Abstract
Influensa infektion är associerad med ca 36.000 döda och mer än 200.000 sjukhus varje år i USA. Den kontinuerliga uppkomsten av nya influensavirus stammar på grund av mutation och åter sortiment komplicerar kontrollen av viruset och nödvändiggör den ständiga utvecklingen av nya läkemedel och vacciner. Den laboratoriebaserad studie av influensa krävs en pålitlig och kostnadseffektiv metod för förökning av viruset. Här är en omfattande protokoll som avses influensa A-virus förökning hos fertila hönsägg, som konsekvent ger hög titer virala lager. I korthet, är serum patogenfria (SPF) befruktade hönsägg inkuberades vid 37 ° C och 55 till 60% fuktighet under 10 till 11 dagar. Under denna period kan embryoutveckling lätt övervakas med hjälp av ett ägg Candler. Virus inokulering utförs genom injektion av virusförråd in i allantoiskaviteten hjälp av en nål. Efter två dagars inkubation vid 37 ° C, äggen ärkyld under minst 4 h vid 4 ° C. Den äggskal ovanför luftsäcken och korioallantoinmembranet därefter försiktigt öppnas och allantoisvätska innehållande viruset skördas. Fluiden rensas från skräp genom centrifugering, alikvoterades och överfördes till -80 ° C för långtidsförvaring. Den stora mängden (5-10 ml virusinnehållande vätska per ägg) och hög virus titer som vanligtvis uppnås med detta protokoll har gjort användningen av ägg för viruspreparat vårt gynnsamma metoden, i synnerhet för in vitro-studier som kräver stora mängder av virus i vilket behövs höga doser av samma virus lager.
Introduction
Influensa A fortsätter att vara ett stort hot mot människors hälsa. Det är en potentiellt förödande respiratorisk sjukdom med en stor global börda orsakar upp till 500.000 dödsfall årligen 1 i världen. Influensavirus är i familjen Orthomyxoviridae och bära åtta negativ-sense enkelsträngat RNA i sitt genom 1,2. Den höga föränderlighet (dvs antigena "avdrift") av det virala genomet förhindrar långvarig immunitet. Dessutom är influensa alltmer resistent mot antivirala läkemedel 3.
Den 2009 H1N1 influensapandemi markeras alla utmanande frågor i samband med influensasjukdom (pandemistammen, anti-virusresistens, fördröjd vaccinproduktion). Vaccinformuleringen bestäms årligen av Världshälsoorganisationen för de mest sannolika patogena influensastammar (en vardera för H1N1, H3N2 och influensa B) 4. Eftersom denna metod är baserad på förutsagd influensastams, är patogena stammar ibland felaktigt identifierade och vaccineffekt sjunker dramatiskt. Dessutom kan uppkomsten av stammar nya influensa kringgå dessa förebyggande program som orsakar pandemin sjukdom 2.
Skapandet av ett universellt influensavaccin har varit svårfångade 5. Därför måste forskningen fortsätter in förstå patogenesen av lungskada. Till anläggningen laboratorieforskning har flera metoder utvecklats för viral isolering och förökning 6. Mänskliga influensavirus kan amplifieras i en mängd av däggdjurscellsubstrat. Dock genererar hög titer virus i stora mängder bäst uppnås i embryo ägg. Följande protokoll beskriver en teknik för influensa A-virus förökning och lagring från befintliga virusstammar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Allmänna anmärkningar: Utför alla förfaranden som rör manipulation av ägget under sterila förhållanden, och steril teknik ska användas i enlighet därmed. Pre-ren all utrustning med 70% etanol före användning. I allmänhet bör influensavirus ympning och skörd ske i en BSL-2 laboratorium. Om detta protokoll används för att propagera mycket mer patogena influensavirus (t.ex. pandemier och pre-pandemistammar, stammar som utgör en fara för fjäderfä och boskap, högpatogena virusstammar aviär influensa, 1918 H1N1-stammen), högre biosäkerhet nivåer och i vissa fall, är biosäkerhet försiktighetsåtgärder och tillstånd krävs. Den lokala institutionella biosäkerhet kommittén bör godkänna alla forskning som innefattar influensavirus.
1. Beredning av ägg för Ympning
- Skaffa serum patogenfria (SPF) nyligen befruktade fågelägg från en lämplig leverantör. Typiskt hönsägg används. Ägg ska vara ossed omedelbart efter ankomsten.
- Vid ankomsten plats ägg i en fuktig ägg inkubator med en automatisk ägg turner att rotera äggen regelbundet. Om en automatisk ägg turner inte är tillgänglig, rotera manuellt ägg minst 2-3 gånger om dagen (se till att använda handskar och hålla allt så sterilt som möjligt).
- Inkubera ägg vid 37 ° C och 55-60% luftfuktighet under 10-11 dagar.
2. Ägg Ljus
- Använd ett ägg candler att undersöka ägget mot ett starkt ljus i ett mörkt rum för att kolla ägg för infertilitet genom genomlysning efter ca 7 eller 8 dagars inkubation.
- Torka ägget candler med 70% etanol. Byt handskar ofta och desinficera med 70% etanol för att minimera risken för kontamination av patogener.
- Ta bort ägg från inkubatorn och placera dem i tomma äggkartonger.
- Släck ljuset i rummet.
- Håll den stora änden av varje ägg ett i taget mot candler.
- Observera ägget att fastställbarae om det är fertil eller infertil.
OBS: Tunna blodkärl som leder till en böna-formad embryo bör synas tydligt. Obefruktade ägg kommer att visas som en liten blod plats med en synlig äggula.
- Kasta ägg som är obefruktade och returnera de livsdugliga ägg till inkubatorn. Lämna inte ägg utanför inkubator för mer än 30 minuter. Om status för ett ägg inte kan bekräftas, markera den, och observera det senare.
3. Beredning Virus Vaccin
- Späd influensavirus lager till ca MARS 10-april 10 pfu / ml i steril PBS innehållande 10 mM HEPES (pH 7,4). Kritisk steg: Späd viruset lager omedelbart före användning och hålla den utspädda viruset på is hela tiden.
4. influensavirus Ympning via allantois Route
- På dagen för virusinokulation (dag 10 eller 11), ljus äggen igen och eliminera eventuella döda embryon. Skilj levande embryon frånsöker rörelse inne i ägget.
- Ta tre ägg från inkubatorn och ordna äggen i en separat hållare med luftsäcken upp.
- Markera luftrum äggen med en permanent markör.
- Tvätta äggskal ovanför luftutrymme med 70% etanol.
- Sätt äggen med luftutrymmet upp i en äggkartong och in i en biosäkerhet huva (BSL-2).
- Använd en steril 18G nål för att stansa ett litet hål i skalet över luftsäcken för varje ägg. Var noga med att inte sätta in nålen för djupt för att undvika stickande embryot eller äggula.
- Rita upp det utspädda influensavirus i en steril 1 ml spruta och bifoga en 22G nål.
- Försiktigt föra sprutan med nålen i 45 ° vinkel in i allantoiskaviteten.
- Injicera 0,2 ml av den utspädda influensavirus.
- Upprepa injektionen med de andra två ägg, och sedan kassera sprutan och nålen.
- Täta hålet med en droppe lim från en limpistol (eller smält paraffin). Be försiktig att läcka lim inte inne i ägget.
- Placera äggen tillbaka in i ägget inkubator med luftrummet pekade uppåt.
- Upprepa steg från 4,2 till 4,12 tills alla ägg har ympats.
5. Inkubationstid
- Inkubera de infekterade äggen utan att vända vid 37 ° C och ~ 60% luftfuktighet.
- Välj optimala inkubationstiden beroende på typ influensavirus. Inkubera influensa A under 48 timmar; inkubera influensa B och C för 72 h.
6. influensavirus Harvest
- Efter inkubationsperioden, chill äggen vid 4 ° C under ett minimum av 4 h (eller O / N) för att döda embryot och sammandra blodkärlen för att minska risken för kontaminering den infekterade allantoisvätska med blod. Gör detta för att förhindra att de röda blodkropparna från att absorbera viruset, vilket reducerar utbytet. Alternativt, chill ägg för 30 minuter vid -20 ° C; men detta ökar risken för blodsmitta.
- Efter äggen har varit tillräckligt kyld, överför äggen till en biosäkerhet huva. Placera ägget i en fast hållaren med luftsäcken uppåt. Rengör ägget ytan med 70% etanol.
- Använd steril sax för att öppna äggskal ovanför luftsäcken. Ta bort skalet runt luftsäcken samtidigt vara noga med att inte förstöra korioallantoinmembranet.
- Öppna korioallantoinmembranet med sterila trubbiga pincett. Rör försiktigt åt sidan embryot och gulesäcken med en liten spatel eller sked. Se till att inte brista äggulan.
- Med hjälp av en 1 ml Eppendorf pipett noggrant samla amnionvätskan. Om det behövs, luta ägget lite åt sidan för att samla in så mycket vätska som möjligt.
- Kombinera allantoisvätska från alla äggen i en 50 ml plast koniskt rör. Håll rören på is under hela virus skörd. Ett ägg avkastning 5 - 10 ml av en något gulaktig vätska.
- Snurra virusinnehållande allantoisvätska vid 1000 xg under 10 min vid 46; C för att pelletera debris. Överför den klara vätskan till ett nytt 50 ml rör hålls på is. Släng äggen i en BSL-2 avfallsbehållare.
7. Förvaring
- Omedelbart Alikvotera klar allantoisvätska (t.ex. 50, 100 eller 500 ul portioner) och snap-frysa i flytande kväve. Överför frysta virusstammar till -80 ° C frys för långtidsförvaring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Flera metoder har utvecklats för att titrera influensavirus. Ett övervägande vid val av lämplig metod är att vissa bestämmer totala partiklar oavsett viabilitet (t.ex. hemagglutinin assay) medan andra är baserade på smittsamhet, vilket kommer att bedöma livskraftiga virioner (t.ex. plackanalys) 6. Här, var den virala titern av allantoisvätska uppsamlas från kycklingägg ympade med en mus-anpassad influensavirus (A / PR / 8/34) bestämdes genom plackanalys (fig 1) och hemagglutineringsanalys (Figur 2).
Influensavirus infektion orsakar en cytopatisk effekt som leder till plack (cirkulära zoner av lyserade celler) för att bilda en monolager av celler. Plack visualiserades genom färgning av cellerna med kristallviolett, och 65 plack räknades i brunnen med 10 -12 utspädning av virus (Figur 1). Eftersom 500 liter utspädd virusstam wsom släpps ut på cellerna, är den slutliga titern 1,3 x 10 14 ^ PFU / ml.
Den hemagglutineringsanalys är en metod att titrera influensavirusbaser på virusets förmåga att fästa till ytan av röda blodkroppar. En viral suspension agglutinerar de röda blodcellerna, vilket hindrar dem från att sedimentera ut ur suspensionen. Genom att använda seriespädningar av virus i en 96-brunnars platta (antingen V- eller rund botten) och tillsätta en fast mängd av röda blodkroppar, kan den virala titern bestämmas. En tydligt negativt resultat observerades med 1: 2 10 utspädning av virus i 50 | il (Figur 2). Därför är den slutliga titern 2,1 x 10 4 HAU / ml.
Figur 1. Kvantifiering av PR8 Virustiter med plackanalys. Ett monoskikt av MDCK-celler infekterades med 10-faldig serial utspädningar av PR8 (10 -1 - 10 -12) för en timme, tvättades, och därefter överdras med en 0,6% agaros-lösning. Efter inkubation vid 37 ° C under 72 h tillfördes agar avlägsnades försiktigt, och cellerna fixerades och färgades med 0,25% kristallviolett. Plackbildning var jämföra med infektionsfria kontrollen (CTR). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. hemagglutination (HA) Assay till Titer äggderiverade PR8 influensavirus. PR8-virus serieutspäddes 2-faldigt i PBS och blandades med 50 liter av 0,5% kalkon röda blodkroppar. Späd bereddes i kvadruplikat och bilder togs efter 1 timme inkubation vid RT. Negativa resultat visas som prickar i mitten av brunnarna medan positiva resultatbilda en enhetlig rödaktig färg över brunnen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Influensa orsakar en stor globala sjukdomsbördan, och arbetet fortsätter in förstå patogenesen av lungskada 7. Att underlättat forskningen i denna dödliga sjukdom, har olika metoder utvecklats för att propagera influensavirus 6. Här beskriver vi en teknik för att producera influensavirus i hönsägg. Fördelen med denna metod är att den är mycket reproducerbar och resulterar i stora mängder med hög titer influensavirus lager, vilket ofta är nödvändigt för studier in vitro.
De flesta laboratorier kommer att kunna utveckla detta protokoll snabbt och enkelt med minimala startkostnader. Även om vi rekommenderar att investera i ett ägg inkubator med automatisk Turner, kan detta protokoll fyllas utan sådan utrustning, men kommer att vara mer arbetskrävande. Vi rekommenderar också att använda kommersiella forsknings leverantörer för inköp av befruktade ägg för att garantera konsekvens och sterilitet av äggen. Kontoret för Laboratory djurskydds (OLAW) tolkning av Public Health Service (PHS) Policy för mänsklig omsorg och användning av försöksdjur uppger för forskningsändamål av levande embryone fågelägg som PHS policy gäller endast efter kläckningen. Därför kommer de flesta institutioner inte kräva IACUC godkännande för detta protokoll. Men politiken varierar mellan institutionerna, och godkännande Institutionell Biosäkerhetskommittén kommer att krävas innan den inleder detta protokoll.
När du arbetar med viruset, är det av största vikt att hålla viruset vid 4 C efter skörda allantoisvätska från smittade embryone ägget. Varje ägg förväntas producera mellan 5-10 ml allantoisvätska, och titern beror på den stam av influensavirus. Vårt laboratorium har rutinmässigt använt denna metod för att propagera en mus anpassad H1N1-stammen (A / PR / 8/34). Detta protokoll kan också användas för kliniska prover, men i denna situation, kan ympning av fostervattenhålan vara att föredra på grund av att presence av 2,6-länkade sialinsyror behövs för bindning inom foster fodret 8,9. En annan faktor är att denna metod inte kan vara perfekt för utbrednings aviär influensavirus (t.ex. H5N1 stammar) på grund av patogenicitet för embryot.
Olika metoder för titrering av influensavirus har utvecklats vilka alla har sina fördelar och nackdelar. I själva verket kan viralt kvantifiering vara proteinbaserade (t.ex., hemagglutinin-analys, ELISA), nukleinsyra-baserad (t.ex., kvantitativ PCR), eller funktionell (t.ex. virusplackanalys) 6. Icke-funktionella analyser kommer att avgöra den totala virustitrar oavsett om de är levande eller döda viruspartiklar. Därför kommer att testa för den smittsamma aktiviteten hos influensavirus mäta levande virus och möjliggöra jämförbara funktionell likvärdighet från parti till parti. Den plackbildande analys är ett vanligt använt test som kan bedöma titrar av levande influensa viross, men kan vara långsam och besvärlig att utföra 10. I jämförelse är hemagglutinin analysen enkel och okomplicerad, men bedömer inte lönsamheten och bestämmer alla partiklar influensa.
Häri, tillhandahåller vi en relativt enkel metod för att propagera hög titer influensavirus. Den de novo initiering av detta protokoll i ett labb är okomplicerad, och utgångsmaterial och utrustning är relativt billiga.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Cellgro | 21-040-CV | |
| serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs | VALO BioMedia | ||
| humidified egg incubator | FARM iNNOVATORS | Model 2100 | |
| automatic egg turner | FARM iNNOVATORS | Model 3200 | |
| egg candler | FARM iNNOVATORS | Model 3300 | |
| 1 ml syringe | BD Bioscience | 309659 | |
| 18G needle | BD Bioscience | 305196 | |
| 20G / 22G needle | BD Bioscience | 305176 / 305156 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Ethanol>99.5% | Sigma-Aldrich | 459844 | diluted to 70% using water |
| glue gun "Ad tech Hi Temp Project Pro" | Ad tech, Adhesive Technologies, Inc. | Model 1105 | |
| glue "Ad tech MINI SIZE, Multi Temp" | Ad tech, Adhesive Technologies, Inc. | 220-34ZIP30 | |
| MDCK cells | ATCC | CRL-2935 | |
| Washed Pooled Turkey Red Blood Cells, 10% | Lampire Biological Laboratories | 724908 |
References
- Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Estimates of deaths associated with seasonal influenza --- United States, 1976-2007. MMWR. Morbidity and mortality weekly report. 59 (33), 1057-1062 (2010).
- Neumann, G., Noda, T., Kawaoka, Y. Emergence and pandemic potential of swine-origin H1N1 influenza virus. Nature. 459 (7249), 931-939 (2009).
- Tumpey, T. M., Garcia-Sastre, A., et al. Pathogenicity of Influenza Viruses with Genes from the 1918 Pandemic Virus: Functional Roles of Alveolar Macrophages and Neutrophils in Limiting Virus Replication and Mortality in Mice. J Virol. 79 (23), 14933-14944 (2005).
- Doherty, P. C., Turner, S. J., Webby, R. G., Thomas, P. G. Influenza and the challenge for immunology. Nat Immu. 7 (5), 449-455 (2006).
- Webster, R. G., Govorkova, E. A.
- Szretter, K. J., Balish, A. L., Katz, J. M. Unit 15G.1 Influenza: propagation, quantification, and storage. . Current protocols in microbiology. , Wiley. (2006).
- Short, K. R., Kroeze, E. J. B. V., Fouchier, R. A. M., Kuiken, T. Pathogenesis of influenza-induced acute respiratory distress syndrome. Lancet Infect Dis. 14 (4), 57-69 (2014).
- Ito, T., Suzuki, Y., et al. Differences in sialic acid-galactose linkages in the chicken egg amnion and allantois influence human influenza virus receptor specificity and variant selection. J Virol. 71 (4), 3357-3362 (1997).
- Robertson, J. S., Nicolson, C., Major, D., Robertson, E. W., Wood, J. M. The role of amniotic passage in the egg-adaptation of human influenza virus is revealed by haemagglutinin sequence analyses. J Gen Virol. 74 (Pt 10), 2047-2051 (1993).
- Gaush, C. R., Smith, T. F. Replication and plaque assay of influenza virus in an established line of canine kidney cells). Appl Microbiol. 16 (4), 588-594 (1968).
