Introduction
Birincil glokom hayat değiştiren görme kaybı ve körlük 2 yol açabilir dünya genelinde yaklaşık 1 60.500.000 kişiyi etkileyen yıkıcı bir göz hastalığıdır. Hastalık mekanizmalarına Araştırma ve glokom için yeni tedavilerin geliştirilmesi, patoloji işaretlerinden bazıları recapitulate hastalığın iyi modelleri bağlıdır.
Biz SAMSEL ark yöntemine göre burada bir sıçan glokom modeli sunuyoruz. 3 Bu tekniğin genel amacı, doğrudan ön kamaraya manyetik mikroküreler enjekte ve manyetik halka kullanılarak göz içi basıncı (GİB) artırmak için Onları iridokorneal açı içine. Bu nöronal hasar ve hücre kaybına yol açan, göz içi basıncını artırır sulu çıkış, engeller. protokol glokom basit, uyarılabilir modeli sağlamak girişimi için geliştirilmiştir.
Bu protokol, bazı avantajlara sahip olabilirMevcut teknikler üzerinde. Böyle DBA / 2J gibi genetik fare modelleri başlatmak için prosedürleri gerekmez, hangi mevcuttur; Ancak bu hastalığın ilerlemesi 4 bir öngörülemeyen başlangıcı olabilir. Bunun aksine, cerrahi kemirgenlerde göz içi basıncını yükseltme kullanan çoğu uyarımlı modelleri, başlatma kullanıcı tarafından kontrol edilebilir avantajına sahiptir. Bu yöntemlerden bazıları da dahil olmak üzere 5 teknik açıdan zorlayıcı olmak, ancak kendi sakıncaları olabilir ve yüksek GİB 6 korumak için birden fazla prosedürleri gerektirebilir.
Bunun aksine, bu yazıda ayrıntılı olarak uyarılabilir bir yöntem tekrar enjeksiyon için en az ihtiyacı olan basınç sabit ve sağlam bir artış meydana getiren bir basit, etkili ve yeniden üretilebilir bir tekniktir. Ayrıca, pahalı ekipman anlamına gelmez, sadece gerçekleştirmek için temel cerrahi beceri gerektirir. Bu protokol, daha az teknik zorlu uyarılabilir kurmak isteyen okuyucular için uygun olabilironların laboratuvarda glokom modeli.
Protocol
Etik deyimi: Tüm hayvan deneyleri Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) uyarınca yapılmıştır, ve Birleşik Krallık Ev Ofis kurallarına anlaşma (onaylandı http://goo.gl/FLkirW , son 10 th Haziran erişilen , 2014) ve Oftalmik ve Vizyon Araştırma (Hayvanların Kullanım ARVO Bildirimi http://goo.gl/4LFOjD , son 10 th Haziran, 2014) erişilen.
1. Oküler Hipertansiyon İndüksiyon
- SAMSEL ve arkadaşlarının metoduna göre, Kahverengi Norveç sıçanlarının ön kamaraya para-manyetik mikro-enjeksiyon ile tek taraflı göz içi basıncı (IOP) yükseltmek yoluyla deneysel glokom yol açar. Bu doğrulanması gerekir, ancak 3 diğer pigmentli sıçanları uygun olabilir Kullanıcı tarafından ilk.
- Ev 250-300 g kadınsabit düşük ışık ortamında (40-60 lux) ex-damızlık Brown Norveç sıçanları yiyecek ve su ad libitum erişim, GİB 7 günlük dalgalanmaları en aza indirmek için.
- Sıçan göz 9 kullanılmak üzere kalibre bir toparlanma tonometresi kullanılarak, önceden anestezi ve boncuk enjeksiyon uyanık hayvanlarda 8 bazal GİB ölçümleri alın. IOP beş okumanın ortalaması olarak alınmıştır.
- Intraperitoneal 37.5 mg / kg ketamin, ve 0.25 mg / kg medetomidin hidroklorür ile sıçanları anestezi uygulayın. Hayvanın arka ayak refleksleri test ederek anestezi derinliği onaylayın, iyot uygulaması (adım 1.5 bakınız), ve boncuk enjeksiyon Povidon önce (adım 1.8 bakınız). Analjezi için% 0.5 proparakain hidroklorür yönetme.
NOT: Herhangi bir aşamada öğrenciye dilate etmeyin. Bu boncuklar iridokorneal açı içine daha iyi yerleşmek için yardımcı ve lens bağlayıcı önleyecektir. Un çalışan kontralateral göz kornea kurumasını önlemek için göz merhemi sürün. - Wsu enjeksiyon öncesinde 10 5 dk% 5 povidon iyot ile ameliyat göz kül.
- 5 dakika sonra, steril gazlı bez kullanılarak kapalı povidon iyot fitil, ve% 0.9 steril tuzlu su çözeltisi ile göz yıkayın. Steril serum fizyolojik düzenli uygulama ile anestezi sırasında nemli gözünüz.
- Gözün etrafında bir toroidal mıknatıs yerleştirin.
- Bir 33 G eğimli iğne kullanılarak 30 mg / ön kamaraya Hank Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) içinde 8 mikron manyetik mikro-sterilize gama radyasyonun ml ihtiva eden bir çözelti, 25 ul enjekte edilir.
- Taneler hazırlamak için, daha sonra nihai 30 mg / ml solüsyon yapmadan önce, 1 ml HBSS ile 5 dakika boyunca 10,000 x g'de 3 kez santrifüje tabi tutarak, yeniden süspansiyon haline getirilerek yıkayın. Boyunca steril koşullar koruyun.
- Enjeksiyon için, iris travma riskini en aza indirmek için, iris iğne takmadan önlemek için dikkatli olun. Buna paralel olarak, kornea sathına teğet bir şekilde bir iğne yönlendirici önlenebilirmümkün olduğunca iris. Bu aynı zamanda enjeksiyon yerinde boncuk kaybını en aza indirmek için yardımcı olacaktır.
NOT: IOP yükseltilmesi için kritiktir iridokorneal açısı çevresinde eşit bir dağılımını sağlamak için bir hızla boncuk enjekte edilir. Ayrıca, mağaza boncuk, iğne ve manyetik halkalar ayrı ayrı boncuk şırınga yüklemek ve enjekte etmek zorlaştırır, kümeler oluştururlar kalmamak ve iğne manyetize olmaz.
- Boncuklar trabeküler ağ sulu drenaj engellemek için iridokorneal açı içine yerleşmek sağlamak için 1 dakika sonrası enjeksiyon yerinde iğne bırakın. Biraz açı boncuk sonra iğne başlangıçta GİB geçici artışlar en aza indirmek için, sulu bazı sızıntı izin yerleşmiş. Operasyonun sonunda ilk fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile iğne ile yıkayın, sonra damıtılmış su, ardından% 70 etanol, ayrı işlemler iğnenin sürekli kullanımını sağlamak için. Seçenek olarak ise, bir kullanabilirDoğru göstergesi ve şırınga kombinasyonu varsa tek iğne. İsteğe bağlı: iğneler kullanımını uzatmak için bir beveller kullanılarak bilenmiş olabilir.
- Bu aşamada gerekirse anda, mıknatıs kaldırmak ve eksik kapsama alanları içine boncuk çekmek için kullanabilirsiniz.
- Boncuklar iridokorneal açı içine iyice yerleşmek sağlamak için daha 10 dakika sonrası enjeksiyon için göz çevresinde mıknatısı yerinde bırakın.
- 0.25 mg / kg atipemezole hidroklorür Ters anestezi.
- Enfeksiyonu önlemek için topikal, örneğin gentamisin veya Terramisin için kloramfenikol, ya da diğer antibiyotik merhem, yönetme ve analjezi için% 0.5 proparakain hidroklorür. Onlar hareketi yeniden kadar, ısı mat kurtarmak için hayvanların bırakın kurtarma tamamlanana kadar sonra böyle bir gıda takviyesi ya da nemlendirilmiş düzenli diyet gibi ek beslenme, sıcak bir kutu ve arz transfer. Sistemik ya da lokal analjezi ameliyat sonrası ağrı, 24 saat sergileyen hayvanlara verilmelidir. Thes EğerE belirtiler tedaviye rağmen devam ediyorsa, hayvanlar insanca itlaf edilmelidir.
- Bir işlem görmemiş kontrol olarak kontralateral göz kullanın.
- Boncuk verilmesini takiben 2-3 günde GİB ölçümleri alın ve her 2-3 gün sonra sıçan göz 9 kullanılmak üzere kalibre bir rebound tonometresi kullanarak.
- 1) GİB 5 mmHg karşı kontrol basıncı üzerinde yükselir ve eğer 2) 60 mmHg geçmemesi: çalışmalarda gözler dahil olmak üzere kriterler olabilir.
- (Genellikle 1 hafta sonrası enjeksiyon) başlangıca basınç döner çalışmalara dahil edilmemelidir Gözler, ancak istenirse yüksek GİB geliştirmek için başarısız gözünde yeniden enjekte boncuk mümkündür.
- Deneyin sonunda CO 2 boğularak hayvanları Euthanize.
- Gözleri ve optik sinirleri incelemek ve bir gecede ileri histolojik analiz için% 4 paraformaldehid (PFA) düzeltmek.
2. TÜNEL S Kullanma Retina Nöron Hasar Değerlendirmeronyum
- Üreticinin talimatlarına uygun olarak, terminal deoksinükleotidil transferaz aracılı dUTP çentik etiketleme (TÜNEL) deneyi retinasuse bütün montaj apoptotik hücrelerin miktarının ölçülmesi amacıyla.
- Fosfat içinde% 0.3 Triton X-100 3 x 5 dakika boyunca tamponlu tuzlu su (T-PBS) ile akıtılarak, göz fincan retina ayır.
- 2 saat süre ile% 3, T-PBS içinde doku geçirgenliği.
- 37 ° C'de 1 saat boyunca TÜNEL tepkime çözeltisi içinde inkübe edilmeden önce, 10 dakika süre ile, dengeleme tamponunda retina önceden dengeye getirin.
- % 0.3 T-PBS 5 mcM DAPI içeren durulayın,% 0.3 T-PBS içinde 3 x 5 dakika doku yıkayın ve montaj medya düz monte.
- TUNEL pozitif çekirdekler 20X büyütmede ganglion hücre tabakası ile 10 mikron z-yığınları almak için bir konfokal mikroskop kullanmak ölçmek için. Bütün Moun başına 12 görüntü toplam veren, retinanın uzak çevresinde orta periferdeki, optik sinire yakın bölgelerde, 4 yaprakları her birinde 3 fotoğraf çekin vet, yaklaşık 7.000 hücreleri örnekleme. Morfolojik kriterler nöronal hücrelerin nöronal olmayan (endotelyal ve glial) hücreleri ayırt.
- Tedavi gruplarına sadece DAPI kanalı ve maske müfettişler kullanarak görüntüleme için alanları seçin.
3. Toluidin Mavi Boyama kullanma Optik Sinir Hasar Değerlendirme
- Gece boyunca 4 ° C 'de Karnovsky çözeltisi optik sinirleri düzeltildi.
- % 1 (ağ / hac) ozmiyum tetroksit içinde 2 saat için numune tedavi ve daha sonra% 100 etanol içinde dehidre olmaktadır.
- 30 dakika boyunca, propilen oksit optik sinirleri inkübe ve propilen oksidin bir 50:50 karışımda yer: Araldit gece boyunca karıştırılmıştır.
- Gece boyunca 60 ° C'de kuluçkalandı ve ardından% 100 Araldit için bu çözüm, değiştirin.
- Kesme yarı ince kesitler (0.75 mm kalınlığında) ve ışık mikroskobu ile incelenmesi önce% 50 etanol içinde% 1 toluidin mavisi / boraks (TB) ile leke.
4. İstatistiksel Analiz
- İstatistiksel Adana''konulu yürütmekUygun bir istatistik yazılım paketi kullanarak lyses. Newman-Keul post-hoc testi ile bir iki-yönlü ANOVA IOP zamanla değişen istatistiksel açıdan anlamlı hesaplamak için kullanılabilir.
- Az 0.05 p değeri anlamlı kabul edilebilir.
Representative Results
Iridokorneal açıyla manyetik boncuk enjeksiyon sürekli birinci zaman noktasında, 3 gün sonra enjeksiyon de, hali hazırda gözlenebilir olduğu basınç olarak uzun süreli ve güçlü bir artış (Şekil 1), neden oldu. Ayrıca, basınç artışı Deney süresi boyunca muhafaza edilmiştir, ve zaman süreci 18 gün sonrası enjeksiyon bitmiş olsa da, diğerleri basınç uzun vadeli 3 devam ettiğini bildirmişlerdir. ortalama GİB kontrolü için deney tam uzunluğu boyunca ortalama olmayan boncuk boncuk gözleri enjekte enjekte gözler için 40.5 ± 2.8 mmHg (p <0.001) ile karşılaştırıldığında, 19.7 ± 0.3 mmHg idi. Ayrıca, zirve GİB 49.9 ± 2.3 mmHg 22.8 ± 0.3 mmHg yükselmiştir.
GİB yüksekliği retina ganglion hücrelerinin ölümüne yol açar belirlemek için, biz (Şekil 2) enine optik sinir kesitleri üzerinde TÜNEL retina üzerine boyama ve histoloji gerçekleştirdi. Retinasında Biz yüksek GİB ile boncuk enjekte gözlerde TÜNEL boyama (Şekil 2A) bir artış gözlendi. (p <0.05 Şekil 2B) apoptotik çekirdeklerin hipertansif retinalarında 24.5 ± 0.5 hücrelere, karşı taraftaki kontrollere 1.6 ± 0.5 hücrelerinden yaklaşık 15 katlık bir artış göstermiştir. Ayrıca, gözlerde olan manyetik boncuk enjekte edildi, ancak basınç (nedeniyle iridokorneal açı eksik tıkanma olasılığı) artmadı, TUNEL-pozitif hücrelerin sayısı uninjected kontroller (p> 0.05) anlamlı olarak farklı değildi. Bu hücre ölümü manyetik mikroküreler doğrudan toksisitesi nedeniyle değil basınç artar, ilişkili olduğunu göstermektedir. Son olarak, glokom modelinde optik sinir patoloji inceledik ve bu hücresel süreçlerin (Şekil 2C) dejenerasyon gösteren, aksonların birçok toluidin mavisi birikimi gördü.
ure 1 "src =" / files / ftp_upload / 52.400 / 52400fig1highres.jpg "/>
Ön kamaraya manyetik mikroküreler Şekil 1. manyetik mikroküreler kullanılarak göz içi basıncının yükselmesi. Enjeksiyon karşı kontrolü, sigara enjekte gözlere kıyasla göz içi basıncı (GİB) sağlam bir önemli artış kaynaklı. Y-ekseni birimleri = milimetre cıva (mmHg). Veriler = ortalama ± SEM. * = P <0.001;., N = 12 Bu rakam Foxton ve arkadaşları, Am modifiye edilmiştir. J. Pathol 182 (4):. 1379-1390.
Ganglion hücre tabakası (GCL) nöronal ölüm kaynaklı iridokorneal açı içine manyetik mikroküreler enjeksiyonu ile GİB 2. Yükselmesi Şekil. (A) kontrol (solda) ve glokom TUNEL (yeşil ile apoptotik çekirdeklerin için lekeli (sağ) gözlerden retina Temsilcisi görüntüleri;GİB gül gibi apoptotik çekirdeklerin sayısı arttı belirten beyaz oklar) ve DAPI (mavi),. (B) GCL TUNEL pozitif hücrelerin miktarının belirlenmesi, yüksek GİB (orta) ile gözler, kıyasla önemli ölçüde daha fazla apoptotik hücreler olduğunu gösteren Kontrol (solda). Bunun aksine, boncuk enjekte gözlerde basıncı, TÜNEL lekelemesi olarak önemli bir artış gözlenmiştir (sağ) yükselmedi burada. Veriler = ortalama ± SEM. * = P <0.05; N = 7 - 8 (C) Temsilcisi optik sinir boyama görüntüleri, glokom (sağda) zarar görmüş akson toluidin mavisi birikimi bir artış (siyah oklar) gösteren, ancak kontrol edemez gözler (solda).. Ölçek çubukları 50 mikron =. Bu rakam, Foxton diğerleri modifiye edilmiştir., Am. J. Pathol 182 (4):. 1379-1390.
Discussion
Burada gözün ön odasına manyetik mikro-enjekte edilerek sıçan yüksek göz içi basıncı sağlamak için bir yöntem ortaya koymaktadır. Bu yöntem yürütmek için basit ve küçük cerrahi uzmanlık gerektiren, ya da uygulama ve arıtma saat. Ayrıca, işlemde etkilidir; nadiren basınç güçlü ve kuvvetli bir artış (yaklaşık% 10 yeniden enjeksiyon oranı) ikna etmek için tanelerin tek bir enjeksiyon daha gerektirir. Bu GİB kaldırdı saklamalıdır için birden fazla prosedürleri gerektirebilir 11 modeli, ya da lazer fotokoagülasyon protokolü 6, skleroz gibi teknik açıdan zor episceral ven gibi mevcut uyarılabilir yöntemler üzerinde bir avantaj sağlayabilir.
Ancak başarılı olmak için yöntemde için, alınması gereken bazı küçük kritik adımlar vardır. İlk olarak iridokorneal açıyla boncuklar çekmek için bir toroid şeklinde mıknatıs kullanmak yararlıdır. Bu adım Orijinal protokol, nereye bir değişiklikE boncuklar, anteryor odacık içine enjekte edilir ve daha sonra göz 3 çevresinde serbestçe bir taşınmıştır. Toroidal mıknatıs kullanarak mikroküreler az manuel yeniden dağıtıma gerektiren, açı etrafında eşit yerleşmek gerektiği anlamına gelir. Çok yavaş ve boncuk ağırlıklı eksik içerisinde, ve potansiyel olarak herhangi bir baskı artışa yol açan, açının bir tarafında birikir - İkinci olarak, püskürtme oranı, hızlı olmalıdır. Genellikle olsa konuşma, yöntem kullanıcı kolayca belki GİB yüksekliği derecesini değiştirmek girişimi için, Mikroküre parçacıkların boyutu veya hacmi değişen olarak protokole değişiklikler yapabiliriz yeterince basittir.
Ancak, yöntemin bir potansiyel dezavantajı bir gözlediğimiz vakaların yaklaşık% 5-10'unda 60 mmHg üzerinde yükseldi hipertansiyon, ölçüde üzerinde çok az kontrole sahip olmasıdır. GİB aşırı artışların retina dokusuna çok yıkıcı olabilir, mekanizmaları ve biyo eğitim yapabilirhücre ölümü logy zorlu. Bununla birlikte, yöntem, farmasötik olarak 12 manipüle edilebilir retina ve optik sinir, hem de tutarlı nöronal patoloji üretir. Bu glokom tedavisi için yeni terapötik maddelerin geliştirilmesi için model, çekici hale getirmektedir. Boncuklar iridokorneal açı içine yönlendirilir, çünkü Ayrıca, bu retina veya optik disk canlı görüntüleme için ücretsiz bir görsel ekseni bırakır. Bu model, uyarlanmış ve fare de dahil olmak üzere diğer türlerdeki gelecek uygulamalar için kullanılacak tahmin ediyoruz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 250 - 300g female Brown Norway ex-breeder rats | Harlan UK | 203 | |
| Tonolab Rebound Tonometer | Tiolat | TV02 | |
| Ketaset (ketamine) | Fort Dodge Animal health | BN1000118 | 37.5 mg/kg |
| Domitor (medetomidine hydrochloride) | Orion Pharma | 140-999 | 0.25 mg/kg |
| Povidone iodine | Ecolab | BN4369LE10 | 5% in H2O |
| Minim's Saline Solution | Bausch and Lomb | PL00033/5017 | |
| Toroidal magnet | Supermagnete | R-10-07-03-N | |
| Magnetic Microspheres | Bangs Laboratories | UMC4N/9692 | |
| HBSS | Invitrogen | 14025 | |
| 33 G beveled needle | Hamilton | 7747-01 | Custom needle |
| Luer tip syringe | Hamilton | 80601 | |
| Antisedan (atipemezole hydrochloride ) | Orion Pharma | 141-003 | 0.25 mg/kg |
| Chloramphenicol ointment | Medicom | 18956-0005 | |
| TUNEL staining kit | Promega | G3250 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Vectashield mounting media | Vector Labs | H-1000 |
References
- Quigley, H. A., Broman, A. T. The number of people with glaucoma worldwide in 2010 and 2020. Br J Ophthalmol. 90 (3), 262-267 (2006).
- Weinreb, R. N., Aung, T., Medeiros, F. A. The pathophysiology and treatment of glaucoma: a review. JAMA. 311 (18), 1901-1911 (2014).
- Samsel, P. A., Kisiswa, L., Erichsen, J. T., Cross, S. D., Morgan, J. E. A novel method for the induction of experimental glaucoma using magnetic microspheres. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (3), 1671-1675 (2011).
- Libby, R. T., et al. Inherited glaucoma in DBA/2J mice: pertinent disease features for studying the neurodegeneration. Vis Neurosci. 22 (5), 637-648 (1017).
- Morrison, J. C. Elevated intraocular pressure and optic nerve injury models in the rat. J Glaucoma. 14 (4), 315-317 (2005).
- Levkovitch-Verbin, H., et al. Translimbal laser photocoagulation to the trabecular meshwork as a model of glaucoma in rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 43 (2), 402-410 (2002).
- Moore, C. G., Johnson, E. C., Morrison, J. C. Circadian rhythm of intraocular pressure in the rat. Curr Eye Res. 15 (2), 185-191 (1996).
- Morrison, J. C., Jia, L., Cepurna, W., Guo, Y., Johnson, E. Reliability and sensitivity of the TonoLab rebound tonometer in awake Brown Norway rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (6), 2802-2808 (2009).
- Wang, W. H., Millar, J. C., Pang, I. H., Wax, M. B., Clark, A. F. Noninvasive measurement of rodent intraocular pressure with a rebound tonometer. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (12), 4617-4621 (2005).
- Isenberg, S. J.
- Morrison, J. C., et al. A rat model of chronic pressure-induced optic nerve damage. Exp Eye Res. 64 (1), 85-96 (1997).
- Foxton, R. H., et al. VEGF-A is necessary and sufficient for retinal neuroprotection in models of experimental glaucoma. Am J Pathol. 182 (4), 1379-1390 (2013).
