações em outras espécies, incluindo mouse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 250 - 300g female Brown Norway ex-breeder rats | Harlan UK | 203 | |
| Tonolab Rebound Tonometer | Tiolat | TV02 | |
| Ketaset (ketamine) | Fort Dodge Animal health | BN1000118 | 37.5 mg/kg |
| Domitor (medetomidine hydrochloride) | Orion Pharma | 140-999 | 0.25 mg/kg |
| Povidone iodine | Ecolab | BN4369LE10 | 5% in H2O |
| Minim's Saline Solution | Bausch and Lomb | PL00033/5017 | |
| Toroidal magnet | Supermagnete | R-10-07-03-N | |
| Magnetic Microspheres | Bangs Laboratories | UMC4N/9692 | |
| HBSS | Invitrogen | 14025 | |
| 33 G beveled needle | Hamilton | 7747-01 | Custom needle |
| Luer tip syringe | Hamilton | 80601 | |
| Antisedan (atipemezole hydrochloride ) | Orion Pharma | 141-003 | 0.25 mg/kg |
| Chloramphenicol ointment | Medicom | 18956-0005 | |
| TUNEL staining kit | Promega | G3250 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Vectashield mounting media | Vector Labs | H-1000 |
References
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