Introduction
Äggstockscancer är den mest dödliga gynekologisk malignitet i USA med den största orsaken till sjuklighet och dödlighet är de mycket återkommande, kemoterapiresistent funktioner i denna sjukdom. Primär behandling består ofta svårast cytoreduktiv kirurgi och efterföljande platinabaserad terapi, även om det finns vissa tecken som tyder på neoadjuvant terapi kan vara till nytta i vissa fall en. Majoriteten av patienterna svarar positivt på primär behandling, men tyvärr hälften kommer återfall inom 18 månader 2.
De flesta äggstocks maligniteter är epiteliala karcinom och kan ha sitt ursprung i ytan epitel i äggstockarna eller äggledaren 3,4. Flera studier stödja förekomsten av somatiska stamceller i det kvinnliga reproduktiva systemet som förmodligen hjälpa till vävnadsreparation som behövs efter ägglossningen 5,6. Den höga proliferativ aktivitet vid både äggstocken och äggledaren under ovulation kan vara en viktig faktor i utvecklingen av äggstockscancer (Gharwan, et al. manuskript inlämnat). Härledningen av tumörbildande celler är oklar, men de kan uppstå från normala stamceller, progenitorceller, eller differentierade celler genom mutationer som gör dem oförmögna att reglera division eller ödet. Dessa celler har också benämnts "cancerstamceller," eller "cancer-initierande celler", och kan växa in tumörogena, flercelliga sfäroider under låga anslutningsvillkor. Även om den hierarkiska modellen för TIC utveckling kan vara dynamisk, gör TIC delar många av samma funktioner som vanliga stamceller inklusive inaktivitet, resistens mot kemoterapi, långsiktiga självförnyelse och förmåga att differentiera till olika cell härstamningar 7,8.
Flera studier stödja förekomsten av TIC i äggstockscancer och nuvarande insatser pågår för att klargöra mekanismen (s) med vilken dessa celler stöder tumorigenes 9-11. Flera markörer har föreslagits för att identifiera äggstocks TIC med förbättrad tumorigenicitet inklusive CD133, ALDH1A1, CD117, CD44, och MyD88, även om den exakta bidraget från varje markör är oklar och kan vara celltyp specifik 11-16. Medan en universell markör eller en uppsättning markörer har inte entydigt fastställts för äggstocks TIC, har olika grupper isolerade äggstock TIC oftare genom att välja för CD44 +, CD133 + och / eller celler med hög aldehyddehydrogenas (ALDH) aktivitet 13,17-21. CD44 är ett transmembrant glykoprotein som fungerar som en receptor för hyaluronsyra och reglerar flera processer som är viktiga för tumörprogression, inklusive adhesion, proliferation, migrering, angiogenes och differentiering 22. CD133 är en transmembranglykoprotein vars funktion är fortfarande oklart, men studier tyder det organiserar plasmamembranet topologi 23. ALDH, en intracellulär enzym som katalyserar oxidationen av aldehyder, kan vara den mest universal markör för TIC som hög aktivitet har identifierats i stamceller isolerade från en mängd olika vävnader och flera roller har tillskrivits ALDH stödja normala stamceller och TIC 24. Från och med nu, CD133 och ALDH1 verkar vara de mest reproducerbara markörer för äggstocks TIC 13,21.
Förutom att förstå egenskaperna hos TIC, det finns också en stor insats för att identifiera läkemedel som specifikt riktar denna subpopulation. Den höga återfallsfrekvens i samband med äggstockscancer kan bero på fel i nuvarande kemoterapi att framgångsrikt utrota TIC. Fastän huvuddelen av tumören är känslig för existerande terapier, är TIC tros vara resistent och vid en densitet odetekterbar genom standardmetoder. Belysa mekanismer för terapiresistens och tumör återfall är avgörande för att förbättra svar och den totala överlevnaden hos patienter med äggstockscancer.
Här är odlingstekniker beskrivs thpå anrika TIC från etablerade och primära äggstockscancer cellinjer. De odlingsbetingelser som beskrivs häri har använts av flera grupper för att inducera förökning av tics eller sfäroida celler med stamcells kvaliteter 11,12,14,16,20. Även om det finns flera stam cellodlingsmedier och kosttillskott som vanligen används för att berika TIC / sfäroider vi använde ett serumfritt medium formel med EGF och FGF, men utan tillsats av B27 eller N-2-tillskott. Dessa tillägg, som vanligen används för neuronal cellodling och berikande för stamceller, har visat sig främja en mesenkymala fenotyp 25,26 och det återstår en viss osäkerhet när det gäller huruvida TIC har en mesenkymala eller epiteliala fenotyp är mer tumörogen 27-29 . För att minimera osäkerheter och variabler vi valt att använda det vanligaste formel, eftersom vi har att göra med äggstockscancerceller.
Underhålla celler i serumfritt medium i en låg fäst kolvunderlättar sfäroid formation och stöder spridning av celler med CD133 uttryck och hög ALDH aktivitet. Vårt arbete har vidare visat att celler flytande under normala vidhäftande förhållanden också kan representera en mer tumörframkallande TIC befolkningen. Injektion av celler odlade under dessa förhållanden i atymiska nakna möss leder till högre tumörogen potential jämfört med celler odlade i bifogade betingelser i närvaro av serum. Mycket information om vilken roll TIC i äggstockscancer initiering, progression, terapeutiskt svar, och återfall kan vinnas genom användning av dessa tekniker.
Protocol
1. Traditionell kultur av äggstockscancer cellinjer (Adherenta Villkor)
OBS: All hantering av celler och media bör ske i en steril vävnadsodling huva
- Förbered traditionella cellodlingsmedia. Använd 1: 1 DMEM: F12 (+ L-glutamin, + 15 mM HEPES) och komplettera med 10% värmeinaktiverat fetalt bovint serum och 1% penicillin / streptomycin. Filter lösning med användning av 0,45 ^ m vakuumfilter.
- Förbered en traditionell polystyren 75cm 2 vävnadskultur kolv märkt med namn, datum, och passage antal celllinje interest.Remove flaskan av celler från ultralåg frysen eller flytande kväve. Upptining genom att placeras i 37 ° C vattenbad i 5 min.
- Transfer avstängning från flaskan i en 15 ml centrifugrör innehållande 3 ml traditionella cellodlingsmedia (framställd ovan). Centrifugera suspensionen vid 4 ° C under 5 min vid 400 x g. Samtidigt lägger 16 ml traditionella cellodlingsmedia till kolv.
- Sug ut supernatant. Med 2 ml traditionella cellodlingsmedia pipet celler upp och ner för att lossa pellets och överföring fjädring till kolv. Försiktigt berg kolv för att jämnt fördela cells.Place kolv i fuktad cellodling inkubator inställd på 37 ° C och 5% CO2. Övervaka celler dagligen fram 80% sammanflödet uppnås.
- När cellerna är 80% konfluenta dela kulturen 1: 2 i cellkultur huva. Aspirera supernatanten och tvätta med varm fosfatbuffrad saltlösning (utan kalcium och magnesium) (PBS). Lägg 1,5 ml trypsin 0,25% EDTA och inkubera 3-5 min vid RT.
- Förbered två nya polystyren 75cm 2 kolvar och till 16 ml traditionella cellodlingsmedia till varje kolv. Resuspendera trypsinerade cellerna i 4 ml traditionella cellodlings media och delprov lika stora volymer till var och en av de nya kolvar.
- Placera kolvarna i befuktad cellodling inkubator inställd på 37 ° C och 5% CO2. Övervaka celler dagligen fram 80% sammanflödet uppnås. Fortsätt att dela celler ochkultur eller frysa och lagra vid -80 eller i flytande kväve.
2. Generering av flercelliga Sfäroider från Ovarian cancercellinjer Använda Flytande eller angränsande celler
OBS: All hantering av celler och media bör ske i en steril vävnadsodling huva. Efter odling cellinjer enligt traditionella odlingsmetoder för 2-3 passager (avsnitt 1) fortsätta med följande steg.
- Förbered stamcellsmedier. Använd 1: 1 DMEM: F12 (+ L-glutamin, + 15 mM HEPES) och komplettera med 1% penicillin / streptomycin (till en slutlig koncentration av 100 U / ml penicillin och 100 pg / ml streptomycin), 1% knockout serum ersättare , 0,4% bovint serumalbumin och 0,1% insulin-transferrin-selen. Filter lösning med användning av 0,45 ^ m vakuumfilter.
- Supplement stamcellsmedier med human rekombinant epidermal tillväxtfaktor (EGF) och humant rekombinant grundläggande fibroblasttillväxtfaktor (FGF) för en slutlig koncentration av 20 ng / ml och 10 ng / ml, respektive.
OBS: Tillväxtfaktorer bör läggas färska till stamcellsmedier just före användning. - Skapa floater TIC kultur. Ta bort kolv med 80% sammanflytande celler odlade i traditionella vidhäftande odlingsbetingelser. Samla media och alla flytande celler (enkel och aggregat), lämnar vidhäftande befolkningen bakom, och överföra till 50 ml polypropylen centrifugrör. Centrifugera suspensionen vid 4 ° C under 5 min vid 400 x g.
OBS: Flytande celler och aggregat är uppenbara 24-72 timmar efter anhängare celler är fästa kolven under traditionell kultur. Från en 80% sammanflytande platt hämtning av ungefär 1,0 - 5,0 x 10 5 viabla flytande celler kan förväntas, beroende på cellinjen. I denna studie det genomsnittliga antalet flytande celler uppsamlade från en 80% konfluenta vidhäftande kulturen var: 5,0 x 10 5 för ACI-23, 4,8 x 10 5 för OVCAR5, 3,5 x 10 5 för CAOV3, och 1,0 x 10 5 för TGS- 3. Vid överlåtelse, multicellular sfäroid bildning i traditionell och floater TIC kulturen sker inom några dagar, även om detta är något cellinje-beroende. Till exempel, ACI-23 celler bildar aggregat lättare än CAOV3 celler. - Samtidigt förbereder en ultralåg fästyta polystyren 75 cm 2 vävnadskultur kolv märkt med namn, datum, och passage antal cellinje. Tillsätt 10 ml stamcells media kompletterade med tillväxtfaktorer till kolven.
- När centrifuge är kompletta, aspirera media och överföring pellets till låg fäst kolv genom att lägga 6 ml stamcellsmedier och pipettera upp och ner för att lossa pellets. Placera kolvarna i befuktad cellodling inkubator inställd på 37 ° C och 5% CO2. Övervaka celler var 2 - 3 dygn för att observera sfäroid formation.
- Skapa traditionell TIC kultur. Ta bort kolv med 80% sammanflytande celler odlade i traditionella vidhäftande odlingsbetingelser. Aspirera media och tvätta med varmt PBS. Lägg 1,5 ml trypsin 0,25% EDTA och inkubera 3-5min vid RT.
- Förbered en ultralåg fästyta polystyren 75 cm 2 vävnadskultur kolv märkt med namn, datum, och passage antal cellinje. Tillsätt 10 ml stamcellsmedier, kompletterade med EGF och FGF, såsom beskrivits, till kolven.
- Lägg 6 ml stamcellmedia till kolven med trypsin. Pipettera cellösning upp och ner och försök att lossa cellerna från kolven ytan. Överför hela volymen av celler till ultralåg fäst kolv innehållande 10 ml stamcellsmedier. Placera kolven i fuktad cellodling inkubator inställd på 37 ° C och 5% CO2.
- Supplement TIC kulturer varje 48-72 h med ytterligare 2 ml stamcellsmedier och färsk EGF och FGF för slutliga koncentrationer av 20 ng / ml och 10 ng / ml, respektive.
- Övervaka celler tills 60-80% sammanflödet uppnås. Split kulturer genom att placera lika stora volymer i 2 nya ultra låg fäst kolvar och lägga färska stamcellsmedier för att uppnå en slutlig volym på 18 ml. Alternativaly, centrifugera Hela suspensionen vid 4 ° C under 5 min vid 400 x g. Resuspendera cellerna i stamcellsmedier kompletterat med EGF och FGF och distribuera jämnt i nya ultralåga fäst kolvar. Celler behöver inte skiljas in enkelcellsuspensioner för passage.
OBS: Vid denna punkt kulturerna kan fortsätta att delas och odlas, frysta, eller experimentellt manipuleras för analys. Vid 60-80% konfluens följande koncentrationer av celler hämtas för ACI-23: 8,0 x 10 6 för traditionell Vidhäftande, 4,0 x 10 6 för traditionell TIC, och 5,0 x 10 6 för Floater TIC kulturer. Även om det kan vara cellinje beroende, har vi funnit att 5 - 10 dagar i kultur är optimal för TIC anrikning som andelen CD133 + ALDH + celler är låg inom de tre första dagarna, toppar på 5 - 10 dagar, och minskar igen vid 14 dagar.
3. Generering av primär äggstockscancer cellinjer och flercelliga Sfäroiderfrån kemoresistenta Patient Ascites
OBS: Institutional Review Board godkännande erhölls för detta protokoll. All hantering av celler och media bör ske i en steril vävnadsodling huva.
- Plate ascitesvätska 1: 1 med traditionella cellodlingsmedier. Förbered media som beskrivs i avsnitt 1 och tillsätt 10 ml till flera traditionella polystyren 75 cm 2 vävnadsodlingsflaskor.
- Ascitesvätska ges oftast i 1 L steril vakuumflaskor; ta bort vakuumlock. Försiktigt 10 ml ascitesvätska till kolv innehållande 10 ml traditionella medier och placera i fuktad cellodling inkubator inställd på 37 ° C och 5% CO2. Lämna ostört för 72-96 timmar, innan du gör en komplett medieförändring. Ändra media varje 2 - 3 dygn tills cellerna når 60-80% sammanflödet
- När cellerna når 60-80% sammanflödet, split 1: 2 som beskrivs i avsnitt 1. Starta TIC kulturer som beskrivs i avsnitt 2.
OBS: Erytrocyter som finns i ascites tas bort efter den första mediaändring eftersom de är icke vidhäftande. Eventuella fibroblaster närvarande kommer att tas bort i stort sett efter behandling med trypsin eftersom de är mer känsliga och kommer att lyfta med minimal exponering för trypsin. Renhet av ovariala cancerceller bestämdes genom flödescytometrianalys med användning av antikropp för CA-125 (MUC16).
4. Färgning av celler för flödescytometri Bekräftelse av TIC Markers
- Samla TIC kulturer. Överför innehållet i kolv i 50 ml polypropylen centrifugrör. Centrifug suspensioner för 5 min vid 400 x g. Aspirera media och tvätta med varmt PBS. Tillsätt 2 ml icke-enzymatisk cell dissociationslösning, inkubera 3-5 min vid 37 ° C, och pipettera upp och ner för att bryta upp klumpar och sönderfalla i enskilda celler. Tillsätt 4 ml stamcellsmedier.
- Samla adherenta kulturer. Aspirera media och tvätta med varmt PBS. Lägg 3 ml icke-enzymatisk cell dissociationslösning och inkubera 3-5 min vid 37 ° C. Lägg 3 ml traditionella cellodlingsmedia och pipettera upp och ner flera gånger för att lossa cellerna från kolv och samla in centrifugrör.
- Centrifugera både TIC och vidhäftande suspensioner för 5 min vid 400 x g. Kassera supernatanten och återsuspendera varje pellet i 1 ml PBS innehållande 3% fetalt bovint serum. Inkubera vid RT 30 min. Under tiden, räkna antalet viabla celler med användning av trypanblått. Beakta celler under mikroskop för att bekräfta sfäroider dissocieras till enskilda celler.
- Etikett 5 x 1,5 ml Eppendorf-rör för vardera av följande odlingsbetingelser: 1) Obehandlat (ofärgade kontroll om ersättning), 2) ALDH (enda fläck positiva kontroll om ersättning), 3) CD133 (enda fläck positiva kontroll om ersättning), 4 ) ALDH + CD133 (experimentellt prov), och 5) DEAB + ALDH (negativa kontroller för bakgrundsfluorescens i FL-1 och FL-4 kanaler, respektive).
- Fördela cirka 5 x 10 5 celler vardera till rör # 1 - 4. Centrifugera suspensioner i 5 min vid 400 x g. Aspirera supernatant och resuspendera pellets i 500 l Aldefluor analysbuffert. Lägg 10 pl DEAB (ALDH hämmare) till röret # 5 för experimentell negativ kontroll.
- Tillsätt 5 pl aktiverade Aldefluor reagens till röret # 2 för ersättning positiv kontroll och snärt för att blanda. Tillsätt 5 pl aktiverade Aldefluor reagens till röret # 4 för experimentell analys. Flick röret för att blanda och omgående överlåta halva volymen av celler från rör # 4 i röret # 5 (250 pl) som innehåller DEAB.
- Flick rör för att blanda väl. Inkubera alla rör för 30 - 45 minuter vid 37 ° C skyddade från ljus. Flick rör halva inkubationstiden som celler kommer sjunka till botten. Centrifugera alla rören under 5 min vid 400 x g. Aspirera supernatanten och återsuspendera celler i 500 l Aldefluor analysbuffert.
- För rör med CD133 färgning (# 3 och # 4), lägg CD133-APC 01:11 direkt in Aldefluor analysbuffert. Inkubera 15 minuter på is skyddas från ljus. Centrifugera CD133 rör för 5 min vid 400 x g. Tvätta en gång med500 | il Aldefluor analysbuffert. Resuspendera cellerna i 500 | il Aldefluor analysbuffert, respektive.
- Filter suspensioner i individuella polystyren rundbottnade rör med cell sil lock. Se till att hela volymen filtreras genom locket.
- Utnyttja en flödescytometer för att analysera cellpopulationen. Använd rör # 1-3 för att ställa kontroller ersättning. Använda framåt och sido scatter parametrar, gate cellerna, att se att utesluta cellrester. Upprätta ALDH + och CD133 + dubbla celler genom att använda FL-1 och FL-4 kanaler, respektive.
- Med hjälp av en cytometrisk analysprogram, bekräfta odlingsbetingelser förbättras andelen TIC celler som de TIC rika kulturer bör ha högre färgning för dessa två markörer.
OBS: Förutom CD133 och ALDH, andra markersof äggstockscancer TIC kan analyseras med antalet markörer som används i någon prov beroende på kapaciteten hos flödescytometer.
5. In vivo
OBS: Institutional Review Board godkännande erhölls för detta protokoll. Fördela athymiska kvinnliga nakna möss 6 - 8 veckors ålder i experimentella grupper i burar av 3 och låt acklimatisera sig under några dagar före injektioner. Följ möss under humana experimentella riktlinjer per NIH Djurvård och användning kommittén; övervaka kroppsvikt, utseende inklusive viktminskning eller vinna mer än 20%, utmärglade utseende, diarré eller dermatit och avliva möss passar dessa kriterier från CO 2 kvävning.
- Samla kulturer som beskrivs i avsnitt 2. Resuspendera varje cell befolkningen i 1 ml PBS. Räkna livskraftiga celler med användning av trypanblått-analysen.
- Bered 15 ml centrifugrör. För triplikat åtgärder lägga 1,5 x 10 6 viabla celler utspädda i 2 ml PBS i varje rör (kommer 5 x 10 5 celler i en volym av 0,5 ml tas injicerades subkutant i höger flank på varje mus). Förbered 0,5 ml PBS endast för kontrollmöss.
- Använda 27 G nålar, subcutaneouslyinject 0,5 ml cellsuspension från traditionella vidhäftande kulturer, traditionella TIC kulturer, floater TIC kulturer, eller PBS i den högra flanken av varje 3 möss per grupp. Återgå möss till ursprungliga burar efter injektion.
- Väg möss och mäta eventuella påtagliga tumörer i två dimensioner gånger weeklyby skjutmått, upprättande längd och bredd.
OBS: Tumör latenstid är vanligen 20-50 dagar beroende på cellinje. - Beräkna tumör våt volym genom standardmetoder (V = (bredd) 2 x längd / 2).
OBS: Även om denna studie jämfördes tumorigenicitet av TIC kontra vidhäftande celler för den första generationen endast har in vivo seriepassage av TIC odlas under liknande förhållanden är fullbordade den andra 11,20.
Representative Results
Etablerad äggstockscancercellinjer och en primär ascites cellinje odlas i traditionella vidhäftande odlingsbetingelser i närvaro av serum show fäst, gatsten morfologi, medan samma celler odlade i TIC odlings indikering flytande sfäroid morfologi, vanlig i TIC populationer. Bright bilder som visas i figur 1 A visar tydligt de morfologiska skillnader i odlingsbetingelser. Figur 1B visar de differentierade morfologierna uppnås efter omstryka ACI-23 och TGS-3 TIC kulturer i traditionella vidhäftande förhållanden. Bara 24 timmar efter sådd tillbaka vidhäftande förhållanden, en majoritet av de flercelliga spheroids dissociera och fäster på ytan, som liknar typiska vidhäftande celler.
För att kontrollera att de TIC villkor anrika celler med stamcellsmarkörer flödescytometri analys utfördes med hjälp av två vanliga markörer för äggstocks TIC - CD133 expression och ALDH-aktivitet. Dot tomter som visas i figur 2 A markera ökad andel CD133 + celler i lågt fäste, serumfria förhållanden. Likaså är aktiviteten av ALDH enzymet högre i dessa villkor jämfört med traditionella vidhäftande odlingsbetingelser. Även de traditionella vidhäftande kulturer innehåller CD133 + celler, de procentuella ökningar under förhållanden som förbättrar sfäroid formation. Analys av ett pluripotens markör, TRA-1-60, ger ytterligare stöd som de TIC villkor anrika muskelryckningar, Figur 2 B. Kvantifiering i Figur 2 C visar att dubbelt positiva (CD133 + ALDH +) ACI-23 celler i stort sett begränsade till kulturer som odlats under TIC värdiga förhållanden. Förändringar i proteinnivåer av olika transkriptionella faktorer som förekommer i ACI-23 celler efter fem dagars odling i TIC betingelser undersöktes också. En progressiv ökning i varje av markörens ses från traditionella till floater TIC villkor jämfört med de relativt låga nivåerna i vidhäftande kulturen, Figur 2 D. Intressant en human ascites cellinje odlas i de olika förhållanden visar den högsta markör fenotyp under traditionella TIC förhållanden med liten eller ingen färgning närvarande i flottar TIC förhållanden, Figur 2 E.
Tumorigeniciteten av TIC odlingsbetingelser validerades genom subkutana injektioner av lika många livskraftiga celler som erhållits från samtliga villkor i kohorter av atymiska nakna möss. Figur 3 visar att ACI-23 (A, B) och OVCAR-5 (C) celler från traditionella vidhäftande kulturer var mindre tumörframkallande än de från TIC kulturer. Observera att flottören TIC kulturerna producerade större tumörer i en kortare tid än de traditionella vidhäftande eller traditionella TIC kulturer. Dessa data tyder på att även med en blygsam ökning av äggstock TIC markörer, det finns en dramatisk fenotypisk förändring. Men med andra cellinjer (ej visade) de traditionella TIC kulturerna var mer tumorogen än de traditionella adherenta och floater TIC kulturceller.
Figur 1. Sfäroid utveckling i olika odlingsbetingelser. (A) Inrättad äggstockscancercellinjer (ACI-23, OVCAR-5 och CAOV3) och primära patientgenererade ascites-celler (TGS-3) som har odlats i låga fäst kolvar med serumfritt stamcellsmedier bildar lätt flercelliga sfäroider. Bilder visar traditionella vidhäftande odlingsbetingelser upprätthålla epitelial kullersten morfologi i ACI-23, OVCAR-5, CAOV3 och TGS-3 celler, medan samma celler bildade sfäroider inom 96 timmar i TIC förhållanden. Scale bar 100 | im. (B) Vid 24 tim exponeringtill traditionella vidhäftande odlingsbetingelser, de TIC kultur morfologierna visar en differentierad fenotyp liknar den ursprungliga vidhäftande morfologi. Skala bar 100 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Låg-fäste, serumfria förhållanden anrika celler med TIC markörer. (A) Flödescytometrianalys av ACI-23 celler med användning APC konjugerad CD133 antikropp visar en ökad andel CD133 + celler i låga fäst kolvar med serumfritt stam cellmedier. Flödescytometrianalys med användning Aldefluor analys visar ökad ALDH-aktivitet i celler odlade i låga fäst kolvar med serumfritt stamcellsmedier. CD133 negativa kontrollen innehåller någon antikropp och ALDH negativ controll är det aktiverade substratet i närvaro av ALDH-inhibitor (DEAB). (B) Analys med hjälp FITC konjugerad TRA-1-60 antikropp visar högsta andelen TRA-1-60 + celler i flottören TIC förhållandena i ACI-23 celler. Negativ kontroll innehåller inga antikroppar. (C) CD133 + ALDH + celler är högst i traditionella TIC och floater TIC förhållanden i ACI-23 cellinje. Felstaplar: SEM, N = 6, * p <0,05. (D) Western blot-analys som visar ökning av proteinnivåer av transkription markörer av stamceller i ACI-23 celler odlade i TIC förhållanden för 5 dagar. Hela cellysat (50 ug) analyserades med GAPDH som en laddningskontroll. (E) Representativa dot tomter på TGS-3 primära ascites celler som analyserats som i A. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Låg-fastsättning, serumfria betingelser anrika för celler med ökad tumorigenicitet. (A) 5 x 10 5 viabla ACI-23-celler injicerades subkutant i atymiska nakna möss i triplikat. Mössen vägdes och tumörerna mättes med skjutmått två gånger per vecka. A = traditionell anhängare kultur, F = Rörlig TIC kultur, S = Traditionell TIC kulturen. * P <0,05. (B) Representativa bilder av tumörer bildade från ACI-23 efter 25 dagar med hjälp av celler som odlas under olika odlingsbetingelser. (C) 5 x 10 5 livskraftiga OVCAR-5 celler subkutant i atymiska nakna möss i tre exemplar och övervakas som i A. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Protokollet som beskrivs här utgör ett effektivt och konsekvent metod för anrikning kulturer i celler med stamcells funktioner från etablerade äggstockscancercellinjer och gäller primära patientprover. Denna metod framgångsrikt berikar för TIC inom en rad cellinjer. Det gör för att i tid identifiera förutsättningar som berikar en TIC och / eller tumörogen fenotyp, utan att ta tid att fysiskt sortera tics från icke-TIC inom befolkningen. På detta sätt kan relativa nivåer av olika signalvägar bedömas för deras bidrag till TIC fenotypen genom att jämföra traditionella vidhäftande kulturer att tic kulturer med hjälp av olika funktionella analyser. Om en ren TIC befolkning önskas, kan isoleringen lätt uppnås genom att införliva en fluorescens-assisterad eller magnetisk sortering steg i flödescytometri protokollet.
Det är viktigt att ha i åtanke är dock att uttrycket av TIC markörs, såsom CD133, CD44, eller ALDH, kan variera mellan cellinjer eller patientprover även av samma tumörtyp. Exempelvis fann vi att de OVCAR-5-celler har högre uttryck av CD44 i förhållande till CD133, medan det omvända är sant för ACI-23. Det är därför relevant att åberopa tumörinitiering hos möss och flödescytometri analys som definitiv i TIC närvaro. Efter detta protokoll, var hög ALDH aktivitet konsekvent observerats när äggstockscancerceller odlades i stamcellsförhållanden. Intressant är CD133 uttryck genomgående högre i ACI-23 celler som odlas i traditionella TIC odlingsbetingelser, medan ALDH är högst i flottar TIC förhållanden. Däremot de TGS-3 primära ascites celler visar en liten ökning av CD133 positivitet i flottar TIC förhållanden, men en anmärkningsvärd ökning av ALDH verksamhet enligt traditionella TIC förhållanden. Dessa fynd belysa heterogenitet äggstockscancerceller och plasticitet som vanligen förknippas med TIC. För att ytterligare stödja claim att dessa metoder förbättrar muskelryckningar, anrikning av TRA-1-60 positiva celler observerades också. TRA-1-60 är en pluripotens markör och har använts för att identifiera embryonala karcinom i äggstocken och testiklar samt prostatacancer TICS 30-32. Även våra metoder har varit framgångsrika med många cellinjer, är det möjligt att standard TIC förhållanden kan vara bättre lämpade för vissa äggstockscancerceller, medan de modifierade floater förhållandena bättre anrika TIC i andra äggstockscancer cellpopulationer. Detta understryker återigen den förväntade heterogeniteten inom både patient härledda och etablerade äggstockscancer cellinjer.
Förutom cellytmarkörer finns det flera transkriptionsfaktorer som har visat att karakterisera äggstockscancer TIC inklusive Nanog, Sox2, Oct-4 11, även om dessa markörer är inte specifika för äggstockscancer tics och snarare utgör faktorer som är viktiga för embryonala stamceller pluripotens och difpassad 33,34. Vi undersökte förändringar i proteinnivåer av dessa faktorer och fann att nanog nivåerna ökar i TIC odlingsbetingelser, i samförstånd med andra 13,35 samt CD133, TRA-1-60, och CD117. En mänskliga stamceller markör cDNA array visade vidare en ökning av CD133, nanog, Melk och PODXL gener i TIC villkor jämfört med traditionella vidhäftande förhållanden. Viktigt bör det noteras att, såsom med cellytmarkörer, kan transkriptions faktorer associerade med äggstocks TIC variera mellan cellinjer och patientprover.
Vi har observerat att cellerna kan vara mer tumörogen och uttrycka högre nivåer av markörer stamceller om de är till sin natur icke-vidhäftande in vitro (dvs flytande celler som inte lätt fäster en vidhäftande platta). I kultur, cellinjer såsom ACI-23 har typiskt många livsdugliga flytande celler och / eller celler som växer vertikalt i en stapling sätt under traditionell kultur conditjoner. Även framgångsrika anrikning av TIC från flytande celler och aggregat kan vara tillämpliga på relativt få cellinjer inklusive de i denna studie och OVCAR-3 12, föreslår våra resultat kan detta utgöra en mer tumörogen befolkning. Därför, skörd av "flytande" population av celler odlade i standardvävnadsodlingsplattor och media kan tjäna som en alternativ metod för TIC anrikning, för celler som anpassar dåligt på kommersiell stamcellsmedier.
Användning av de olika odlingsmetoder som presenteras i detta manuskript kommer att möjliggöra snabb anrikning av TIC befolkningar och en bättre förståelse för vilka faktorer stödja denna fenotyp i olika celler. Aktuella tillämpningar av denna metod är bland annat kännetecknande som signalvägar är viktigt att stödja spridning av denna unika population av celler. Resultat från dessa studier kommer att bidra till att klargöra mekanismerna för tumörprogression och återfall.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 75 cm2 Ultra - Low Attachment Flask | Corning | 3814 | |
| 75 cm2 Tissue Culture Flask | Sarstedt | 83.1813.002 | |
| Aldefluor Kit | Stemcell Technologies | 1700 | |
| CD133-APC | Miltenyi Biotec Inc. | 130-090-826 | |
| Fibroblast Growth Factor - Basic human recombinant | Sigma-Aldrich | F0291 | Prepared according to manufacturer's instructions |
| Epidermal Growth Factor - human recombinant | Sigma-Aldrich | E9644 | Prepared by Dissolving 0.2 mg with 1 ml sterile PBS |
| DMEM:F12 (+L-glutamine, +5 mM HEPES) | Gibco | 11330-032 | |
| 1x Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (without calcium and magnesium) | Corning cellgro | 21-031-CV | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco | 25200-056 | |
| Cellstripper Non-enzymatic Cell Dissociation Solution | Corning Cellgro | 25-056-CI | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418-10G | |
| Insulin-Transferrin-Selenium | Gibco | 51500-056 | |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828010 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Fetal Bovine Serum (heat inactivated) | Gemini | 100-106 | |
| Rapid-Flow Sterile Dsiposable Filter Units with CN Membrane (0.45 μm) | Nalgene | 450-0045 | |
| 15 ml Sterile Polypropylene Centrifuge Tube | Corning | 430052 | |
| 50 ml Sterile Polypropylene Conical Tube | Falcon | 352098 | |
| Trypan Blue 0.4% solution in 0.85% NaCl | Lonza | 17-942E |
References
- Coleman, R. L., Monk, B. J., Sood, A. K., Herzog, T. J. Latest research and treatment of advanced-stage epithelial ovarian cancer. Nat Rev Clin Oncol. 10, 211-224 (2013).
- Ushijima, K. Treatment for recurrent ovarian cancer-at first relapse. J Oncol. 2010, 497429 (2010).
- Erickson, B. K., Conner, M. G., Landen, C. N. The role of the fallopian tube in the origin of ovarian cancer. Am J Obstet Gynecol. 209, 409-414 (2013).
- King, S. M., et al. The impact of ovulation on fallopian tube epithelial cells: evaluating three hypotheses connecting ovulation and serous ovarian cancer. Endocr Relat Cancer. 18, 627-642 (2011).
- Flesken-Nikitin, A., et al. Ovarian surface epithelium at the junction area contains a cancer-prone stem cell niche. Nature. 495, 241-245 (2013).
- Paik, D. Y., et al. Stem-like epithelial cells are concentrated in the distal end of the fallopian tube: a site for injury and serous cancer initiation. Stem Cells. 30, 2487-2497 (2012).
- Connor, M. L., et al. Cancer stem cells: A contentious hypothesis now moving forward. Cancer Lett. 344, 180-187 (2014).
- Dean, M., Fojo, T., Bates, S. Tumour stem cells and drug resistance. Nat Rev Cancer. 5, 275-284 (2005).
- Bapat, S. A., Mali, A. M., Koppikar, C. B., Kurrey, N. K. Stem and progenitor-like cells contribute to the aggressive behavior of human epithelial ovarian cancer. Cancer Res. 65, 3025-3029 (2005).
- Szotek, P. P., et al. Ovarian cancer side population defines cells with stem cell-like characteristics and Mullerian Inhibiting Substance responsiveness. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 11154-11159 (2006).
- Zhang, S., et al. Identification and characterization of ovarian cancer-initiating cells from primary human tumors. Cancer Res. 68, 4311-4320 (2008).
- Wang, L., Mezencev, R., Bowen, N. J., Matyunina, L. V., McDonald, J. F. Isolation and characterization of stem-like cells from a human ovarian cancer cell line. Mol Cell Biochem. 363, 257-268 (2012).
- Kryczek, I., et al. Expression of aldehyde dehydrogenase and CD133 defines ovarian cancer stem cells. Int J Cancer. 130, 29-39 (2012).
- Meng, E., et al. CD44+/CD24- ovarian cancer cells demonstrate cancer stem cell properties and correlate to survival. Clin Exp Metastasis. 29, 939-948 (2012).
- Alvero, A. B., et al. Molecular phenotyping of human ovarian cancer stem cells unravels the mechanisms for repair and chemoresistance. Cell Cycle. 8, 158-166 (2009).
- Chen, J., et al. Evaluation of characteristics of CD44+CD117+ ovarian cancer stem cells in three dimensional basement membrane extract scaffold versus two dimensional monocultures. BMC Cell Biol. 14, 7 (2013).
- Guo, R., Wu, Q., Liu, F., Wang, Y. Description of the CD133+ subpopulation of the human ovarian cancer cell line OVCAR3. Oncol Rep. 25, 141-146 (2011).
- Curley, M. D., et al. CD133 expression defines a tumor initiating cell population in primary human ovarian cancer. Stem Cells. 27, 2875-2883 (2009).
- Baba, T., et al. Epigenetic regulation of CD133 and tumorigenicity of CD133+ ovarian cancer cells. Oncogene. 28, 209-218 (2009).
- Liao, J., et al. Ovarian cancer spheroid cells with stem cell-like properties contribute to tumor generation, metastasis and chemotherapy resistance through hypoxia-resistant metabolism. PLoS One. 9, e84941 (2014).
- Silva, I. A., et al. Aldehyde dehydrogenase in combination with CD133 defines angiogenic ovarian cancer stem cells that portend poor patient survival. Cancer Res. 71, 3991-4001 (2011).
- Jaggupilli, A., Elkord, E. Significance of CD44 and CD24 as cancer stem cell markers: an enduring ambiguity. Clin Dev Immunol. 2012, 708036 (2012).
- Irollo, E., Pirozzi, G. CD133: to be or not to be, is this the real question. Am J Transl Res. 5, 563-581 (2013).
- Ma, I., Allan, A. L. The role of human aldehyde dehydrogenase in normal and cancer stem cells. Stem Cell Rev. 7, 292-306 (2011).
- McLean, K., et al. Human ovarian carcinoma–associated mesenchymal stem cells regulate cancer stem cells and tumorigenesis via altered BMP production. J Clin Invest. 121, 3206-3219 (2011).
- Amara, I., Touati, W., Beaune, P., de Waziers, I. Mesenchymal stem cells as cellular vehicles for prodrug gene therapy against tumors. Biochimie. , (2014).
- Brabletz, T. EMT and MET in metastasis: where are the cancer stem cells. Cancer Cell. 22, 699-701 (2012).
- Latifi, A., et al. Isolation and characterization of tumor cells from the ascites of ovarian cancer patients: molecular phenotype of chemoresistant ovarian tumors. PLoS One. 7, e46858 (2012).
- Liu, S., et al. Breast Cancer Stem Cells Transition between Epithelial and Mesenchymal States Reflective of their Normal Counterparts. Stem Cell Reports. 2, 78-91 (2014).
- Malecki, M., et al. TRA-1-60(+), SSEA-4(+), Oct4A(+), Nanog(+) Clones of Pluripotent Stem Cells in the Embryonal Carcinomas of the Ovaries. J Stem Cell Res Ther. 2, (2012).
- Malecki, M., Tombokan, X., Anderson, M., Malecki, R., Beauchaine, M. TRA-1-60(+), SSEA-4(+), POU5F1(+), SOX2(+), NANOG(+) Clones of Pluripotent Stem Cells in the Embryonal Carcinomas of the Testes. J Stem Cell Res Ther. 3, 10-4172 (2013).
- Rajasekhar, V. K., Studer, L., Gerald, W., Socci, N. D., Scher, H. I. Tumour-initiating stem-like cells in human prostate cancer exhibit increased NF-κB signalling. Nat Commun. 2, 162 (2011).
- Loh, Y. H., et al. The Oct4 and Nanog transcription network regulates pluripotency in mouse embryonic stem cells. Nat Genet. 38, 431-440 (2006).
- Tay, Y., Zhang, J., Thomson, A. M., Lim, B., Rigoutsos, I. MicroRNAs to Nanog, Oct4 and Sox2 coding regions modulate embryonic stem cell differentiation. Nature. 455, 1124-1128 (2008).
- Lee, M., et al. Prognostic impact of the cancer stem cell-related marker NANOG in ovarian serous carcinoma. Int J Gynecol Cancer. 22, 1489-1496 (2012).
