Abstract
Udskiftning, er en unik strategi udviklet for mere effektivt at målrette protein-protein interaktioner (PPI). Det sigter mod at udvide tilgængelig target narkotika plads ved at give forbedret metode til identifikation af inhibitorer for sådanne bindingssteder, og som repræsenterer størstedelen af de potentielle lægemiddelkandidater. Hovedformålet med dette oplæg er at give en metodisk overblik over brugen og anvendelsen af UDSKIFT strategi, som involverer beregningsmæssige og syntetiske kemi tilgange. REPLACE er eksemplificeret gennem sin ansøgning til udvikling af ikke-ATP konkurrencemæssig cyclinafhængige kinaser (CDK) inhibitorer som anti-tumor lægemidler. CDK'er ofte dereguleret i kræft og dermed betragtes som vigtige mål for lægemiddeludvikling. Inhibering af CDK2 / cyclin A i S-fasen er blevet rapporteret at fremme selektiv apoptose af cancerceller i en p53 uafhængigt gennem E2F1 pathway. Målretning interaktionen protein-protein ved binding en cycling rille (CBG) er en tilgang, som vil tillade den specifikke hæmning af cellecyklus i transkriptionelle CDK'er. CBG genkendes af en konsensussekvens afledt af CDK substrater og tumorsuppressorproteiner betegnes cyclin-bindende motiv (CBM). CBM er tidligere blevet optimeret til et octapeptid fra p21Waf (HAKRRIF) og derefter yderligere afkortet til en pentapeptid fastholde tilstrækkelig aktivitet (RRLIF). Peptider generelt ikke er cellepermeable, er metabolisk ustabile og derfor erstatte (udskiftning med delvis ligand Alternativer gennem Computational Enrichment) strategi er blevet anvendt med henblik på at generere flere lægemiddellignende inhibitorer. Strategien begynder med udformningen af fragment ligeret inhibitoriske peptider (flips), der selektivt inhiberer cellecyklus CDK / cyclin-komplekser. Flips blev genereret ved iterativt at erstatte rester af HAKRRLIF / RRLIF med fragment som små molekyler (capping grupper), startende fra N-terminalen (Ncaps), efterfulgt af udskiftning påC-terminalen. Disse forbindelser er udgangspunkter for generering af ikke-ATP konkurrencedygtige CDK-inhibitorer som anti-tumor lægemidler.
Introduction
I denne artikel er et casestudie af at anvende den REPLACE (udskiftning med delvis ligand alternativer ved hjælp af beregningsmæssige berigelse) strategi til at konvertere peptidiske inhibitorer af protein-protein interaktioner i flere farmaceutisk relevante molekyler beskrevet 1-3. Mens PPI repræsenterer en rig, men underudnyttet kilde til potentielle mål drug, eksisterende metoder er stort set utilstrækkelige til at gøre dem bredt tilgængelige. Nuværende strategier, herunder fragment baseret design 4, high-throughput screening 5 og hæftede peptider 6 har givet fremskridt, men disse er i mange tilfælde ineffektive. Som følge heraf er flere fremskridt og mere effektive metoder påkrævet. REPLACE er fuldt valideret i udviklingen af kinaseinhibitorer, der har forbedret lægemiddel-lignende egenskaber, og som har potentiale for yderligere udvikling som anti-tumor lægemidler. Denne strategi er eksemplificeret i udviklingen af ikke-ATP inhibitorer af cellecyklus CDK'er og involverer som følger: 1) at opnå 3D strukturel information om samspillet mellem HAKRRLIF / RRLIF med cyklin bindende rille; 2) at bestemme de vigtige bindende determinanter for peptid-interaktion; 3) trunkering af peptidet N-terminus indeholder en eller flere bindende determinanter; 4) beregningsmæssige identifikation af potentielle små molekyler alternativer (delvise ligand alternativer, PLAS) for den trunkerede del af peptidet, og som bevarer vigtigste vekselvirkninger moderselskabets peptid; 5) syntese eller kommerciel sourcing af PLA'er forudsagt at binde ivrigt med sub webstedet tidligere besat af den slettede peptidresten (r); 6) Syntese af bladrer ligering af de bedste PLA'er til den trunkerede peptid anvendelse af fastfasesyntese; 7) testning af flips i en in vitro-binding eller funktionelt assay (fluorescenspolarisering i CDK / cyclin kontekst) efterfulgt af yderligere karakterisering i en celleviabilitetstest. En skematisk repræsentation af UDSKIFT strategy er vist i figur 1. I denne artikel, er gentagelser af REPLACE strategi diskuteret og ansøgningen til CDK2 / cyclin A beskrevet i detaljer. CDKer menes at være direkte eller indirekte dereguleret i størstedelen af tumorer, og anses derfor for passende cancer drug mål 7. CDKer kræver samarbejde med cycliner for fuld aktivering og efterfølgende phosphorylerer vigtige proteiner involveret i reguleringen cellecyklus 8. De to store grupper af CDK'er er isotyper der styrer cellecykluskontrolpunkter [G1 / S (CDK4 / cyclin D, CDK6 / cyclin D og CDK4 / cyclin E), S-fasen (CDK2 / cyclin A) og G2 / M (CDK1 / cyklin B)] og regulatorer af RNA-polymerase gennem phosphorylering (CDK7 / cyklin H, CDK8 / cyklin C, CDK9 / cyklin T). Et vigtigt skridt i S-fase progression opstår, når E2F1 transkriptionsfaktoren danner et kompleks med DP-proteinet, som derefter binder til DNA og initierer gentranskription. CDK2 / cyclin A er påkrævet for at neutralisere E2F1 transkriptionelaktivitet gennem fosforylering hvilket fører til frigivelse af E2F1-DP-komplekset og efterfølgende nedbrydning. Inhibering af CDK2 / cyclin A menes at opretholde E2F1 i DNA bundne tilstand fører til vedvarende aktivering. Den resulterende niveau af E2F-1-aktivitet vil overgå tærsklen kræves for at inducere p53 uafhængig apoptose derfor tyder på en terapeutisk strategi. På grund af dereguleret p53 og pRb veje, høje niveauer af E2F-1 ofte forekommer i cancerceller og inhibering af CDK2 / cyclin A bør føre til selektiv apoptose i tumorer og kan betragtes som en valideret cancer-target 7.
Klinisk undersøgte CDK-inhibitorer målrette stærkt konserverede ATP-bindingssted fører til krydsreaktivitet blandt de mere end 500 proteinkinaser i den menneskelige kinome og potentielt giver anledning til bivirkninger og toksicitet 9. En alternativ tilgang er ikke-ATP kompetitiv hæmning ved at målrette substrat rekruttering gennem CBGstede på cyclin positive regulatoriske underenhed, og som adskiller sig derfor og fjernt fra ATP-bindingssted 10,11. CBG er primært en hydrofob rille stede i cyclin A, cyclin D og cyclin E og har vist sig at genkende en konsensus sekvens fundet i substrater og tumorsuppressorer. Som et isoleret peptid, cyclin-bindende motiv (CBM) binder til CBG og har vist sig at inhibere kinaseaktiviteten af cellecyklussen CDK'er. CBM er optimeret til et octapeptid (HAKRRLIF, CDK2 / cyclin A IC50 0,07 ± 0,02 uM, CDK4 / cyclin D, IC50 0,88 ± 0,34 uM), og desuden trunkeret til en pentapeptid repræsenterer et godt kompromis mellem molekylvægt for lægemiddel- lighed og styrke (RRLIF, CDK2 / cyklin A IC50 1,01 ± 0,17 uM, CDK4 / cyclin D, IC 50 25,12 ± 2,97 uM) 12,13. De CBGs består af en stor primær og mindre sekundære hydrofobe lomme, som er bro af en ACIDIc-regionen (inkluderer Glu220, Glu224 og Asp283). De vigtigste bindende determinanter for HAKRRLIF omfatter samspillet mellem Ala2 de sekundære hydrofobe lomme, ion parring og hydrogenbindinger af Lys3, Arg 4 og Arg5 med det sure regionen og en høj grad af komplementaritet mellem Leu6 og pHE8 med det primære lipofile site. Desuden er mange hydrogenbindinger bidraget fra peptidet rygraden, mens Ile7 fungerer som en spacer-rest giver optimal kontakt med det primære lomme. Bindingen mode og interaktioner af HAKRRLIF med CBG er vist i figur 2.
Målretning CBM / CBG protein-protein interaktion vil hæmme kinase aktivitet af CDK2 / cyklin A, CDK2 / cyklin E & CDK4 / cyclin D og det bør udløse E2F1 medieret apoptose af cancerceller uden at påvirke normale celler 7. Selv CBM afledte peptider er effektive inhibitorer af cellecyklus CDK'er, er det usandsynligt, at de vil være egnede som lægemidler på grund af deres metaboliskeustabilitet og generel mangel på cellepermeabilitet. Til dette formål har vi anvendt den UDSKIFT strategi for at konvertere disse potente peptidiske inhibitorer i flere narkotika-lignende stoffer til yderligere udvikling af anti-tumor terapi udnytter dereguleret E2F1 gennem CDK2 / cyklin A hæmning. Følgende protokol sammenfatter arbejde, der er gennemført i forbindelse med anvendelsen af REPLACE til cyklin rille. I første omgang blev identificeret narkotika-lignende cappinggruppe erstatninger for den N-terminale tetrapeptid af HAKRRLIF. Desuden forbedringer på disse grupper blev undersøgt i en yderligere validering undersøgelse for REPLACE. Repræsentative resultater fra disse undersøgelser er også præsenteret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Computational Identifikation af potentielle lille molekyle Capping Grupper
Bemærk: I princippet kan en række docking eller farmakofor søgemetoder anvendes til at forudsige potentielle capping grupper. Hovedformålet med beregningsmæssige undersøgelser i REPLACE er at identificere små molekyler, der bevarer de funktioner og interaktioner af aminosyrerne, der er substitueret.
- Validering af LigandFit docking-protokol 14
Bemærk: I tidligere undersøgelser, docking-metoden (LigandFit 15, et modul i molekylær modellering program suite, Discovery Studio 3.0) blev valideret for at sikre, at denne algoritme er tilstrækkeligt til at gengive bindende former for kendte Ncaps og vise, at de opnåede resultater for ukendte forbindelser er prædiktive 14.
- Brug følgende trin (1,2 - 1,5), identificere optimale parametre for LigandFit som følger: PLP1 daEnergy nettet for udgøre generation, minimering af genererede rejser og PLP1 scoring funktionen til analyse af rejser.
- For at begrænse de konformationer opnået, og at positionere ligander passende til kovalent bindingsdannelse i udjævnede peptid, indstille indolnitrogenet og amid nitrogenatomerne i Trp217 og Gln254 henholdsvis interaktion filtre til hydrogenbinding.
- Design og dock et bibliotek af fragment alternativer i CDK2 / cyclin A receptoren (2UUE). Prioriter potentielle capping grupper for syntese og kommercielle sourcing baseret på PLP1 scoring, interaktioner med interaktion filtre og komplementaritet med CBG. De forskellige trin, der kræves for LigandFit docking er som følger.
- Fremstilling af receptor bindingssted 14
- Importere CDK2 / cyclin A krystalstruktur (PDB ID: 2UUE) i en visualisering vindue i softwaren. Denne struktur indeholder den tidligere konstaterede FLIP 5-methyl-1-phenyl-1 H-1, 2,4-triazol-3-carboxamido (3,5-DCPT) RLIF bundet til cyclin rillen (figur 3).
- Slet eller holde på plads resterne RLIF (C-terminalen). Når peptidsekvensen bibeholdes, anvender den N-terminale aminogruppe af peptidet som en interaktion filter for liganden. Fra "receptor-ligand interaktioner" værktøjer, oprette en kugle omkring N-cap 3,5-DCPT fra Vis / Skjul websted sfære. Kuglen er skabt til at definere det aktive område i bindingsstedet, hvor ligand-receptor-interaktioner er tilladt at forekomme under binding.
- Definer bindingssted længere fra "find websted som mængden af udvalgte ligand" og slette liganden 3,5-DCPT fra proteinet. Udfør dette trin for at definere mængden af binding inden for rammerne skabt.
- Indstil indolnitrogenet og amid nitrogenatomer af resterne Trp217 og Gln254 som interaktion filtre til hydrogenbinding. Indstil interaktion filtre, således at kun de rejser, der inteRACT med atomer sæt rester vil blive filtreret under docking proces derfor bevare vigtige interaktioner i de forankret udgør.
- Fremstilling af ligander 14
- Design et bibliotek med 100 potentielle capping grupper baseret på kriterier, herunder molekylvægt på mindre end 500, tilstedeværelsen af en carboxylatgruppe til ligering med den trunkerede peptid og inddragelse af relevante hydrofobe grupper (substitueret phenylgruppe) for van der Waals vekselvirkning i den sekundære lomme som vist i tabel 1.
- Vælg heterocykliske ringe til at efterligne peptid hydrogenbindende interaktioner med Trp217 og substituenter inkluderet for at erstatte ionparrende interaktioner af basiske sidekæder af HAKRRLIF. Forankre liganderne som de respektive aldehyd molekyler således at carbonyloxygen kan interagere med amid nitrogenatomet i Gln254 ligner peptidrygrad i det oprindelige peptid (tabel 1).
- Forud for dockonge, minimere designet ligander til et lavt energiforbrug kropsbygning og forberede sig på en passende ionisering tilstand ved hjælp af "Forbered ligander" protokol. Tegn og eksportere disse potentielle N hætter i .sdf filformatet i ChemDraw til et regneark, før de importeres til softwaren.
Bemærk: Forbered ligander protokol bruges til at minimere alle de ligander, der skal kobles til deres laveste energitilstande og ionisering afgifterne blev anvendt på de gældende atomer. Standardparametre anvendes til dette trin.
- Docking af liganderne i cyklin A Groove 14
- Vælg LigandFit rutine fra receptor-ligand interaktioner protokol sæt af softwaren. Brug receptoren og den forberedte ligander som input til denne protokol.
- For disse kørsler vælge PLP1 som energinet, angive, at udgør være energi minimeres, og at antallet af genererede rejser som 10. Lad alle de andre parametre på standardværdierne.
Bemærk: LigandFit eren docking fremgangsmåde, som kan identificere og generere udgør med høj komplementaritet og potentielle affinitet med det aktive sted i et protein under anvendelse af en form baseret sammenligning filter, som er kombineret med en Monte Carlo konformationel søgealgoritme. Energinettet anvendes af docking program er kraftfeltet til generering af ligand-receptor-interaktioner og potentielle udgør. PLP1 er stykvis lineær potentiale, som specifikt prioriterer brint limning interaktioner, og hvor der er tildelt PLP atom type til hver ikke-hydrogen-ligand atom eller ikke-brint-receptor atom.
- Analyse af resultater
- I første omgang, display udgør i Visualizer programmet og derefter sortere efter faldende værdier af PLP1 score. Brug scoringsfunktioner såsom PLP1 at anslå bindingsaffiniteten af en forankret ligand baseret på en kandidat-ligand udgøre geometri og ikke-kovalent interaktion med mål-receptor struktur.
Bemærk: Her blev PLP1 scoring funktionen fundet til give de bedste resultater, da det indeholder en vurdering af hydrogenbinding. - Analyser visuelt top 25% af de ridsede udgør for 1) superimposability med den kendte udjævningen gruppe (med en relativ gennemsnitlig firkantet afvigelse (RMSD) værdi mindre end 2 Å), 2) opfyldt interaktion filtre og 3) visuel komplementaritet med cyklin rille . Det er accepteret, at en korrekt docket udgøre (sammenlignet med en eksperimentel struktur) har en RMSD værdi på <2 Å.
- Undersøg udgør for visuel komplementaritet, der er defineret som havende en effektiv fyldning af bindingslommen på en måde, der er i overensstemmelse med kendte struktur-aktivitets-relationer. Interaktion filtre er indstillet til at omfatte atom begrænsninger, der kræver intermolekylære kontakter vides at være kritisk for binding og / eller kræves for at placere den potentielle cappinggruppe i den korrekte geometri for amidbindingsdannelse. Tre eksempler på kuperet udgør potentielle N-capping grupper gør hydrogenbindinger med interactioN-filtre er vist i figur 4.
- I første omgang, display udgør i Visualizer programmet og derefter sortere efter faldende værdier af PLP1 score. Brug scoringsfunktioner såsom PLP1 at anslå bindingsaffiniteten af en forankret ligand baseret på en kandidat-ligand udgøre geometri og ikke-kovalent interaktion med mål-receptor struktur.
2. Syntese og karakterisering af potentielle N -capping Grupper
- Syntese af N-capping grupper.
- For syntese, bruge alle kommercielle udgangsmaterialer, opløsningsmidler og reagenser som opnået. Syntetisere potentielle N-capping grupper ved konventionelle syntetisk organisk kemi (figur 5 12,13 for et eksempel).
- Udfør tyndtlagskromatografi (TLC) på silicagel til overvågning af reaktioner.
- Udgangsmaterialet og reaktionsblandingen (1 mg) i den mobile fase opløses og staffage dem på TLC-pladen ved hjælp af kapillarrør.
- Anbring TLC-pladen på kammeret indeholdende mobile fase (ethylacetat og hexan ved en 35:65 forhold). Når den mobile fase når 90% af TLC-pladen, fjerne og lufttørre pladen.
- Brug UV-lys til at detektere udgangsmaterialet og reaktionsblandinger som synlige pletter. Calculate Rf af alle pletter (forholdet mellem afstanden tilbagelagt af stedet og den mobile fase).
Bemærk: Reaktionen er fuldstændig, når der ikke er stedet ses på Rf af udgangsmateriale.
- Efter afslutning af reaktionen arbejde op reaktionsblandingen ved anbringelse i en skilletragt, og vask med vandig syre eller base opløsning som passende. Saml det organiske opløsningsmiddel fordamper det i rotationsfordamper og tørres det opnåede råprodukt under vakuum.
- Opløs 500 mg råprodukt i 3-5 ml egnet opløsningsmiddel, og der tilsættes til en 1 g silica eller RP18 Samplet og tør under luft. Placer Samplet indeholdende råproduktet i silica / RP SNAP flash patroner og oprense det rå materiale under anvendelse af automatiseret højtydende flashkromatografi (ifølge producentens protokol) anvendelse af en SNAP 100 g søjle med en gradient løb ud fra 6% ethylacetat: 94 % hexaner til 50% ethylacetat og 50% hexaner end15 søjlevolumener.
- Tør det rensede produkt opsamlet i opløsningsmiddel fra flashkromatografi under anvendelse af en rotationsfordamper ved afdampning al væsken til tørhed og yderligere tørre produktet under vakuum for at fjerne alle de resterende opløsningsmidler. Udfør karakterisering af det oprensede produkt ved NMR, MS og analytisk HPLC.
- For 1H NMR og 13C NMR, vejer ca. 10 mg af det oprensede prøve, opløses den i et passende deutereret opløsningsmiddel, og indholdet overføres til en tør NMR-rør til optagelse af NMR-spektre 2,14.
- Registrere 1H NMR og 13C NMR-spektre med en høj felt NMR Spectrometer (minimum 300 MHz). Anskaf massespektre ved hjælp af en QTOF (Tandem firedobbelt-1 gang søgning massespektrometer), elektrosprayionisering (ESI), eller en VG 70S (Dobbelt-fokusering magnetisk sektor massespektrometer, El) 2,14.
- Analyser renheden af produkter ved HPLC med en diodearraydetektor og udstyret meden C18 (2) 100 A, 250 x 4,6 mm, 5 um søjle til analyse. Brug en gradient løb startende fra 100% vand (0,1% trifluoreddikesyre) til 60% acetonitril (0,1% trifluoreddikesyre) i løbet af 30 minutter og hold gradient i 4 minutter. Uddrag kromatogrammerne på 226 og 254 nm 2,14.
Bemærk: Analytiske renheder af evaluerede forbindelser var> 95%.
3. fastfasesyntesen til generering af flips 2
- Syntese af N-udjævnede flips
- Saml N-udjævnede peptidforbindelser gennem standard fastfasesyntese metoder ved hjælp af følgende trin.
- Aktiver 5 ækvivalenter af C-terminale aminosyre (Fmoc-Phe) i 4,4 ækvivalenter O -Benzotriazole- N, N, N ', N' N'-uronium-hexafluor-phosphat (HBTU, 221,93 mg) i 2 ml DMF i 5 minutter. Indlæse Fmoc-Phe HBTU blandingen på Rink-harpiks under anvendelse af 6 ækvivalenter af diisopropylethylamin (DIPEA, 103,13mg) i 1 time ved stuetemperatur.
- Fjern Fmoc beskyttelsesgruppen fra C-terminale rest ved anvendelse af 20% piperidin i 3 ml DMF i 10 minutter. Par efterfølgende aminosyrer (f.eks Fmoc-Ile, Fmoc-Leu, Fmoc-Arg-PMC) trinvis. På hvert trin, par 5 ækv af den næste aminosyre under anvendelse af 6 ækvivalenter DIPEA (103,13 mg) og 4,4 ækvivalenter af HBTU (221,93 mg) i 2 ml DMF i 1 time ved stuetemperatur.
- Anvend vaskecyklusser (5 x 10 ml DMF + 5 x 10 ml DCM) efter aminosyrekobling og Fmoc afbeskyttelsestrin beskrevet ovenfor. Efter peptid samles, par N-capping grupper med 6 ækvivalenter DIPEA (103,13 mg) og 4,4 ækvivalenter af HBTU (221,93 mg) i 2 ml DMF i 1 time ved stuetemperatur.
- Ved afslutningen af peptid samles, behandle reaktionsblandingen med 2 ml af spaltningsblandingen (90: 5: 5 TFA / H2O / TIPS) O / N at fjerne sidekædebeskyttende grupper og spalter vipper fra harpiksen. Udriv det resulterende produkt med kold diethylether for at udfælde og jegf nødvendigt koncentrat i en rotationsfordamper.
- Saml N-udjævnede peptidforbindelser gennem standard fastfasesyntese metoder ved hjælp af følgende trin.
- Syntese af N-udjævnede-C-udjævnede flips
- Afvejes og opløses N-terminalt dækket og beskyttet Arg-Leu-peptid (16,1 mg, 0,02 mmol) i dichlormethan, og der tilsættes [4- (3-chlorphenoxy) pyridin-2-yl] methanamin (C-cap) sammen med O - benzotriazole- N, N, N ', N', N'-tetramethyluroniumhexafluorphosphat (HBTU; 16,7 mg, 0,02 mmol) og N, N-diisopropylethylamin (DIPEA, 6,5 mg, 0,02 mmol).
- Rør og overvåge reaktionen ved stuetemperatur, indtil TLC / HPLC angiver fuldstændigt forbrug af udgangsmateriale. Efter afslutning af reaktionen, koncentreres den rå blanding under anvendelse af en rotationsinddamper, og derefter fordeles mellem ethylacetat og vand.
- Adskil det vandige og organiske lag; det organiske lag vaskes med 1 N NaOH, 1 N HCI og saltvand. Tør det organiske lag med ca. 1 g natriumsulfat og koncentreres produktet i rotationsfordamper. Finally behandle produktet O / N med spaltningsblandingen (95: 2,5: 2,5 trifluoreddikesyre / H 2 O / TIPS) til afbeskyttelse.
- Udriv det resulterende produkt med kold diethylether og om nødvendigt koncentrat i rotationsfordamper til fuldstændig tørhed for at fjerne alt opløsningsmiddel. Yderligere tørre produktet under vakuum for at fjerne alle de resterende opløsningsmidler.
- Oprensning og karakterisering af vipper
- Oprens rå flips hjælp semi præparativ omvendt-fase-HPLC-metoder. Lyofilisere de rensede flips og karakterisere deres molekylmasse anvendelse af massespektrometri 2,14.
- Bestem den specifikke renhed af de vipper ved HPLC med en diodearraydetektor og udstyret med en C18 (2) 100 A, 250 x 4,6 mm, 5 um kolonne. Brug en gradient metode startende fra 95% H2O (0,1% trifluoreddikesyre) / 5% acetonitril (0,1% trifluoreddikesyre) til 35% H2O (0,1% trifluoreddikesyre) / 65% acetonitril (0,1% trifluoroacetic syre) i løbet af 30 minutter og hold gradienten i 4 min. Uddrag kromatogrammer på 226 og 254 nm.
4. Fluorescens Polarisering bindingsassay til bestemmelse af kompetitiv binding 2,14
- Udføre analysen i sort 384 brønde (138 ul) plader under anvendelse af den følgende fremgangsmåde.
- Fortynd prøverne, tracer peptider (4 nM), og kinase-komplekser (CDK2 / cyclin A - 18 ug / ml, CDK4 / cyclin D - 37 ug / ml) til passende koncentrationer i assaypuffer (25 mM HEPES pH 7, 10 mM NaCl, 0,01% Nonidet P-40, 1 mM dithiothreitol (DTT).
- Til hver brønd i 384-brønds plade tilsættes: 5 pi CDK4D1 eller CDK2CA (0,3 ug / brønd oprenset rekombinant human kinase kompleks), 5 pi forbindelse opløsning, 5 pi 30 nM sporstof peptid (fluoresceinyl-Ahx-Pro-Val -Lys-Arg-Arg-Leu (3ClPhe) -Gly eller fluoresceinyl-Ahx-Pro-Val-Lys-Arg-Arg-Leu-Phe-Gly sporstof peptid). Brug 5 pi af hver DMSO (6%), buffer, sporstof og 5 pi DMSO (6%), kinase-kompleks, sporstof som kontrolbrønde
- Efter tilsætningen af alle de komponenter, centrifugeres pladen ved 500 rpm i 1 min (41.16 xg) ved stuetemperatur, og derefter inkuberes pladen med omrøring i 45 minutter ved stuetemperatur. Ved hjælp af en multimode pladelæser og detektor udstyret med 485 nm / 535 nm excitation / emission filtre, og et dikroisk spejl læse fluorescein intensiteten af hver brønd i pladen.
- Beregn den relative gennemsnitlige polarisering (MP) for alle de prøver ved hjælp af ligningen viser nedenfor. Bestem IC50 værdier ved logaritmisk regression ved at korrelere relative parlamentsmedlemmer og test koncentrationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Samspillet mellem HAKRRLIF med cyclin rillen er vist i figur 2. De peptidrester, der repræsenterer de vigtigste bindingsdeterminanterne omfatter Ala2, Arg4, Leu6 og pHE8 med andre restprodukter stille mindre bidrag 12,13,18. I dette tilfælde undersøgelse er blevet udnyttet den UDSKIFT strategi for at finde fragment alternativer for rester i den N-terminale tetrapeptid af HAKRRLIF, primært efterligner samspillet mellem Ala2 og Arg4. Et bibliotek af potentielle NCAP fragmenter (tabel 1) blev konstrueret på grundlag af de kriterier. Hvert molekyle blev forankret i forlades bindingssted skabt ved trunkering af N-capping gruppe fra dets krystalstruktur med cyclin A (PDB ID: 2UUE). Potentielle ligand alternativer blev udvalgt på grundlag af pose analyse og PLP1 scoring som en forudsigelse af affinitet (eksempler på kuperet rejser er vist i figur 4). Syntesen af en bekræftet NCAP (1- (3-chlorphenyl) -5-methyl-1H-1,2,4-triazol-3-carboxylsyre) er vist i figur 5, hvor dette molekyle blev dannet i tre trin og oprenset ved automatiseret flashkromatografi (Supplerende figur 1). Den 1HNMR, 13-NMR, MS og HPLC karakterisering data for en repræsentativ forbindelse 1- (3-chlorphenyl) -5-methyl-1H-1,2,4-triazol-3-carboxylsyre er vist i figur 1-5 Supplerende henholdsvis. Syntesen af N-reducerede flips og N-capped-C-reducerede flips er repræsenteret i figur 7 og 8, og karakterisere data er vist i tabel 2. Bindingsaffiniteten for både CDK2 / cyclin A og CDK4 / cyclin D blev bestemt ved anvendelse den beskrevne FP assay og resultaterne er vist i tabel 3. Af de testede forbindelser, vipper indeholdende triazol baseret N-caps blev bestemt til at have den største affinitet for CDK2 / cyclin A og CDK4 / cyclin D og repræsentativ forbindelses blev testet i cellebaserede assays. Som helhed betragtet var FLIP molekyler identificeret sig at være mere stof som, og at den største del af interaktionerne mellem HAKRRLIF octapeptid. Udjævnede tetrapeptider havde lavere styrke sammenlignet med HAKRRLIF men var af sammenlignelig aktivitet til RRLIF pentapeptid (tabel 3 og 4). Disse resultater viser, at de opnåede forbindelser havde forbedret lægemiddel Lighed men dette blev opnået på bekostning af noget kompromitteret bindingsaffinitet.
Den anti-proliferative aktivitet af disse CGI ligander blev evalueret og cellulære IC50'er under 30 pM blev observeret i U2OS og DU145 cancercellelinier.
Figur 1. Oversigt over REPLACE strategi. Venligst cl ick her for et større version af dette tal.
Figur 2. Indbinding og interaktioner af HAKRRLIF i CBG Venstre panel:. Modeled struktur HAKRRLIF bundet til CBG. Cyclin rille består af to hydrofobe lommer - en større primær lomme (højre, besat af Leu6 og pHE8) og en mindre sekundær lomme (venstre, besat af Ala2), og som er forbundet ved hjælp af sure rester afbildet i rødt. Højre panel: Andre vigtige interaktioner inkluderer brint limning kontakter peptidrygraden (med Trp217, Gln254, Ile281), og ionparrende interaktioner af de tre grundlæggende rester af peptid (med Glu220, Glu224, Asp283). Klik her for at se en større version af dette tal.
441 / 52441fig3.jpg "/>
Figur 3. Bindende tilstand af 3,5-DCPTRLIF i CBG. Binding af 3,5-DCPT-RLIF er vist med brint bonding interaktioner (afbildet af grønne stiplede linjer) med sidekæde atomer af Trp217 og Gln254. Klik her for at se et større udgave af dette tal.
Figur 4. Udvalgte docking resultater. Kuperet rejser af 3 repræsentative N-capping grupper er vist. Hver af disse forbindelser gør H-obligationer med interaktion filter atomer af Trp217 og Gln254 og som afbildet af grønne stiplede linjer. Phenylsubstituenten gør van der Waals interaktioner med det sekundære hydrofobe lomme. Klik her for at se en større version af dette tal. 
Figur 5. Syntese af 1- (3-chlorphenyl) -5-methyl-1H-1,2,4-triazol-3-carboxylsyre. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6. Syntese af N-udjævnede vipper ved fastfasesyntesen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7. Syntese af N-capped-C-udjævnede flips. Klik her for at se en større version af dette tal.
Tabel 1. Bibliotek af små molekyler forankret og de deraf forudsigelser af bindingsenergi ved hjælp af PLP1 scoring funktionen.
| Peptid | Renhed | Kolonne Dimensioner | Metode | Strømningshastighed | HPLC retentionstid | Teoretisk MW | Observeret MW |
| 5843 | > 90% | 4,6 × 250 mm | 5-65% acetonitril / vand / 0,1% TFA | 1 ml / min | 23.9 | 732 | 732,6 |
| 5773 | > 90% | 4,6 × 250 mm | 5-65% acetonitril / vand / 0,1% TFA | 1 ml / min | 22.4 | 801,77 | 800,55 |
| 5774 | > 90% | 4,6 × 250 mm | 5-65% acetonitril / vand / 0,1% TFA | 1 ml / min | 24.2 | 767,33 | 766,5 |
| 5762 | > 90% | 4,6 × 250 mm | 5-65% acetonitril / vand / 0,1% TFA | 1 ml / min | 9,0 | 731,91 | 731,65 |
| 5763 | > 90% | 4,6 × 250 mm | 5-65% acetonitril / vand / 0,1% TFA | 1 ml / min | 11.2 | 800,8 | 799,5 |
| 5764 | > 90% | 4,6 × 250 mm | 5-65% acetonitril / vand / 0,1% TFA | 1 ml / min | 10.1 | 766,34 | 765,55 |
| 5771 | > 90% | 4,6 × 250 mm | 5-65% acetonitril / vand / 0,1% TFA | 1 ml / min | 9.4 | 749,9 | 749,6 |
| 5765 | > 90% | 4,6 × 250 mm | 5-65% acetonitril / vand / 0,1% TFA | 1 ml / min | 10.1 | 766,35 | 755,65 |
| 5766 | > 90% | 4,6 × 250 mm | 5-65% acetonitril / vand / 0,1% TFA | 1 ml / min | 9.4 | 761,9 | 761,55 |
| 5767 | > 90% | 4,6 × 250 mm | 5-65% acetonitril / vand / 0,1% TFA | 1 ml / min | 20.4 | 761,9 | 761,55 |
| 5776 | > 75% | 4,6 × 250 mm | 5-65% acetonitril / vand / 0,1% TFA | 1 ml / min | 23.3 | 785,7 | 784,55 |
| 5775 | > 90% | 4,6 × 250 mm | 5-65% acetonitril / vand / 0,1% TFA | 1 ml / min | 9.9 | 751,34 | 750,45 |
Tabel 2. Analytiske data for CGI bindingspeptider og vipper.
Tabel 3. In vitro binding af udvalgte N-udjævnede vipper til CDK2CA og CDK4CD.
Tabel 4. In vitro binding af udvalgte N & C udjævnede vipper til CDK2CA og CDK4CD.
Supplerende Figur 1-5. Oprensning og karakterisering af 1- (3-chlorphenyl) -5-methyl-1H-1,2,4-triazol-3-carboxylsyre.
Supplerende Figur 1. Flash kromatogram af produktet opnået fra trin 1. Der er fire toppe eluerede, hovedtoppen eluerede ved 55% ethylacetat / 45% hexan blev fundet at være det ønskede produkt. Venligst klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende Figur 2. 1HNMR af 1- (3-chlorphenyl) -5-methyl-1H-1,2,4-triazol-3-car dicarboxylsyre. NMR-spektret viser 3 alifatiske methylprotoner og 3 aromatiske protoner. Integrationen for alle de tre toppe er vist nedenfor NMR-spektret. Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende Figur 3. 13CNMR 1- (3-chlorphenyl) -5-methyl-1H-1,2,4-triazol-3-carboxylsyre. Der er ti carbonatomer i strukturen, 13C-NMR med 10 signaler for hver carbon atom. Integrationen for hver top vises under NMR-spektret. Klik her for at se en større version af dette tal.
ig4.jpg "/>
Supplerende Figur 4. MS 1- (3-chlorphenyl) -5-methyl-1H-1,2,4-triazol-3-carboxylsyre. Molekylvægten af forbindelsen er vist som forælder top ved 237. Den aktuelle molekylære vægt af forbindelsen er 237,64. Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende Figur 5. HPLC af 1- (3-chlorphenyl) -5-methyl-1H-1,2,4-triazol-3-carboxylsyre. Renheden af produktet bestemmes som 100% som vist i HPLC-kromatogram. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Computational Chemistry | |||
| Accelyrs Discovery studio 3.0 | |||
| Dell Optiplex Workstations | |||
| Synthetic Organic Chemistry | |||
| Silica gel (GF-254 plates) for TLC, Biotage (Uppsala, Sweden) for flash chromatography, Waters Alliance 2695 HPLC with a 2996 diode-array detector and equipped with a C18 (2) 100 A, 250 x 4.6 mm, 5 μm column (Phenomenox Luna) for purity determination, 1H NMR and 13C NMR spectra were recorded with a Varian Mercury 300 and 400 Spectrometer, respectively. Mass spectra were measured with a Micromass QTOF (Tandem quadruple-1 time of flight mass spectrometer), electrospray ionization (ESI) and VG 70S (Double-focusing magnetic sector mass spectrometer, EI). | |||
| Flourescence Polarization Assay | |||
| 384 micro well plates, Micro pipets | Grenier Bio-one | 110256602 | |
| CDK4D1 and CDK2CA (well purified recombinant human kinase complex) | BPS Bio Sciences | 40094(CDK4/Cyclin D), 41101(CDK2/Cyclin A) | |
| assay buffer (25 nM HEPES pH 7, 10 mM NaCl, 0.01% Nonidet P-40, 1 mM dithiothretiol (DTT)) | |||
| 25 nM HEPES | CALBIOCHEM | 375368 | |
| NaCl | Fisher | 127838 | |
| Nonidet P-40 | US Biological | N3500 | |
| DTT | Aldrich | ||
| -70 °C freezer | Revco (Ultima II) | ||
| DTX880 multimode detector fitted with 485 nm/535 nm excitation/emission filters and a dichroic mirror suitable for fluorescein | Beckman Coulter, Brea, CA | ||
| Cell Culture | |||
| 96 well plates | Fisher | ||
| Frozen stocks of U2OS (osteosarcoma) and DU145 (prostate cancer) cell lines | ATCC | ||
| NU serum, DMEM media, trypsin, PEN/STRIP, MTT reagent | Fisher, Life technology, Alfa Aesar | ||
| Heamocytometer | VWR | ||
| -70 °C freezer | Revco (Ultima II) | ||
| Incubator | Thermo electron corporation | ||
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 R | |
| Refrigerator 4-8 °C | Isotemp Fisher | ||
| DTX880 multimode detector fitted with 595 nm filter | Beckman Coulter, Brea, CA | ||
References
- Andrews, M. J., et al. REPLACE: a strategy for iterative design of cyclin-binding groove inhibitors. Chembiochem. 7, 1909-1915 (2006).
- Liu, S., et al. Optimization of Non-ATP Competitive CDK/Cyclin Groove Inhibitors through REPLACE-Mediated Fragment Assembly. J Med Chem. 56, 1573-1582 (2013).
- McInnes, C. Chapter 29. Annual Reports in Medicinal Chemistry. Bernstein, M., Desai, P. 47, Elsevier. 459-474 (2012).
- Bower, J. F., Pannifer, A. Using fragment-based technologies to target protein-protein interactions. Curr Pharm Des. 18, 4685-4696 (2012).
- Makley, L. N., Gestwicki, J. E. Expanding the number of 'druggable' targets: non-enzymes and protein-protein interactions. Chemical biology, and drug design. 81, 22-32 (2013).
- Walensky, L. D., Bird, G. H. Hydrocarbon-Stapled Peptides: Principles, Practice, and Progress. J Med Chem. , (2014).
- Shapiro, G. I. Cyclin-dependent kinase pathways as targets for cancer treatment. J Clin Oncol. 24, 1770-1783 (2006).
- Thais, M., Sielecki, J. F. B., Enfield, P. A., Trainor, G. l Cyclin dependant kinase inhibitors: Useful targets in cell cycle regulation. Journal of medicinal chemistry. 43, 1-18 (2000).
- Morphy, R. Selectively nonselective kinase inhibition: striking the right balance. J Med Chem. 53, 1413-1437 (2010).
- Chen, Y. N., et al. Selective killing of transformed cells by cyclin/cyclin-dependent kinase 2 antagonists. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 4325-4329 (1999).
- Orzaez, M., Gortat, A., Mondragon, L., Bachs, O., Perez-Paya, E.
- Kontopidis, G., et al. Insights into cyclin groove recognition: complex crystal structures and inhibitor design through ligand exchange. Structure. 11, 1537-1546 (2003).
- McInnes, C., Andrews, M. J., Zheleva, D. I., Lane, D. P., Fischer, P. M. Peptidomimetic design of CDK inhibitors targeting the recruitment site of the cyclin subunit. Current medicinal chemistry. Anti-cancer agents. 3, 57-69 (2003).
- Premnath, P. N., et al. Fragment based discovery of arginine isosteres through REPLACE: towards non-ATP competitive CDK inhibitors. Bioorganic, and medicinal. 22, 616-622 (2014).
- Venkatachalam, C. M., Jiang, X., Oldfield, T., Waldman, M. LigandFit: a novel method for the shape-directed rapid docking of ligands to protein active sites. J Mol Graph Model. 21, 289-307 (2003).
- Mendoza, N., et al. Selective cyclin-dependent kinase 2/cyclin A antagonists that differ from ATP site inhibitors block tumor growth. Cancer Res. 63, 1020-1024 (2003).
- Denizot, F., Lang, R. Rapid colorimetric assay for cell growth and survival. Modifications to the tetrazolium dye procedure giving improved sensitivity and reliability. J Immunol Methods. 89, 271-277 (1986).
- Zheleva, D. I., et al. Highly potent p21(WAF1)-derived peptide inhibitors of CDK-mediated pRb phosphorylation: delineation and structural insight into their interactions with cyclin A. The journal of peptide research : official journal of the American Peptide Society. 60, 257-270 (2002).
- Ivanov, A. A., Khuri, K. F. R., Fu, H. Targeting protein-protein interactions as an anticancer strategy. Trends in Pharmacological Sciences. 34, (2013).
- Thayer, A. M.
- Yin, H., Hamilton, A. D. Strategies for targeting protein-protein interactions with synthetic agents. Angew Chem Int Ed Engl. 44, 4130-4163 (2005).
- Jubb, H., Higueruelo, A. P., Winter, A., Blundell, T. L. Structural biology and drug discovery for protein-protein interactions. Trends Pharmacol Sci. 33, 241-248 (2012).
- Cannon, J. B. Pharmaceutics and drug delivery aspects of heme and porphyrin therapy. J Pharm Sci. 82, 435-446 (1993).
