Abstract
La membrane chorioallantoïque poussin (CAM) commence à se développer au jour 7 après la fécondation et mûrit par jour 12. Le CAM est naturellement immunodéficientes et très vascularisée, ce qui en fait un système idéal pour l'implantation de la tumeur. En outre, la CAM contient des protéines de la matrice extracellulaire comme la fibronectine, la laminine, le collagène, l'intégrine alpha (v) beta3, et la MMP-2, ce qui en fait un modèle attractif pour étudier l'invasion tumorale et les métastases. Les scientifiques ont longtemps profité de la physiologie de la CAM en utilisant comme modèle de l'angiogenèse. Plus récemment, le dosage de la CAM a été modifié pour fonctionner comme un système in vivo de modèle de xénogreffe de différents cancers qui comble le fossé entre le travail de base in vitro et des modèles de cancer chez les animaux plus complexes. Le dosage CAM permet l'étude de la croissance tumorale, les thérapies anti-tumorales, et les voies moléculaires pro-tumorale dans un système biologiquement pertinent qui est à la fois en temps et en coût efficace. Ici, nous décrivons le développement de CAM Xenograft modèle de carcinome hépatocellulaire (HCC) avec le taux de survie embryonnaire de jusqu'à 93% et fiable take tumeur conduisant à la croissance de tumeurs vascularisées, en trois dimensions.
Introduction
Carcinome hépatocellulaire (CHC) est la 3 ème cause de mortalité par cancer dans le monde 1. Actuellement, seulement 30% des patients HCC sont admissibles à des traitements chirurgicaux potentiellement curatives 2, et la chimiothérapie systémique est pas efficace 3. Par conséquent, il ya un besoin urgent non satisfait clinique de nouvelles thérapies de HCC, et le développement de systèmes de modèles appropriés pour tester l'efficacité de nouveaux agents. Le dosage chorioallantoïque poussin membrane (CAM) offre une méthode à débit moyen rentable, rapide et reproductible de tester des médicaments potentiels anti-tumorales in vivo.
Le dosage de la CAM a été largement utilisée pour étudier l'angiogenèse 4. Il a également été développé avec succès dans un modèle de xénogreffe de tumeur de cancers, y compris un glioblastome 5, 6 cancer du pancréas, le mélanome 09/07, 11/10 et l'ostéosarcome. Les deux 12 in ovo et ex ovo13 techniques ont été utilisées dans la littérature, avec des détails variant de protocole pour le protocole. Un défi majeur pour le modèle de xénogreffe CAM est l'incidence relativement élevée de la mort de l'embryon après la manipulation de l'œuf, avec des taux de mortalité de l'embryon de poussin publiés allant de 25 à 50 pour cent 11-14.
Dans cet article, nous décrivons le développement d'un in ovo modèle de xénogreffe de CHC qui produit de manière fiable la croissance des trois dimensions, tumeurs vascularisées qui ressemblent histologiquement HCC indifférencié. Nous avons adapté un premier protocole décrit par Ossowski et al., 14 et avons réalisé chiches embryonnaire taux de jusqu'à 93% de survie à la greffe extrêmement élevé de la tumeur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. incubation des oeufs
- Obtenir 8 jours anciens oeufs spécifiques exempts d'agents pathogènes embryonnés.
- Placez les oeufs dans la rotation plateau d'oeufs, estampillés extrémités tournées vers le haut, et placez le plateau tournant à l'intérieur d'un incubateur d'œufs. Incuber les oeufs pendant 48 heures à 36 ° C et 50% d'humidité.
2. La chute du CAM et ouverture de l'Eggs
- Ramassez des oeufs de l'incubateur. Placez les oeufs dans casier à œufs, estampillés vers le haut, et porter à hotte à flux laminaire.
- Éteignez les lumières chambre et de capot.
- Maintenez la fin estampillée de œuf légèrement à l'candler d'oeuf pour exposer le système vasculaire de la CAM ainsi que le sac d'air.
NOTE: Le candler d'œuf est une source de lumière utilisée pour visualiser l'embryon et le sac d'air associé et le système vasculaire. - Placez une marque de crayon entre deux principaux vaisseaux sanguins.
- Allumez les lumières et utiliser une punaise stérile de faire un trou à la pointe de l'oeuf au-dessus du sac d'air (fin estampillée) et un trou au PENCIL marque. Ne poussez pas la tige de poussée tout au long; un trou d'environ 3 mm de profondeur suffira habituellement.
- Éteindre les lumières. Appuyez sur la poire de sécurité, en appuyant sur l'extrémité ouverte fermement contre le trou au-dessus du sac d'air. Appliquer aspiration pour aspirer l'air dans le trou à la marque de crayon, provoquant la CAM pour tomber loin de la coque au niveau de la marque de crayon.
- Vérifiez que le sac d'air est passé de la fin estampillé de l'œuf dans le trou de crayon marquée en utilisant la Candler. Si elle n'a pas, utilisez la tige de poussée pour faire deux trous légèrement plus profonde et puis re-appliquer une aspiration à l'aide de l'ampoule de sécurité.
- Allume la lumière. Tenir l'œuf dans une main, activez l'outil rotatif Dremel avec une roue de coupure 15/16 pouces joint et faire deux coupes transversales juste assez profonde pour couper à travers la coque, mais pas assez profonde pour couper tout le chemin jusqu'à la dépression CAM. Faire des coupes autour de 2 cm de longueur et 1 cm de distance les uns des autres. Faire des coupes assez large pour que un anneau de silicone de 1 cm de diamètre peut passer à traversmais plus mince que la largeur du ruban adhésif standard.
- Ensuite, faire une entaille longitudinale et entre les extrémités des deux coupes transversales en effleurant la roue de coupure à la coque.
- Faites glisser des pinces stériles sous la pièce de coque et parallèle à la coque. Prenez la pièce de coque avec la pince et enlever toute la pièce proprement.
- Placez du scotch sur la nouvelle fenêtre ouverte, en veillant à plier une extrémité sur elle-même pour faciliter l'enlèvement.
- Placez les oeufs dans l'incubateur de retour dans le plateau d'oeufs (pas dans les racks d'œufs en rotation) jusqu'à ce moment de l'inoculation.
3. Ensemencement
- Gardez mélange de protéines de la membrane basale, comme matrigel, sur de la glace (pour éviter la polymérisation) et placer dans la hotte.
- Utilisez 2 mM EDTA pour détacher les cellules (4 - 5 ml par flacon T75) et placez flacons dans le tissu incubateur de culture pendant 5 min.
- Remettre les cellules individuelles dans les médias et à compter en utilisant un hémocytomètre et bleu trypan. Utilisez entre 500.000 to 2.000.000 cellules pour greffage sur la came, en fonction de la lignée cellulaire. Optimiser le nombre approprié dans des expériences préliminaires.
- Mesurer le volume nécessaire pour le numéro de cellulaire appropriée, et centrifuger à 500 g pendant 5 min.
- Rejeter le surnageant et remettre en suspension puis culot cellulaire dans 40 μ l de PBS ++ et 20 μ l de mélange de la membrane basale.
NOTE: A ce stade, les cellules peut être traitée avec des médicaments ou d'autres agents de test que nécessaire pour les expériences en remettant en suspension dans la cellule / sous-sol mélange membrane suspension. Alternativement, les agents peuvent être à la pipette sur la cellule / sous-sol mélange membrane suspension après la greffe. - Récupérer casier à œufs avec des oeufs de l'incubateur et le placer dans la hotte à flux laminaire.
- Décollez la bande de la fenêtre, de récupérer un anneau de silicone 1 mm du bouchon d'un flacon cryogénique en utilisant des pinces stériles, et déposer l'anneau à travers la fenêtre.
- Pipet la solution de PBS l cellulaire de 60 μ ++ et membrane basale mixture directement dans le centre de l'anneau de silicone en appui sur la came.
- Re-bande de la fenêtre et déplacer casier à œufs retour à l'incubateur. À ce stade, faites attention en déplaçant les oeufs que l'anneau et la suspension cellulaire peut facilement devenir des personnes déplacées.
- Autoriser les tumeurs de croître de 5 à 7 jours.
4. Récolte tumeurs
- Placer sous-pad dans le capot. Préparer 35 x 10 mm et plaques de conteneurs de paraformaldéhyde comme nécessaire pour l'histologie. Mettre 1 ml de PBS ++ dans chaque plaque 35 mm x 10.
- Placez sac pour matières contaminées dans le capot. Prenez des ciseaux de dissection stériles et insérer l'extrémité pointue dans l'œuf au trou près de la fin estampillé.
- Couper autour de l'œuf entier longitudinalement.
NOTE: le CAM et la tumeur avec la bague doivent tenir à la moitié supérieure de la coque avec la fenêtre. - Avec des ciseaux de dissection et forceps, disséquer la tumeur loin de la CAM et le placer dans la tumeur mm plaque 35 x 10. Mesurer et peser tumeurs. Tumeurs fixes dans paraformaldehypuis de les intégrer paraffine pour une utilisation dans des expériences d'histologie et immunohistochimie.
5. (Facultatif): cellules tumorales dissociation
- Utilisez des ciseaux de dissection pour hacher la tumeur dans la plaque 35 mm x 10. Verser la tumeur hachés dans un tube de 15 ml centrifugeuse et enlever autant PBS ++ que possible par pipetage.
- Ajouter 2 ml de collagénase (1 mg / ml dans du PBS ++), tourner le tube à plusieurs reprises, et incuber le tube à 37 ° C pendant au moins 30 min (jusqu'à plusieurs heures).
- Ajouter 5 ml de milieu à chaque tube et remettre soigneusement par aspiration et en baisse de 20 - 40x. Pipetage approfondie est essentiel pour la dissociation complète des cellules.
- Laisser sédiments de se déposer et transférer le surnageant dans un nouveau tube. Centrifuger à 500 g pendant 5 min. Retirer le surnageant, laissant derrière culot cellulaire dissociée.
NOTE: A ce stade, les culots cellulaires peuvent être utilisés pour diverses expériences (cytométrie de flux, la lyse pour une utilisation dans un Western blot, l'isolement de l'ARN, etc). Le nombre total de cellules tumorales peuvent également être obtenus en utilisant un hémocytomètre et coloration au bleu de trypan. Notez que des cellules plus petites, de forme ovale sont des cellules de poulet de la CAM et ne doivent pas être considérés comme des cellules tumorales. Il devrait y avoir un nombre minimal de contamination des cellules non tumorales (CAM) si la tumeur est disséqué loin de la CAM avec soin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Photos représentatives des étapes clés dans le protocole sont présentés ici. Figure 1A illustre l'utilisation de l'candler de visualiser le développement de l'embryon, le sac d'air, et le système vasculaire de la CAM. Figure 1B-1C montrent le processus de décrochage de la CAM en faisant les deux trous, puis en appliquant une pression négative en utilisant l'ampoule de la sécurité, et la figure 1D montre un chuté succès CAM avec une grande bulle d'air sous le trou de crayon-marquée. Figure 1E et la figure 1F montrent l'utilisation de l'outil rotatif Dremel pour faire le nécessaire coupes dans l'enveloppe ci-dessus la bulle d'air et la fenêtre ouverte dans la coque avec le CAM vascularisé exposée à l'intérieur.
, Tumeurs vascularisées en trois dimensions ont été cultivées avec succès en utilisant les lignées de cellules de HCC HUH7 humain (figure 2A-2B) et PLC / PRF / 5 (Figure 2C-2D). Tumeurs issues de HUH7 et PLC / PRF / 5 cellules salutstologically ressembler HCC indifférenciée (Figure 2E-2F) et ressemblent également HUH7 et PLC / PRF / 5 tumeurs cultivées dans des modèles de xénogreffes de souris 15,16. En outre, l'utilisation du poids de la tumeur a été validée comme une mesure de la taille de la tumeur en démontrant que le poids de la tumeur a été fortement corrélée avec nombre total de cellules tumorales obtenu après dissociation complète des tumeurs à l'aide de la collagénase (Figure 3).
En utilisant ce protocole, les taux de survie des embryons de jusqu'à 93% ont été atteints (tableau 1). Le tableau 1 montre des données agrégées à partir de trois expériences de HCC distincts dans le modèle de xénogreffe CAM. Sur un total de 33 oeufs qui ont été greffés avec succès avec des cellules tumorales (500.000 HUH7 ou PLC / PRF5), seulement 3 oeufs ont abouti à la mort d'embryon de poulet, un taux de survie globale de 90,9%. En outre, les tumeurs ont été très fiable grandi après 5 jours, 100% (30/30) des œufs avec des embryons survivants ont réussi la formation de tumeurs.
Figure 1. La chute du CAM et ouverture d'une fenêtre dans le Shell. (A) d'identification de l'embryon (Blue Arrow) et le système vasculaire (Black Arrow) en utilisant la Candler, (B) Faire un trou dans la coquille, (C) appliquant une aspiration sur le trou à l'origine naturelle Air Sac, (D) Visualisation Bubble Air Affichage Dropping réussie de la CAM loin de la Shell, (E - F). Ouverture d'une fenêtre dans le Shell en utilisant l'outil rotatif Dremel S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. CAM soutient la croissance des trois dimensions, vascularisées tumeurs qui ressemblent histologique HCC indifférenciée. (A - B) La croissance tumorale après 5 jours dans le modèle CAM, cellules Huh7 (500.000 cellules ensemencées) (barres d'échelle = 1 cm), (C - D) La croissance tumorale après 5 jours dans le modèle CAM, PLC / PRF / 5 cellules (500.000 cellules ensemencées) (barres d'échelle = 1 cm), (E-F) d'histologie de HUH7 et PLC / PRF / 5 tumeurs, respectivement (barres d'échelle = 100 μ m) S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure .
Figure 3. Parcelle de tumeur Poids vs Cell Count poids de la tumeur. Est fortement corrélée avec au total le nombre de cellules de la tumeur après collagenase dissociation.
| Nombre total d'oeufs | Pour cent des oeufs avec la survie d'embryon de poulet | Taux de tumeur prendre dans les œufs avec des embryons survivants | |
| HUH7 | 27 | 92,6% (25/27) | 100% (25/25) |
| PLC / PRF / 5 | 6 | 83,3% (5/6) | 100% (5/5) |
| Globalement | 33 | 90,9% (30/33) | 100% (30/30) |
Tableau 1. Taux de survie embryonnaires et taux de tumeurs Prenez dans le modèle de CAM en utilisant deux lignées cellulaires humaines HCC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Plusieurs étapes clés de ce protocole représentent la plus probable pour l'amélioration de la survie des embryons ainsi que la fiabilité accrue de la croissance tumorale. La chute du CAM loin de la coquille en appliquant une aspiration dans le sac d'air est moins invasive que les autres méthodes existantes (à l'aide d'une aiguille pour enlever l'albumine de l'œuf, dissection, etc.). En utilisant une punaise stérile pour créer les deux petits trous nécessaires à cette méthode est la partie la plus difficile du protocole. Utiliser trop de force peut entraîner des dommages à la CAM et son système vasculaire à travers plus de pénétration à la tige de poussée ou peut même entraîner la fissuration ou la destruction de l'œuf. Des exercices pratiques en utilisant une punaise de faire de petits trous dans les œufs, d'épicerie achetés non-fécondés peuvent minimiser les erreurs commises au cours de la première tentative d'abandon de la CAM. En outre, l'utilisation de l'éthanol ou d'autres solutions de désinfectant pour nettoyer la coque diminue embryonnaire viabilité, et devrait être évitée. Enfin, l'aide de l'anneau de silicone stérile &# 8220; corral "les cellules tumorales dans un emplacement spécifique après le semis contribue à la croissance de la tumeur et contribue à le taux élevé de tumeur take vu dans notre protocole.
Certains optimisation des étapes critiques dans le protocole sera probablement nécessaire lorsque l'on travaille avec des lignes et / ou des médicaments cellulaires différents. Le nombre suggéré de cellules pour l'ensemencement est comprise entre 0,5 et 2 millions, mais certaines lignées cellulaires peut exiger des densités de semis élevées ou plus basses pour former une belle tumeur, en trois dimensions. Le greffage trop peu de cellules peut entraîner la formation de tumeur pauvre, tandis greffage trop grand nombre de cellules peut entraîner la prolifération de la tumeur dans laquelle la tumeur occupe la bague de silicone entier, elle devient plus plate et moins en trois dimensions que ce qui est idéal, et ne peut échapper à la limite de l'anneau . Nous recommandons la mise en place d'un essai préliminaire pour déterminer la densité de semis optimale des cellules pour une lignée cellulaire particulière. En outre, un certain ajustement à la norme dans les concentrations de médicament in vitro peut être besoinré. Nous calculons les concentrations de médicament en référence au volume total qui est ensemencé sur la CAM (60 pi), mais les concentrations de médicament parfois «plus élevés» que ceux utilisés dans des expériences parallèles in vitro sont nécessaires afin de voir les effets sur la croissance de la tumeur, probablement en raison de absorption à travers la CAM et de la dispersion de médicament pour le reste de l'œuf.
Après optimisation réussie du protocole pour les lignes et les médicaments de cellules spécifiques, le modèle de xénogreffe de CAM peut être utilisée pour étudier une grande variété de propriétés tumorales et les mécanismes cellulaires. La croissance tumorale peut être évaluée par le poids et les mesures de taille, ainsi que les comptes totaux de cellules tumorales. Les tumeurs peuvent être fixés et soumis à l'immunohistochimie colorer pendant marqueurs tumoraux ou des protéines spécifiques d'intérêt. L'angiogenèse peut être évaluée par coloration pour SNA1, qui colore spécifiquement les cellules endotheliales 17 chiches. Les cellules tumorales peuvent être lysées pour interrogatoire des voies moléculaires. Comme une étape intermédiaire dans la réduction pure travaux in vitro avec des modèles plus complexes de cancer tels que des modèles animaux orthotopiques, le modèle de xénogreffe de CAM est un moyen rentable d'obtenir rapidement des données dans un cadre qui est biologiquement plus pertinentes que les cellules en culture.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Premium incubated eggs | Charles River | N/A | http://www.criver.com/files/pdfs/avian/av_c_spf_egg_price_list.aspx |
| Egg incubators | GQF | Hova-Bator 2362N | |
| Rotating egg trays | GQF | 1611 Automatic Egg Turner | |
| Egg candler | Lyon | Hi-Power 950-070 | |
| Dremel 100 rotary tool with 15/16 cut-off wheel | Dremel | 100-N/7 | |
| Sterile forceps, push pin, dissection scissors, Scotch tape | |||
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | |
| Cryogenic vials, external thread with silicone washer | Corning | 430659 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma | C9891 |
References
- Sangiovanni, A., et al. Increased survival of cirrhotic patients with a hepatocellular carcinoma detected during surveillance. Gastroenterology. 126 (4), 1005-1014 (2004).
- Lopez, P. M., Villanueva, A., Llovet, J. M. Systematic review: evidence-based management of hepatocellular carcinoma--an updated analysis of randomized controlled trials. Aliment Pharmacol Ther. 23 (11), 1535-1547 (2006).
- Llovet, J. M., Burroughs, A., Bruix, J.
- Folkman, J. What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent. J Natl Cancer Inst. 82, 4-6 (1990).
- Hagedorn, M., et al. Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (5), 1643-1648 (2005).
- Dumartin, L., et al. Netrin-1 mediates early events in pancreatic adenocarcinoma progression, acting on tumor and endothelial cells. Gastroenterology. 138 (4), 1595-1606 (2010).
- Aguirre-Ghiso, J. A., Estrada, Y., Liu, D., Ossowski, L. ERK(MAPK) activity as a determinant of tumor growth and dormancy; regulation by p38(SAPK). Cancer Res. 63 (7), 1684-1695 (2003).
- Baroni, T. E., et al. Ribonomic and short hairpin RNA gene silencing methods to explore functional gene programs associated with tumor growth arrest. Methods Mol Biol. 383, 227-244 (2007).
- Lopez-Rivera, E., et al. Inducible nitric oxide synthase drives mTOR pathway activation and proliferation of human melanoma by reversible nitrosylation of TSC2. Cancer Res. 74 (4), 1067-1078 (2014).
- Balke, M., et al. A short-term in vivo model for giant cell tumor of bone. BMC Cancer. 11, 241 (2011).
- Balke, M., et al. Morphologic characterization of osteosarcoma growth on the chick chorioallantoic membrane. BMC Res Notes. 3, 58 (2010).
- Sys, G. M., et al. The in ovo CAM-assay as a xenograft model for sarcoma. J Vis Exp. (77), e50522 (2013).
- Dohle, D. S., et al. Chick ex ovo culture and ex ovo CAM assay: how it really works. J Vis Exp. (33), (2009).
- Ossowski, L., Reich, E. Experimental model for quantitative study of metastasis. Cancer Res. 40 (7), 2300-2309 (1980).
- Ghanekar, A., Ahmed, S., Chen, K., Adeyi, O. Endothelial cells do not arise from tumor-initiating cells in human hepatocellular carcinoma. BMC Cancer. 13, 485 (2013).
- Ho, J. W., et al. Effects of a novel immunomodulating agent, FTY720, on tumor growth and angiogenesis in hepatocellular carcinoma. Mol Cancer Ther. 4 (9), 1430-1438 (2005).
- Hagedorn, M., et al. VEGF coordinates interaction of pericytes and endothelial cells during vasculogenesis and experimental angiogenesis. Dev Dyn. 230 (1), 23-33 (2004).
