Abstract
Influenza infektion er forbundet med omkring 36.000 døde og mere end 200.000 indlæggelser hvert år i USA. Den kontinuerlige fremkomsten af nye influenzavirusstammer på grund af mutation og reassortment komplicerer styring af virus og nødvendiggør permanent udvikling af nye lægemidler og vacciner. Den laboratorieundersøgelse af influenza kræver en pålidelig og omkostningseffektiv metode til formering af virus. Her er en omfattende protokollen i henhold til influenza A-virus formering i frugtbare hønseæg, som konsekvent giver høj titer virale lagre. I korte træk er serum patogenfrie (SPF) befrugtede hønseæg inkuberet ved 37 ° C og 55-60% luftfugtighed 10 - 11 dage. I denne periode, kan udvikling embryo let overvåges ved hjælp af et æg Candler. Virus podning udføres ved injektion af virus lager i allantoiskaviteten hjælp af en nål. Efter 2 dages inkubation ved 37 ° C, æggene erkølet mindst 4 timer ved 4 ° C. Æggeskallen over luftsækken og chorioallantoiske membran bliver derefter omhyggeligt åbnet, og allantoisvæske indeholdende virus høstes. Væsken fjernes fra rester ved centrifugering, alikvoteret og overført til -80 ° C til langtidsopbevaring. Den store mængde (5-10 ml virusholdige væske pr æg) og høj virustiter som sædvanligvis opnået med denne protokol har gjort brugen af æg til viruspræparat vores gunstig metode, især til in vitro-undersøgelser, der kræver store mængder af virus, hvor høje doser af det samme virus lager er nødvendige.
Introduction
Influenza A er fortsat en stor trussel mod menneskers sundhed. Det er en potentielt ødelæggende luftvejssygdom med en stor global byrde forårsager op til 500.000 dødsfald på verdensplan om året 1. Influenzavirus er i familien Orthomyxoviridae og bære 8 negativ-sense enkeltstrenget RNA i deres genom 1,2. Den høje foranderlighed (dvs. antigen "drift") af det virale genom forhindrer langsigtede immunitet. Desuden influenza er mere resistente over for antivirale lægemidler 3.
2009 H1N1 influenza pandemi Den fremhævede alle de udfordrende spørgsmål i forbindelse med influenza sygdom (pandemiske stamme, anti-viral resistens, forsinket vaccine produktion). Vaccineformuleringen bestemmes hvert år af World Health Organization for de mest sandsynlige patogene influenzastammer (én hver for H1N1, H3N2 og influenza B) 4. Fordi denne metode er baseret på forudsagt stamme influenzas, er patogene stammer lejlighedsvis ukorrekt identificeret og vaccinens effekt falder drastisk. Endvidere kan forekomsten af nye influenzastammer omgå disse forebyggende programmer forårsager pandemi 2.
Oprettelsen af en universel influenzavaccine har været undvigende 5. Derfor skal forskningen fortsætte ind forstå patogenesen af lungeskade. Til anlægget laboratorium forskning, er der udviklet flere metoder til viral isolation og formering 6. Humant influenzavirus kan amplificeres i en række pattedyrscellelinier substrater. Men genererer høj titer virus i store mængder bedst opnås i befrugtede æg. Den følgende protokol beskriver en teknik til influenza A-virus formering og opbevaring fra eksisterende virusstammer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Generelle bemærkninger: Udfør alle procedurer, der involverer manipulation af ægget under sterile forhold, og steril teknik bør anvendes i overensstemmelse hermed. Pre-clean alt udstyr med 70% ethanol før brug. Generelt bør gennemføres influenzavirus podning og høst i en BSL-2 laboratorium. Men hvis denne protokol bruges til at udbrede sig meget mere sygdomsfremkaldende influenzavirus (f.eks pandemi og præ-pandemiske stammer, stammer, der udgør en fare for fjerkræ og husdyr, højpatogene aviær influenza-stammer, 1918 H1N1-stammen), højere biosikkerhed niveauer og i nogle tilfælde er forholdsregler og godkendelser biosikkerhedsforanstaltninger påkrævet. Den lokale institutionelle biosikkerhed udvalg bør godkende al forskning med influenzavirus.
1. Fremstilling af æg til Podning
- Opnåelse af serum patogenfrie (SPF) frisk befrugtet fugleæg fra et egnet leverandør. Typisk hønseæg anvendes. Æg bør være osed straks ved ankomsten.
- Ved ankomsten sted æg i en fugtig æg inkubator med automatisk æg turner at rotere æg regelmæssigt. Hvis en automatisk æg turner ikke er tilgængelig, rotere manuelt æg mindst 2-3 gange om dagen (sørg for at bære handsker og holde alt så sterilt som muligt).
- Inkuber æg ved 37 ° C og 55-60% fugtighed i 10-11 dage.
2. Egg gennemlysning
- Brug et æg Candler at undersøge æg mod en lys lys i et mørkt rum for at kontrollere æg til infertilitet ved gennemlysning efter omkring 7 eller 8 dages inkubation.
- Tør ægget Candler med 70% ethanol. Skift handsker ofte og desinficere med 70% ethanol for at minimere risikoen for forurening med patogener.
- Tag æggene fra inkubatoren og placere dem i tomme æg kartoner.
- Sluk lyset i rummet.
- Hold den store ende af hvert æg et ad gangen mod Candler.
- Overhold ægget til determine, hvis det er frugtbar eller ufrugtbar.
BEMÆRK: Tynde blodkar, der fører til en bønne-formet embryo skal tydeligt fremgå. Ubefrugtede æg vil fremstå som en lille blod plet med en synlig æggeblomme.
- Kassér æg, der er ubefrugtede, og returnere de levedygtige æg til rugemaskinen. Lad ikke æg uden for inkubatoren i mere end 30 min. Hvis der ikke kan bekræftes status af et æg, markere den, og observere den senere.
3. Fremstilling af virusinokulum
- Fortynd influenzavirus lager til ca. 10 marts-10 April pfu / ml i sterilt PBS indeholdende 10 mM HEPES (pH 7,4). Kritisk trin: Fortynd virusstamopløsningen umiddelbart før brug og holde fortyndet virus på is hele tiden.
4. Influenza Virus Podning via allantois Route
- På dagen for virus podning (dag 10 eller 11), Candle æggene igen og fjerne eventuelle døde fostre. Skelne levende embryonersøger bevægelse inde i ægget for.
- Fjern tre æg fra rugemaskinen, og arrangere æggene i en separat holder med luft sac op.
- Markér luftrum af æggene med en permanent markør.
- Vask æggeskallen over luftrummet med 70% ethanol.
- Læg æggene med luftrummet op i en æggebakke og ind i en biosikkerhed hætte (BSL-2).
- Brug en steril 18G nål til at slå et lille hul i skallen over luftsækken af hvert æg. Pas på ikke at indsætte nålen for dybt for at undgå stikkende embryoet eller æggeblomme.
- Udarbejde den fortyndede influenzavirus i en steril 1 ml sprøjte og vedlægge en 22G nål.
- Rykke forsigtigt sprøjten med kanylen i en 45 ° vinkel i allantoishulen.
- Injicer 0,2 ml af den fortyndede influenzavirus.
- Gentag injektionen med de to andre æg, og derefter kassere sprøjten og kanylen.
- Forsegl hul med en dråbe lim fra en limpistol (eller smeltet paraffin). Be passe på, at lim ikke lækker inde i ægget.
- Placer æggene tilbage i ægget inkubator med luftrummet pegede opad.
- Gentag trin 4,2-4,12 indtil alle æggene er blevet podet.
5. inkubationstid
- Inkubér de inficerede æg uden at dreje ved 37 ° C og ~ 60% luftfugtighed.
- Vælg optimale inkubationstid afhængigt af influenzavirus type. Inkuber influenza A i 48 timer; inkuber influenza B og C i 72 timer.
6. Influenza Virus Harvest
- Efter inkubationsperioden chill æggene ved 4 ° C i mindst 4 timer (eller O / N) at dræbe embryoner og snøre blodkarrene til at reducere risikoen for forurening af inficerede allantoisvæske med blod. Gør dette for at forhindre røde blodlegemer fra at absorbere virus, som reducerer udbyttet. Alternativt chill æg i 30 minutter ved -20 ° C; men dette øger risikoen for blod.
- Efter æggene har været tilstrækkeligt kølet, overføre æg til en biosikkerhed hætte. Placer ægget ind i en fast holder med luften sac opad. Rengør ægget overflade med 70% ethanol.
- Brug sterile sakse til at åbne æggeskallen over luftsækken. Fjern skallen omkring Luftsækken samtidig være omhyggelig med ikke at ødelægge chorioallantoiske membran.
- Åbn chorioallantoiske membran med sterile stumpe pincet. Flytte forsigtigt bort embryoet og blommesækken med en lille spatel eller ske. Pas på ikke at bryde æggeblomme.
- Ved hjælp af en 1 ml Eppendorf pipette forsigtigt indsamler allantoisvæsken. Hvis det er nødvendigt, vippe ægget lidt til siden for at indsamle så meget væske som muligt.
- Kombiner allantoisvæske fra alle æg i en 50 ml plast konisk rør. Hold rør på is hele tiden under virus høst. Et æg udbytter 5 - 10 ml af en svagt gullig væske.
- Spin virusholdige allantoisvæske ved 1.000 xg i 10 minutter ved 46 C for at pelletere debris. Overfør klar væske i et nyt 50 ml rør holdt på is. Bortskaf æg i en BSL-2 affaldsbeholder.
7. Opbevaring
- Umiddelbart udportionerer det klarede allantoisvæske (f.eks, 50, 100 eller 500 ul portioner) og snap-freeze i flydende nitrogen. Overførsel frosne virusstammer til -80 ° C fryser for langtidsopbevaring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Der er blevet udviklet flere metoder til at titrere influenzavirus. En overvejelse, når de vælger en passende metode er, at nogle bestemmelse af samlet partikler uanset levedygtighed (f.eks hæmagglutinin assay), mens andre er baseret på infektivitet, som vil vurdere levedygtige virioner (f.eks plakassay) 6. Her blev den virale titer af allantoisvæske opsamlet fra hønseæg inokuleret med en muse-tilpasset influenzavirus (A / PR / 8/34) bestemt ved plaque assay (figur 1) og hæmagglutineringsassay (figur 2).
Influenza virus infektion forårsager en cytopatisk effekt, der resulterer i plaques (cirkulære zoner af lyserede celler) til dannelse af et monolag af celler. Plaques blev visualiseret ved farvning af cellerne med krystalviolet, og 65 plaques blev talt i brønden med 10 -12 fortynding af virus (figur 1). Fordi 500 L fortyndet virusstamme wsom anbringes på cellerne, den endelige titer er 1,3 x 10 14 PFU / ml.
Den hæmagglutineringsassay er en metode til at titrere influenzavirus baser på evnen af virusset til at fastgøre til overfladen af røde blodlegemer. En viral suspension vil agglutinere de røde blodlegemer, hvilket forhindrer dem i at bosætte sig i suspension. Ved anvendelse af seriefortyndinger af virus i en 96-brønds plade (enten V- eller rund bund) og tilsætning af en fast mængde af røde blodlegemer, kan den virale titer bestemmes. En klart negativt resultat blev observeret med 1: 2 10 fortynding af virus i 50 pi (figur 2). Derfor er den endelige titer er 2,1 x 10 4 HAU / ml.
Figur 1. Kvantificering af PR8 virustiter ved plakanalyse. Et monolag af MDCK-celler blev inficeret med 10-fold serial fortyndinger af PR8 (10 -1 - 10 -12) i 1 time, vasket og derefter belagt med en 0,6% agarose-opløsning. Efter inkubation ved 37 ° C i 72 timer blev agar forsigtigt fjernet, og cellerne blev fikseret og farvet med 0,25% krystalviolet. Plakdannelse blev sammenligne med en ikke-inficerede kontrol (CTR). Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 2. Hemagglutination (HA) assay til Titer Egg-afledte PR8 influenzavirus. PR8 virus blev serielt fortyndet 2 gange i PBS og blandet med 50 liter 0,5% kalkun røde blodlegemer. Fortyndinger blev fremstillet i firdobbelte, og billeder blev taget efter 1 time inkubation ved stuetemperatur. Negative resultater vises som prikker i centrum af brøndene, hvorimod positive resultaterdanne en ensartet rødlig farve over brønden. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Influenza forårsager en stor globale sygdomsbyrde, og arbejdet fortsætter i forståelsen af patogenesen af lungeskade 7. Til lettere forskning i denne dødelige sygdom er der blevet udviklet forskellige metoder til at udbrede influenzavirus 6. Her beskriver vi en teknik til at producere influenzavirus i hønseæg. Fordelen ved denne metode er, at det er meget reproducerbar og resulterer i store mængder af høj titer influenza virusstammer, som ofte er nødvendig til in vitro studier.
De fleste laboratorier vil kunne udvikle denne protokol hurtigt og nemt med minimale startomkostninger. Selvom vi anbefaler at investere i et æg inkubator med automatisk turner, kan denne protokol gennemføres uden sådant udstyr, men vil være mere besværlig. Vi anbefaler også at bruge kommercielle leverandører af for køb af befrugtede æg for at sikre sammenhæng og sterilitet af æggene. Kontoret for Laboratrisk Dyrevelfærd (OLAW) fortolkning af Public Health Service (PHS) Politik vedrørende Humane Pleje og anvendelse af forsøgsdyr hedder for forskning anvendelse af levende befrugtede fugleæg, at PHS politik gælder kun efter klækning. Derfor vil de fleste institutioner ikke kræve IACUC godkendelse til denne protokol. Dog varierer blandt institutioner, og Institutional biosikkerhed udvalget godkendelse vil være påkrævet, før du starter denne protokol.
Når du arbejder med virus, er det altafgørende at holde virus ved 4 C efter høst af allantoisvæske fra det inficerede befrugtede æg. Forventes hvert æg til at producere mellem 5-10 ml allantoisvæske, og titeren afhænger stamme af influenzavirus. Vores laboratorium har rutinemæssigt anvendes denne metode til at udbrede en mus tilpasset H1N1 influenza-stamme (A / PR / 8/34). Denne protokol kan også anvendes til kliniske prøver, men i denne situation, kan podning af livmoderhulrummet være at foretrække på grund af presence af 2,6-bundne sialinsyrer nødvendige for binding i fostervand foring 8,9. Et andet forhold er, at denne metode ikke kan være ideel til formering aviær influenzavirus (fx H5N1-stammer) på grund af sygdomsfremkaldende evne embryoet.
Der blevet udviklet forskellige metoder til titrering influenzavirus som alle har deres fordele og ulemper. Faktisk kan viral kvantificering være protein-baserede (fx hæmagglutinin-assay, ELISA), nukleinsyre-baserede (f.eks kvantitativ PCR) eller funktionelt (fx viral plaque assay) 6. Ikke-funktionelle assays vil bestemme de samlede virale titere uanset om de er levende eller døde viruspartikler. Derfor vil teste for den smitsomme aktivitet af influenzavirus måle levende virus og muliggøre sammenlignelig funktionel ækvivalens fra parti til parti. Det plaque-dannende assay er et almindeligt anvendt assay, der kan vurdere titere af levende influenza viros, men kan være langsom og besværlig at udføre 10. Til sammenligning er hæmagglutinin analysen er enkel og ligetil, men vurderer ikke levedygtighed og afgør alle influenza-partikler.
Heri giver vi en forholdsvis let metode til at udbrede høj titer influenzavirus. Det de novo indledningen af denne protokol i en lab er ligetil, og udgangsmaterialerne og udstyr er relativt billige.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Cellgro | 21-040-CV | |
| serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs | VALO BioMedia | ||
| humidified egg incubator | FARM iNNOVATORS | Model 2100 | |
| automatic egg turner | FARM iNNOVATORS | Model 3200 | |
| egg candler | FARM iNNOVATORS | Model 3300 | |
| 1 ml syringe | BD Bioscience | 309659 | |
| 18G needle | BD Bioscience | 305196 | |
| 20G / 22G needle | BD Bioscience | 305176 / 305156 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Ethanol>99.5% | Sigma-Aldrich | 459844 | diluted to 70% using water |
| glue gun "Ad tech Hi Temp Project Pro" | Ad tech, Adhesive Technologies, Inc. | Model 1105 | |
| glue "Ad tech MINI SIZE, Multi Temp" | Ad tech, Adhesive Technologies, Inc. | 220-34ZIP30 | |
| MDCK cells | ATCC | CRL-2935 | |
| Washed Pooled Turkey Red Blood Cells, 10% | Lampire Biological Laboratories | 724908 |
References
- Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Estimates of deaths associated with seasonal influenza --- United States, 1976-2007. MMWR. Morbidity and mortality weekly report. 59 (33), 1057-1062 (2010).
- Neumann, G., Noda, T., Kawaoka, Y. Emergence and pandemic potential of swine-origin H1N1 influenza virus. Nature. 459 (7249), 931-939 (2009).
- Tumpey, T. M., Garcia-Sastre, A., et al. Pathogenicity of Influenza Viruses with Genes from the 1918 Pandemic Virus: Functional Roles of Alveolar Macrophages and Neutrophils in Limiting Virus Replication and Mortality in Mice. J Virol. 79 (23), 14933-14944 (2005).
- Doherty, P. C., Turner, S. J., Webby, R. G., Thomas, P. G. Influenza and the challenge for immunology. Nat Immu. 7 (5), 449-455 (2006).
- Webster, R. G., Govorkova, E. A.
- Szretter, K. J., Balish, A. L., Katz, J. M. Unit 15G.1 Influenza: propagation, quantification, and storage. . Current protocols in microbiology. , Wiley. (2006).
- Short, K. R., Kroeze, E. J. B. V., Fouchier, R. A. M., Kuiken, T. Pathogenesis of influenza-induced acute respiratory distress syndrome. Lancet Infect Dis. 14 (4), 57-69 (2014).
- Ito, T., Suzuki, Y., et al. Differences in sialic acid-galactose linkages in the chicken egg amnion and allantois influence human influenza virus receptor specificity and variant selection. J Virol. 71 (4), 3357-3362 (1997).
- Robertson, J. S., Nicolson, C., Major, D., Robertson, E. W., Wood, J. M. The role of amniotic passage in the egg-adaptation of human influenza virus is revealed by haemagglutinin sequence analyses. J Gen Virol. 74 (Pt 10), 2047-2051 (1993).
- Gaush, C. R., Smith, T. F. Replication and plaque assay of influenza virus in an established line of canine kidney cells). Appl Microbiol. 16 (4), 588-594 (1968).
