Abstract
ويرتبط عدوى الإنفلونزا مع حوالي 36،000 حالة وفاة وأكثر من 200،000 المستشفيات كل عام في الولايات المتحدة. ظهور المستمر من سلالات فيروس الإنفلونزا الجديدة بسبب طفرة وإعادة تشكيلة-يعقد السيطرة على الفيروس ويتطلب التطوير الدائم لأدوية جديدة واللقاحات. الدراسة المختبري للأنفلونزا تتطلب طريقة موثوق بها وفعالة من حيث التكلفة لنشر الفيروس. هنا، يتم توفير بروتوكول شامل للأنفلونزا A انتشار الفيروس في بيض الدجاج الخصبة والتي ينتج باستمرار عيار ارتفاع الأسهم الفيروسية. وباختصار، يتم تحضين خالية من مسببات الأمراض المصل (SPF) بيض الدجاج المخصب عند 37 درجة مئوية والرطوبة 55-60٪ لمدة 10 - 11 يوما. خلال هذه الفترة، تطور الجنين يمكن رصدها بسهولة باستخدام كاندلر البيض. ويتم التلقيح خارج الفيروس عن طريق الحقن من الأسهم الفيروس في جوف السقاء باستخدام إبرة. 2 بعد أيام من الحضانة عند 37 درجة مئوية، والبيضمبردة لمدة 4 على الأقل ساعة على 4 درجات مئوية. قشر البيض فوق كيس الهواء وغشاء مشيمائي يتم بعد ذلك فتحت بعناية، ويتم حصاد السائل السقاء التي تحتوي على الفيروس. تم مسح السوائل من الحطام بواسطة الطرد المركزي، aliquoted ونقل إلى -80 درجة مئوية لمدة التخزين على المدى الطويل. وقد جعلت كمية كبيرة (5-10 مل من السوائل في البيض التي تحتوي على فيروس) وفيروس عيار عالية والتي عادة ما يتحقق مع هذا البروتوكول استخدام البيض لتحضير فيروس أسلوبنا مواتية، ولا سيما بالنسبة للفي الدراسات المختبرية التي تتطلب كميات كبيرة من الفيروسات التي هناك حاجة جرعات عالية من الأسهم الفيروس نفسه.
Introduction
الأنفلونزا A لا يزال يشكل خطرا كبيرا على صحة الإنسان. وهو مرض الجهاز التنفسي يمكن أن يكون مدمرا مع العبء العالمي الكبير يسبب ما يصل إلى 500،000 حالة وفاة سنويا حول العالم 1. فيروسات الأنفلونزا هي في الأسرة فيروسات مخاطية قويمة وتحمل 8-الشعور السلبي RNA واحد الذين تقطعت بهم السبل في الجينوم من 1،2. التحولية عالية (أي الأنتيجين "الانجراف") من الجينوم الفيروسي يمنع مناعة طويلة الأمد. وعلاوة على ذلك، الانفلونزا بشكل متزايد مقاومة للعقاقير المضادة للفيروسات 3.
سلط الضوء على وباء انفلونزا H1N1 2009 جميع القضايا الصعبة المرتبطة بمرض أنفلونزا (سلالة وبائية، ومقاومة مضادة للفيروسات، وإنتاج لقاح تأخر). يتم تحديد تركيبة اللقاح سنويا من قبل منظمة الصحة العالمية لسلالات الأنفلونزا الأكثر احتمالا المسببة للأمراض (واحد في كل من H1N1، H3N2 وانفلونزا B) 4. لأنه يعتمد هذا الأسلوب على سلالة انفلونزا تنبأالصورة، وأحيانا تحديدها بشكل غير صحيح السلالات المسببة للأمراض وقطرات نجاعة اللقاح بشكل كبير. وعلاوة على ذلك، يمكن أن ظهور سلالات الأنفلونزا الجديدة الالتفاف على هذه البرامج الوقائية المسببة للأمراض الوبائية 2.
وقد تم إنشاء لقاح الأنفلونزا العالمي راوغ 5. لذلك، يجب أن تستمر الأبحاث في فهم التسبب في إصابة الرئة. لالبحوث المختبرية المرفق، وقد وضعت عدة طرق لعزل الفيروسية ونشر 6. يمكن أن فيروسات الأنفلونزا البشرية أن تتسع دائرة في مجموعة متنوعة من ركائز خلايا الثدييات. ومع ذلك، فإن أفضل طريقة لتحقيق توليد الفيروسات عيار عالية بكميات كبيرة في البيض المحتوي. يصف بروتوكول التالية تقنية لنشر فيروس الأنفلونزا A والتخزين من مخزونات فيروس القائمة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: ملاحظات عامة: تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على التلاعب في البيض تحت ظروف معقمة، وينبغي استخدام تقنية معقمة وفقا لذلك. قبل تنظيف جميع المعدات مع الايثانول 70٪ قبل الاستخدام. وبصفة عامة، ينبغي إجراء التلقيح فيروس الإنفلونزا، والحصاد في مختبر BSL-2. ومع ذلك، إذا تم استخدام هذا البروتوكول لنشر أكثر من ذلك بكثير المسببة للأمراض فيروسات الأنفلونزا (على سبيل المثال، والسلالات الوبائية وما قبل الوباء، والسلالات التي تشكل خطرا على الدواجن والماشية، سلالات أنفلونزا الطيور الشديدة الإمراض، وH1N1 سلالة 1918)، وارتفاع مستويات السلامة الأحيائية و في بعض الحالات، يطلب من احتياطات الأمن الحيوي والتراخيص. وينبغي للجنة السلامة الأحيائية المؤسسية المحلية الموافقة على جميع البحوث المتعلقة بفيروس الأنفلونزا.
1. إعداد بيض للتلقيح
- الحصول على البيض (SPF) خالية من مسببات الأمراض المخصبة حديثا المصل الطيور من بائع مناسبة. عادة، يتم استخدام بيض الدجاج. يجب أن يكون لنا البيضإد فور وصوله.
- على بيض مكان الوصول في حاضنة البيض مرطب مع تيرنر البيض التلقائي لتدوير البيض بانتظام. إذا كان تيرنر البيض التلقائي غير متوفر، وتناوب يدويا البيض على الأقل 2-3 مرات في اليوم (تأكد من ارتداء القفازات وإبقاء كل شيء كما عقيمة ممكن).
- احتضان البيض عند 37 درجة مئوية والرطوبة 55-60٪ عن 10-11 يوما.
تشميع 2. البيض
- استخدام كاندلر البيض لفحص البيض ضد الضوء الساطع في غرفة مظلمة للتحقق البيض للعقم قبل تشميع بعد حوالي 7 أو 8 أيام من الحضانة.
- مسح كاندلر البيض مع الايثانول 70٪. تغيير القفازات في كثير من الأحيان وتعقيم مع الايثانول 70٪ للحد من مخاطر التلوث عن طريق الجراثيم.
- إزالة البيض من الحاضنة ووضعها في علب البيض الفارغة.
- إطفاء الأنوار في الغرفة.
- عقد نهاية كبيرة من كل بيضة واحدة في وقت واحد ضد كاندلر.
- مراقبة البيض إلى determinه إذا كان خصبة أو العقم.
ملاحظة: الأوعية الدموية رقيقة مما يؤدي إلى الجنين على شكل حبة وينبغي أن تكون واضحة للعيان. سوف تظهر بويضة غير مخصبة كما بقعة دم صغيرة مع صفار البيض وضوحا.
- تجاهل البيض التي هي غير مخصبة، والعودة البيض قابلة للحياة إلى الحاضنة. لا تترك البيض من خارج الحاضنة لأكثر من 30 دقيقة. إذا كانت حالة البويضة لا يمكن تأكيد، علامة عليه، والالتزام به في وقت لاحق.
3. إعداد فيروس اللقاح
- تمييع الأسهم فيروس الأنفلونزا إلى حوالي 10 مارس - 10 أبريل PFU / مل في برنامج تلفزيوني العقيمة التي تحتوي على 10 ملي HEPES (7.4 درجة الحموضة). خطوة حاسمة: تمييع الأسهم فيروس فورا قبل الاستخدام والحفاظ على فيروس المخفف على الجليد في كل وقت.
4. فيروسات الأنفلونزا التلقيح عن طريق السقاء الطريق
- في يوم التلقيح فيروس (يوم 10 أو 11)، شمعة البيض مرة أخرى والقضاء على أي أجنة ميتة. تمييز الأجنة الحيةأبحث عن الحركة داخل البيضة.
- إزالة ثلاث بيضات من الحاضنة، وترتيب البيض في حامل منفصل مع كيس الهواء فوق.
- بمناسبة المجال الجوي للبيض مع علامة دائمة.
- غسل قشر البيض فوق المجال الجوي مع 70٪ من الإيثانول.
- وضع البيض مع مساحة الهواء في كرتون البيض وإلى غطاء للسلامة الأحيائية (BSL-2).
- استخدام إبرة معقمة 18G لكمة ثقب صغير في وعاء على كيس الهواء من كل بيضة. يجب الحرص على عدم ادخال الإبرة عميقا جدا لتجنب طعن الجنين أو صفار البيض.
- وضع فيروس الانفلونزا المخفف إلى معقمة 1 مل حقنة ونعلق إبرة 22G.
- دفع بعناية المحاقن مع إبرة في زاوية 45 درجة في جوف السقاء.
- ضخ 0.2 مل من فيروس الانفلونزا المخفف.
- تكرار الحقن مع غيرها من اثنين من البيض، ومن ثم التخلص من المحاقن والإبر.
- ختم حفرة مع قطرة من الغراء من مسدس الغراء (أو ذاب شمع البارافين). Bالبريد الدقيق الذي الغراء لا تسرب داخل البويضة.
- وضع البيض مرة أخرى في حاضنة البيض مع وأشار المجال الجوي أعلى.
- كرر الخطوات من 4،2-4،12 حتى يتم تلقيح جميع البيض.
5. الحضانة الوقت
- احتضان البيض المصابين دون تحول عند 37 درجة مئوية والرطوبة 60٪ ~.
- اختيار الأمثل فترة حضانة تبعا لنوع فيروس الانفلونزا. احتضان الأنفلونزا A لمدة 48 ساعة. احتضان الإنفلونزا B و C لمدة 72 ساعة.
6. فيروسات الأنفلونزا الحصاد
- بعد فترة الحضانة، هدئ البيض عند 4 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 4 ساعات (أو O / N) لقتل الجنين وانقباض الأوعية الدموية للحد من مخاطر تلوث السائل السقاء بعدوى الدم. هل هذا لمنع خلايا الدم الحمراء من امتصاص الفيروس، مما يقلل من العائد. بدلا من ذلك، البيض البرد لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة -20 درجة مئوية؛ ولكن هذا يزيد من خطر تلوث الدم.
- بعد أن كان البيض المبردة بما فيه الكفاية، ونقل البيض إلى غطاء للسلامة الأحيائية. وضع البيض إلى حامل ثابت مع كيس الهواء مواجهة. تنظيف السطح البيض مع الايثانول 70٪.
- استخدام مقص العقيمة لفتح قشر البيض فوق كيس الهواء. إزالة القشرة حول كيس الهواء مع الحرص على عدم تدمير غشاء مشيمائي.
- فتح غشاء مشيمائي مع ملقط حادة معقمة. بلطف التحرك جانبا الجنين وكيس الصفار مع ملعقة صغيرة أو ملعقة. الحرص على عدم تمزق صفار البيض.
- باستخدام 1 مل إيبندورف ماصة، وجمع بعناية السوائل السقاء. إذا لزم الأمر، إمالة البيض قليلا إلى الجانب لجمع السائل كما قدر الإمكان.
- الجمع بين السائل السقاء من جميع البيض في 50 مل أنبوب مخروطي البلاستيك. إبقاء الأنابيب على الجليد في جميع الأوقات أثناء الحصاد الفيروس. غلة واحدة البيض من 5 - 10 مل من السائل مصفر قليلا.
- تدور السائل السقاء التي تحتوي على الفيروس في 1،000 x ج لمدة 10 دقيقة على 46؛ C لتكوير الحطام. نقل السوائل واضحا في أنبوب جديد 50 مل أبقى على الجليد. التخلص البيض في وعاء النفايات BSL-2.
7. التخزين
- قسامة فورا أوضح سقائية السائل (على سبيل المثال، 50، 100 أو 500 مأخوذة UL) والمفاجئة للتجمد في النيتروجين السائل. نقل مخزونات فيروس المجمدة إلى -80 ° C الثلاجة لمدة التخزين على المدى الطويل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وقد تم تطوير طرق متعددة لعيار الفيروس الأنفلونزا. واحد الاعتبار عند اختيار الطريقة المناسبة هي التي تحدد بعض مجموع الجسيمات بغض النظر عن جدوى (على سبيل المثال، راصة دموية الفحص) في حين تستند الآخرين على العدوى، والتي سوف تقيم virions قابلة للحياة (على سبيل المثال، فحص اللوحة) 6. هنا، تم تحديد عيار الفيروسية من السوائل السقاء تم جمعها من بيض الدجاج تلقيح مع فيروس الإنفلونزا تكييفها الماوس (A / PR / 8/34) عن طريق فحص اللوحة (الشكل 1)، ومقايسة التراص (الشكل 2).
عدوى فيروس الانفلونزا يسبب تأثير الاعتلال الخلوي التي تنتج في لويحات (مناطق دائرية من الخلايا هي lysed) لتشكيل على أحادي الطبقة من الخلايا. وتصور اللوحات التي كتبها تلطيخ الخلايا مع الكريستال البنفسجي، واحصي 65 لويحات في البئر مع 10 -12 التخفيف من فيروس (الشكل 1). بسبب 500 L من الأسهم الفيروسية المخفف ثكما وضعت على الخلايا، وعيار النهائي هو 1.3 × 10 14 PFU / مل.
مقايسة التراص هي طريقة لعيار قواعد فيروس الانفلونزا على قدرة الفيروس لنعلق على سطح خلايا الدم الحمراء. وهناك تعليق الفيروسي التصقت خلايا الدم الحمراء، وبالتالي منعهم من تسوية للخروج من الايقاف. باستخدام التخفيفات المسلسل من الفيروس في لوحة 96-جيدا (إما V- أو أسفل مستديرة) وإضافة كمية محددة من خلايا الدم الحمراء، ويمكن تحديد عيار الفيروسية. ولوحظ وجود نتيجة سلبية بشكل واضح مع 1: 2 10 التخفيف من الفيروس في 50 ميكرولتر (الشكل 2). ولذلك، فإن عيار النهائي هو 2.1 × 10 4 HAU / مل.
الشكل 1. الكمي من PR8 فيروس العيار الحجمي التي كتبها البلاك الفحص. وقد يصاب أحادي الطبقة من الخلايا MDCK مع الدوري الايطالي 10 أضعافالتخفيفات لتر من PR8 (10 -1 - 10 -12) لمدة 1 ساعة، وغسلها، ثم مضافين مع حل الاغاروز 0.6٪. بعد مرور فترة الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 72 ساعة، تم إزالتها بعناية أجار، وتم إصلاح الخلايا وملطخة 0.25٪ الكريستال البنفسجي. تم مقارنة تشكيل اللوحة إلى عنصر تحكم غير المصابة (الظهور). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. التراص (HA) الفحص لالعيار الحجمي البيض المستمدة من فيروس أنفلونزا PR8. فيروس PR8 تم تخفيفه بشكل متسلسل 2 أضعاف في برنامج تلفزيوني ومختلطة مع 50 لترا من 0.5٪ تركيا خلايا الدم الحمراء. تم إعداد التخفيفات في quadruplicates، وأخذت الصور بعد 1 ساعة حضانة في RT. تظهر نتائج سلبية النقاط في المركز من الآبار بينما نتائج إيجابيةتشكيل اللون المحمر موحد في جميع أنحاء البئر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يسبب الإنفلونزا في العبء العالمي للمرض واسع، ويستمر العمل في فهم التسبب في إصابة الرئة 7. لبحث سهلت في هذا المرض الفتاك، وضعت أساليب مختلفة لنشر فيروس انفلونزا 6. هنا، نحن تصف تقنية لإنتاج فيروس الإنفلونزا في بيض الدجاج. وميزة هذه الطريقة هي أنها تكرار للغاية والنتائج في كميات كبيرة من مخزونات فيروس أنفلونزا عيار عالية، والتي غالبا ما تكون ضرورية للدراسات في المختبر.
ومعظم المختبرات تكون قادرة على تطوير هذا البروتوكول بسرعة وبسهولة مع الحد الأدنى من تكاليف بدء التشغيل. على الرغم من أننا نوصي الاستثمار في حاضنة البيض مع تيرنر التلقائي، هذا البروتوكول يمكن أن تكتمل بدون هذه المعدات، ولكن سيكون أكثر شاقة. ننصح أيضا باستخدام الباعة البحوث التجارية لشراء البويضات المخصبة لضمان الاتساق والعقم من البيض. مكتب Laboratأوري رعاية الحيوان (OLAW) تفسير سياسة دائرة الصحة العامة (PHS) على الرعاية الإنسانية واستخدام الحيوانات المختبرية ينص على استخدام البحوث البيض المحتوي الطيور الحية أن سياسة PHS لا تطبق إلا بعد الفقس. ولذلك، فإن معظم المؤسسات لا يتطلب موافقة IACUC لهذا البروتوكول. ومع ذلك، السياسات تختلف بين المؤسسات، وسوف تكون هناك حاجة موافقة لجنة السلامة الأحيائية المؤسسي قبل الشروع في هذا البروتوكول.
عند العمل مع الفيروس، فإن من الأهمية بمكان للحفاظ على الفيروس في 4 C بعد حصاد السوائل السقاء من البيض المحتوي المصابة. يتوقع من كل بيضة لإنتاج ما بين 5-10 مل من السوائل السقاء، وعيار يعتمد على سلالة من فيروس الأنفلونزا. مختبرنا وقد استخدمت هذه الطريقة بشكل روتيني على نشر H1N1 سلالة الإنفلونزا تكييفها الماوس (A / PR / 8/34). ويمكن أيضا أن هذا البروتوكول استخدامها لالعينات السريرية، ولكن في هذه الحالة، التلقيح من تجويف الذي يحيط بالجنين قد يكون من الأفضل نظرا لصresence من الأحماض اللعابي المرتبطة 2،6 حاجة للربط داخل بطانة الذي يحيط بالجنين 8،9. وهناك اعتبار آخر هو أن هذه الطريقة قد لا تكون مثالية لانتشار فيروسات إنفلونزا الطيور (على سبيل المثال، سلالات H5N1) بسبب المرضية إلى الجنين.
وقد تم تطوير طرق مختلفة من titering فيروس الانفلونزا وكلها لها مزاياها وعيوبها. في الواقع، يمكن أن يكون الكمي الفيروسي القائم على البروتين (مثل فحص راصة دموية، ELISA)، القائم على حمض (PCR على سبيل المثال، الكمي)، أو وظيفية النووي (على سبيل المثال، فحص اللوحة الفيروسي) 6. سوف المقايسات غير وظيفية تحديد إجمالي التتر الفيروسية بغض النظر إذا كانوا يعيشون أو الجسيمات الفيروسية الميتة. لذلك، واختبار للنشاط المعدية من فيروس الانفلونزا سوف قياس فيروسات حية والسماح لالتكافؤ الوظيفي مقارنة من الكثير الكثير. مقايسة تشكيل اللوحة هو الفحص المستخدمة الشائعة التي يمكن تقييم التتر من فير الإنفلونزا الحيلنا، ولكن يمكن أن تكون بطيئة ومرهقة لأداء 10. في المقارنة، الفحص راصة دموية هو بسيط ومباشر، ولكن لا تقييم الجدوى ويحدد جميع الجزيئات الأنفلونزا.
هنا، ونحن نقدم طريقة سهلة نسبيا لنشر فيروس الانفلونزا عيار عالية. بدء من جديد من هذا البروتوكول في المختبر واضح ومباشر، والمواد والمعدات انطلاق غير مكلفة نسبيا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Cellgro | 21-040-CV | |
| serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs | VALO BioMedia | ||
| humidified egg incubator | FARM iNNOVATORS | Model 2100 | |
| automatic egg turner | FARM iNNOVATORS | Model 3200 | |
| egg candler | FARM iNNOVATORS | Model 3300 | |
| 1 ml syringe | BD Bioscience | 309659 | |
| 18G needle | BD Bioscience | 305196 | |
| 20G / 22G needle | BD Bioscience | 305176 / 305156 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Ethanol>99.5% | Sigma-Aldrich | 459844 | diluted to 70% using water |
| glue gun "Ad tech Hi Temp Project Pro" | Ad tech, Adhesive Technologies, Inc. | Model 1105 | |
| glue "Ad tech MINI SIZE, Multi Temp" | Ad tech, Adhesive Technologies, Inc. | 220-34ZIP30 | |
| MDCK cells | ATCC | CRL-2935 | |
| Washed Pooled Turkey Red Blood Cells, 10% | Lampire Biological Laboratories | 724908 |
References
- Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Estimates of deaths associated with seasonal influenza --- United States, 1976-2007. MMWR. Morbidity and mortality weekly report. 59 (33), 1057-1062 (2010).
- Neumann, G., Noda, T., Kawaoka, Y. Emergence and pandemic potential of swine-origin H1N1 influenza virus. Nature. 459 (7249), 931-939 (2009).
- Tumpey, T. M., Garcia-Sastre, A., et al. Pathogenicity of Influenza Viruses with Genes from the 1918 Pandemic Virus: Functional Roles of Alveolar Macrophages and Neutrophils in Limiting Virus Replication and Mortality in Mice. J Virol. 79 (23), 14933-14944 (2005).
- Doherty, P. C., Turner, S. J., Webby, R. G., Thomas, P. G. Influenza and the challenge for immunology. Nat Immu. 7 (5), 449-455 (2006).
- Webster, R. G., Govorkova, E. A.
- Szretter, K. J., Balish, A. L., Katz, J. M. Unit 15G.1 Influenza: propagation, quantification, and storage. . Current protocols in microbiology. , Wiley. (2006).
- Short, K. R., Kroeze, E. J. B. V., Fouchier, R. A. M., Kuiken, T. Pathogenesis of influenza-induced acute respiratory distress syndrome. Lancet Infect Dis. 14 (4), 57-69 (2014).
- Ito, T., Suzuki, Y., et al. Differences in sialic acid-galactose linkages in the chicken egg amnion and allantois influence human influenza virus receptor specificity and variant selection. J Virol. 71 (4), 3357-3362 (1997).
- Robertson, J. S., Nicolson, C., Major, D., Robertson, E. W., Wood, J. M. The role of amniotic passage in the egg-adaptation of human influenza virus is revealed by haemagglutinin sequence analyses. J Gen Virol. 74 (Pt 10), 2047-2051 (1993).
- Gaush, C. R., Smith, T. F. Replication and plaque assay of influenza virus in an established line of canine kidney cells). Appl Microbiol. 16 (4), 588-594 (1968).
