Abstract
Influenza infectie is geassocieerd met ongeveer 36.000 doden en meer dan 200.000 ziekenhuisopnames per jaar in de Verenigde Staten. De continue opkomst van nieuwe influenzavirusstammen door mutatie en recombinatie bemoeilijkt de controle van het virus en vereist de permanente ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen en vaccins. Het laboratoriumonderzoek van influenza is een betrouwbare en kosteneffectieve werkwijze voor de vermeerdering van het virus. Hier wordt een uitgebreid protocol waarin influenza A virus propagatie in vruchtbare kippeneieren, die consequent levert hoge titer virale voorraden. Kortom, zijn serum pathogeenvrije (SPF) bevruchte kippeneieren geïncubeerd bij 37 ° C en 55-60% luchtvochtigheid gedurende 10 - 11 dagen. Gedurende deze periode, kan ontwikkeling van het embryo gemakkelijk worden gecontroleerd met behulp van een ei candler. Virusinoculatie wordt uitgevoerd door injectie van het virus voorraad verricht naar de allantoïsholte behulp van een naald. Na 2 dagen incubatie bij 37 ° C, de eierengekoeld gedurende ten minste 4 uur bij 4 ° C. De eierschaal boven de luchtzak en het chorioallantoïsmembraan worden vervolgens voorzichtig geopend en de allantoïsvloeistof met het virus geoogst. De vloeistof wordt uit afval door centrifugatie geklaard porties verdeeld en overgebracht naar -80 ° C voor langdurige opslag. De grote hoeveelheid (5-10 ml virus bevattende vloeistof per ei) en hoge virustiter die meestal bereikt met dit protocol is het gebruik van eieren voor viruspreparaat voordelige wijze gemaakt, met name voor in vitro studies die grote hoeveelheden nodig virus waarbij hoge doseringen van hetzelfde virus voorraad nodig.
Introduction
Influenza A blijft een belangrijke bedreiging voor de menselijke gezondheid. Het is een potentieel verwoestende ziekte van de luchtwegen met een grote globale last veroorzaken tot 500.000 doden wereldwijd per jaar 1. Influenza virussen zijn in de familie Orthomyxoviridae en uitvoeren 8 negatieve-sense enkelstrengs RNA in hun genoom 1,2. De hoge veranderlijkheid (dwz antigene "drift") van het virale genoom voorkomt langdurige immuniteit. Bovendien influenza steeds resistent tegen antivirale geneesmiddelen 3.
De 2009 H1N1-grieppandemie gemarkeerd alle uitdagende kwesties in verband met influenza ziekte (pandemische stam, anti-virale resistentie, vertraagde de productie van vaccins). De formulering vaccin wordt jaarlijks vastgesteld door de World Health Organization voor de meest waarschijnlijke pathogene influenza stammen (een voor elk van H1N1, H3N2 en influenza B) 4. Omdat deze methode is gebaseerd op de voorspelde influenzastams, pathogene stammen worden soms ten onrechte geïdentificeerd en effectiviteit van het vaccin daalt dramatisch. Bovendien kan de verschijning van nieuwe influenzastammen deze preventieve programma's veroorzaken pandemische ziekte 2 te omzeilen.
De creatie van een universeel griepvaccin is ongrijpbaar 5 geweest. Daarom moet het onderzoek voort te zetten naar het begrijpen van de pathogenese van longschade. Om faciliteit laboratoriumonderzoek zijn verscheidene werkwijzen ontwikkeld voor virale isolatie en vermeerdering 6. Menselijke influenzavirussen kan worden geamplificeerd in verschillende zoogdiercel substraten. Echter, zijn het genereren van hoge titer virussen in grote hoeveelheden best bereikt in bebroede eieren. Het volgende protocol beschrijft een techniek voor influenza A virus verspreiding en opslag van bestaand virus voorraden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Algemene opmerkingen: Voer alle procedures waarbij manipulatie van het ei onder steriele omstandigheden, en steriele techniek moet dienovereenkomstig worden gebruikt. Pre-clean alle apparatuur met 70% ethanol voor gebruik. In het algemeen moeten influenza virus inoculatie en oogst worden uitgevoerd in een BSL-2 laboratorium. Echter, als dit protocol wordt gebruikt om zich te verspreiden veel meer pathogene influenza virussen (bv pandemie en pre-pandemische stammen, stammen die een gevaar voor pluimvee en vee, hoogpathogene aviaire influenza stammen, de 1918 H1N1-stam vormen), hogere bioveiligheid niveaus en in sommige gevallen, zijn biosecurity voorzorgsmaatregelen en vergunningen vereist. De lokale institutionele bioveiligheid comité moet al het onderzoek met het influenzavirus te keuren.
1. Voorbereiding van Eieren voor Inenting
- Verkrijgen serum-pathogeen vrij (SPF) vers bevruchte vogeleieren van een geschikte leverancier. Gewoonlijk worden kippeneieren gebruikt. Eieren moeten onsed direct na aankomst.
- Bij aankomst plaats eieren in een bevochtigde ei incubator met een automatische ei turner om eieren regelmatig draaien. Als een automatische ei turner niet beschikbaar is, handmatig draaien eieren minstens 2-3 keer per dag (zorg ervoor om handschoenen te dragen en houden alles zo steriel mogelijk).
- Incubeer eieren bij 37 ° C en 55-60% vochtigheid 10-11 dagen.
2. schouwinrichtingen
- Gebruik een ei candler het ei tegen een helder licht onderzoeken in een donkere kamer om eieren onvruchtbaarheid checken schouwen na ongeveer 7 of 8 dagen incubatie.
- Veeg het ei candler met 70% ethanol. Verander handschoenen vaak en desinfecteren met 70% ethanol om het risico op besmetting door ziekteverwekkers minimaliseren.
- Haal de eieren uit de broedmachine en plaats ze in lege eierdozen.
- Uitschakelen van de verlichting in de kamer.
- Houd het brede uiteinde van elk ei een voor een tegen candler.
- Observeer het ei te determine als het vruchtbaar of onvruchtbaar.
OPMERKING: Dunne bloedvaten leidt tot een boonvormige embryo moet duidelijk zichtbaar zijn. Onbevruchte eieren zal verschijnen als een kleine bloedvlek met een zichtbare eigeel.
- Gooi eieren die onbevrucht zijn, en de terugkeer van de levensvatbare eieren naar de incubator. Eieren niet verlaten buiten de incubator gedurende meer dan 30 min. Als de status van een ei niet kan worden bevestigd, markeren, en observeer het later.
3. Bereiding van virusinoculum
- Verdun influenza virus stock tot 10 maart - 10 april pfu / ml in steriel PBS bevattende 10 mM HEPES (pH 7,4). Kritische stap: Verdun het virus voorraad direct voor gebruik en bewaar het verdunde virus op het ijs de hele tijd.
4. Influenza virusinoculatie via de allantoïs Route
- Op de dag van virus inoculatie (dag 10 of 11), kaars de eieren opnieuw en dode embryo elimineren. Onderscheiden levend embryo's doorzoekt beweging in het ei.
- Verwijder drie eieren uit de incubator, en leg de eieren in een aparte houder met de luchtzak up.
- Markeren het luchtruim van de eieren met een permanent marker.
- Was de eierschaal boven het luchtruim met 70% ethanol.
- Doe de eieren met de luchtruimte in een eierdoos en in een bioveiligheid kap (BSL-2).
- Gebruik een steriele 18G naald om een klein gaatje te slaan in de shell over de luchtzak van elk ei. Wees voorzichtig dat u de naald te diep in te voegen om te voorkomen steken het embryo of de dooier.
- Het opstellen van de verdunde influenzavirus in een steriele 1 ml spuit en bevestig een 22G naald.
- Vooraf zorgvuldig de spuit met naald in een hoek van 45 ° in de allantoïsholte.
- Injecteer 0,2 ml van de verdunde influenzavirus.
- Herhaal de injectie met de andere twee eieren, en vervolgens de spuit en naald weg te gooien.
- Dicht het gat met een druppel lijm uit een lijmpistool (of gesmolten paraffine). Be oppassen dat de lijm niet in het ei lekt.
- Leg de eieren terug in het ei incubator met de luchtruimte omhoog gericht.
- Herhaal stap 4,2-4,12 totdat alle eieren geïnoculeerd.
5. incubatietijd
- Incubeer de besmette eieren zonder te draaien bij 37 ° C en ~ 60% vochtigheid.
- Kies optimale incubatietijd afhankelijk van het influenzavirus. Incubeer influenza A gedurende 48 uur; incubeer influenza B en C voor 72 uur.
6. Influenza Virus Harvest
- Na incubatie, koel de eieren bij 4 ° C gedurende ten minste 4 uur (of O / N) om de embryo te doden en de bloedvaten vernauwen om het risico van besmetting van de geïnfecteerde allantoïsvloeistof met bloed. Doe dit om te voorkomen dat rode bloedcellen absorberen het virus, die de opbrengst vermindert. Alternatief chill eieren gedurende 30 minuten bij -20 ° C; maar dit verhoogt het risico op besmetting bloed.
- Nadat de eieren voldoende gekoeld zijn geweest, de overdracht van de eieren naar een bioveiligheid kap. Leg het ei in een stevige houder met de luchtzak naar boven. Reinig het ei oppervlak met 70% ethanol.
- Gebruik steriele schaar om de eierschaal boven de luchtzak te openen. Verwijder de schil rond de luchtzak terwijl dat evenwel niet tot de chorioallantoïsmembraan vernietigen.
- Open de chorioallantoïsmembraan met steriele stompe pincet. Beweeg terzijde het embryo en de dooierzak met een kleine spatel of lepel. Verzorgen de dooier niet te scheuren.
- Met behulp van een 1 ml Eppendorf pipet voorzichtig het verzamelen van de allantoïsvloeistof. Indien nodig, kantel het ei een beetje naar de zijkant om zo veel vocht als mogelijk te verzamelen.
- Combineer de allantoïsvloeistof van de eieren in een 50 ml plastic conische buis. Houd buizen op ijs te allen tijde tijdens virus oogst. Een ei opbrengsten 5-10 ml van een licht geelachtige vloeistof.
- Spin de virus bevattende allantoïsvloeistof bij 1000 xg gedurende 10 min bij 46, C vuil pelleteren. Breng de heldere vloeistof in een nieuwe 50 ml buis op ijs bewaard. Gooi de eieren in een BSL-2 afvalcontainer.
7. Opslag
- Onmiddellijk aliquot de geklaarde allantoïsvocht (bijvoorbeeld 50, 100 of 500 ul aliquots) en module bevriezen in vloeibare stikstof. Transfer bevroren virusvoorraden tot -80 ° C vriezer voor langdurige opslag.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Meerdere methoden ontwikkeld om influenzavirus titreren. Een overweging bij het kiezen van een geschikte methode is dat sommige bepalen totale deeltjes onafhankelijk van de levensvatbaarheid (bijv hemagglutinine-test), terwijl anderen zijn gebaseerd op de besmettelijkheid, die levensvatbaar virusdeeltjes zal beoordelen (bijvoorbeeld plaque assay) 6. Hier, de virale titer van allantoïsvloeistof vanuit kippeneieren geënt met een muis-aangepaste influenzavirus (A / PR / 8/34) werd bepaald door plaque assay (figuur 1) en hemagglutinatie assay (figuur 2).
Influenza virus infectie veroorzaakt cytopathisch effect die resulteren in plaques (cirkelvormige zones van gelyseerde cellen) te vormen op een monolaag van cellen. Plaques werden zichtbaar gemaakt door kleuring van de cellen met kristalviolet en 65 plaques werden geteld in de put met de 10 -12 verdunning van virus (Figuur 1). Omdat 500 L van verdunde virale voorraad wzoals het op de cellen, de uiteindelijke titer 1,3 x 10 14 PFU / ml.
De hemagglutinatie assay is een methode om influenzavirus bases titreren van het vermogen van het virus te hechten aan het oppervlak van rode bloedcellen. Een virale schorsing zal agglutineert de rode bloedcellen, waardoor ze niet uit de afwikkeling van schorsing. Door seriële verdunningen van virus in een 96-well plaat (of V- of ronde bodem) en het toevoegen van een vaste hoeveelheid rode bloedcellen, kan de virale titer bepaald. Een duidelijk negatief resultaat werd waargenomen met de 1: 2 10 verdunning van het virus in 50 gl (figuur 2). Daarom is de uiteindelijke titer 2,1 x 10 4 HAU / ml.
Figuur 1. Kwantificering van PR8 virustiter door plaque assay. Een monolaag van MDCK-cellen werd geïnfecteerd met 10-voudige serial verdunningen van PR8 (10 -1 - 10 -12) gedurende 1 uur, gewassen, en vervolgens bedekt met een 0,6% agarose-oplossing. Na incubatie bij 37 ° C gedurende 72 uur werd agar zorgvuldig verwijderd en de cellen werden gefixeerd en gekleurd met 0,25% kristalviolet. Plaquevorming is te vergelijken met een niet-geïnfecteerde controle (CTR). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. Hemagglutinatie (HA) Gehalte aan titer ei-afgeleide PR8 influenzavirus. PR8 virus werd serieel verdund 2-voudig in PBS en gemengd met 50 liter 0,5% kalkoen rode bloedcellen. Verdunningen werden bereid in viervoud en beelden werden genomen na 1 uur incubatie bij KT. Negatieve resultaten worden weergegeven als stippen in het midden van de putten, terwijl positieve resultatenvormen een uniforme roodachtige kleur over de bron. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Influenza veroorzaakt een grote wereldwijde ziektelast, en werk gaat in het begrijpen van de pathogenese van longbeschadiging 7. Om vergemakkelijkt onderzoek op dit dodelijke ziekte, zijn verschillende methoden ontwikkeld om het influenzavirus 6 propageren. Hier beschrijven we een techniek om influenzavirus produceren kippeneieren. Het voordeel van deze methode is dat het zeer reproduceerbaar en resulteert in grote hoeveelheden hoge titer influenzavirus bestanden, die vaak nodig is voor in vitro studies.
De meeste laboratoria in staat zal zijn om dit protocol snel en gemakkelijk te ontwikkelen met minimale opstartkosten. Hoewel raden wij investeren in een ei incubator met automatische turner, kan dit protocol worden voltooid zonder deze apparatuur, maar zal meer bewerkelijk zijn. We raden ook aan het gebruik van commercieel onderzoek leveranciers voor de aankoop van bevruchte eieren aan consistentie en steriliteit van de eieren te waarborgen. Het Bureau van Laboratheugen Animal Welfare (OLAW) interpretatie van de Public Health Service (PHS) Beleid inzake Humane zorg en het gebruik van proefdieren stelt voor het onderzoek gebruik van levende bebroede vogeleieren dat de PHS beleid is alleen van toepassing na het uitkomen. Daarom zullen de meeste instellingen niet IACUC goedkeuring van dit protocol nodig. Echter, verschillen tussen instellingen, en de goedkeuring Institutionele bioveiligheid commissie zal voor het begin van dit protocol vereist.
Bij het werken met het virus, is het van het grootste belang om het virus bij 4 ° C te houden na het oogsten van de allantoïsvocht van de besmette bevruchte eicel. Elk ei moet opleveren van 5-10 ml allantoïsvocht en de titer is afhankelijk van de stam van influenzavirus. Ons laboratorium heeft routinematig gebruikt deze methode om een muis-aangepaste H1N1-stam (A / PR / 8/34) propageren. Dit protocol kan ook gebruikt worden voor klinische monsters, maar in deze situatie, kan inoculatie van de amnionholte voorkeur hebben vanwege de presence 2,6-gekoppelde siaalzuren nodig zijn voor binding in het vruchtwater voering 8,9. Een andere overweging is dat deze methode niet geschikt voor vermeerdering aviaire influenza virussen (bijv H5N1 stammen) door de pathogeniciteit voor het embryo kan zijn.
Verschillende methoden titering het influenzavirus zijn die allemaal hun voordelen en nadelen ontwikkeld. Inderdaad, virale kwantificering zijn op eiwit gebaseerde (bijvoorbeeld hemagglutinine assay, ELISA), nucleïnezuur gebaseerde (bijvoorbeeld kwantitatieve PCR), of functionele (bv virale plaque assay) 6. Niet-functionele assays zal de totale virale titers te bepalen, ongeacht of zij levend of dood virusdeeltjes. Derhalve testen voor de infectieuze activiteit van het influenzavirus meet levende virussen en zorgen voor vergelijkbare functionele equivalentie van partij tot partij. De plaque vormende test is een veelgebruikte test die titers van de live influenza vir kunnen beoordelenons, maar kan traag en omslachtig om te presteren 10 zijn. Ter vergelijking: de hemagglutinine test is eenvoudig en ongecompliceerd, maar heeft levensvatbaarheid niet beoordelen en bepaalt alle influenza deeltjes.
Hierin bieden we een relatief eenvoudige methode om een hoge titer influenzavirus propageren. De novo opening van dit protocol in een lab is eenvoudig, en de uitgangsmaterialen en apparatuur zijn relatief goedkoop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Cellgro | 21-040-CV | |
| serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs | VALO BioMedia | ||
| humidified egg incubator | FARM iNNOVATORS | Model 2100 | |
| automatic egg turner | FARM iNNOVATORS | Model 3200 | |
| egg candler | FARM iNNOVATORS | Model 3300 | |
| 1 ml syringe | BD Bioscience | 309659 | |
| 18G needle | BD Bioscience | 305196 | |
| 20G / 22G needle | BD Bioscience | 305176 / 305156 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Ethanol>99.5% | Sigma-Aldrich | 459844 | diluted to 70% using water |
| glue gun "Ad tech Hi Temp Project Pro" | Ad tech, Adhesive Technologies, Inc. | Model 1105 | |
| glue "Ad tech MINI SIZE, Multi Temp" | Ad tech, Adhesive Technologies, Inc. | 220-34ZIP30 | |
| MDCK cells | ATCC | CRL-2935 | |
| Washed Pooled Turkey Red Blood Cells, 10% | Lampire Biological Laboratories | 724908 |
References
- Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Estimates of deaths associated with seasonal influenza --- United States, 1976-2007. MMWR. Morbidity and mortality weekly report. 59 (33), 1057-1062 (2010).
- Neumann, G., Noda, T., Kawaoka, Y. Emergence and pandemic potential of swine-origin H1N1 influenza virus. Nature. 459 (7249), 931-939 (2009).
- Tumpey, T. M., Garcia-Sastre, A., et al. Pathogenicity of Influenza Viruses with Genes from the 1918 Pandemic Virus: Functional Roles of Alveolar Macrophages and Neutrophils in Limiting Virus Replication and Mortality in Mice. J Virol. 79 (23), 14933-14944 (2005).
- Doherty, P. C., Turner, S. J., Webby, R. G., Thomas, P. G. Influenza and the challenge for immunology. Nat Immu. 7 (5), 449-455 (2006).
- Webster, R. G., Govorkova, E. A.
- Szretter, K. J., Balish, A. L., Katz, J. M. Unit 15G.1 Influenza: propagation, quantification, and storage. . Current protocols in microbiology. , Wiley. (2006).
- Short, K. R., Kroeze, E. J. B. V., Fouchier, R. A. M., Kuiken, T. Pathogenesis of influenza-induced acute respiratory distress syndrome. Lancet Infect Dis. 14 (4), 57-69 (2014).
- Ito, T., Suzuki, Y., et al. Differences in sialic acid-galactose linkages in the chicken egg amnion and allantois influence human influenza virus receptor specificity and variant selection. J Virol. 71 (4), 3357-3362 (1997).
- Robertson, J. S., Nicolson, C., Major, D., Robertson, E. W., Wood, J. M. The role of amniotic passage in the egg-adaptation of human influenza virus is revealed by haemagglutinin sequence analyses. J Gen Virol. 74 (Pt 10), 2047-2051 (1993).
- Gaush, C. R., Smith, T. F. Replication and plaque assay of influenza virus in an established line of canine kidney cells). Appl Microbiol. 16 (4), 588-594 (1968).
