Abstract
Müller celler er de vigtigste glialceller af nethinden. Deres endelige fødder danner grænserne for retina i det ydre og indre begrænsende membraner (ILM), og i forbindelse med astrocytter, pericytter og endotelceller de etablerer blod-retina-barrieren (BRB). BRB begrænser materialetransport mellem blodbanen og nethinden, mens ILM fungerer som en basalmembran, der definerer histologisk grænsen mellem nethinden og glaslegemet hulrum. Mærkning Müller celler er særlig relevant at undersøge den fysiske tilstand af de retinale barrierer, da disse celler er en integreret del af BRB og ILM. Både BRB og ILM hyppigt ændringer i retinal sygdom og er ansvarlige for sygdomssymptomer.
Der er flere veletablerede metoder til at undersøge integriteten af BRB, såsom Evans blue assay eller fluoresceinangiografi. Men disse metoder giver ikke oplysninger om omfanget af BRB permeabilitet to større molekyler, i nanometer. Desuden har de ikke give oplysninger om, hvor andre retinale barrierer, såsom ILM. At studere BRB permeabilitet sideløbende retinal ILM, vi brugte en AAV baseret metode, der giver oplysninger om permeabilitet BRB til større molekyler, mens angiver tilstanden af ILM og ekstracellulære matrix proteiner i sygdomstilstande. To AAV varianter er nyttige til en sådan undersøgelse: AAV5 og ShH10. AAV5 har en naturlig tropisme for fotoreceptorer, men det kan ikke komme over til den ydre retina, når det indgives i glaslegemet når ILM er intakt (dvs. i vildtype-nethinder). ShH10 har en stærk tropisme mod gliaceller og vil selektivt mærke Müller glia i både raske og syge nethinder. ShH10 giver mere effektiv gen levering i nethinder hvor ILM er kompromitteret. Disse virale værktøjer kombineret med immunhistokemi og blod-DNA-analyse kaste lys på tilstanden af retinale barrierer i sygdom.
Introduction
Müller celler er den største glial komponent af nethinden. Morfologisk, de spænder nethinden radialt og deres endfeet i kontakt med glaslegemet står ILM og hemmelige dele af sidstnævnte. ILM er en basalmembran sammensat af omkring ti forskellige ekstracellulære matrixproteiner (laminin, agrin, perlecan, nidogen, collagen og flere heparin sulfat proteoglycaner). Under udvikling, dens tilstedeværelse er uundværlig for retinal histogenese, navigation af optiske axoner, og overlevelsen af ganglieceller 1-3. Men ILM er uvæsentlig i voksen nethinden og kan fjernes kirurgisk i visse patologier uden at forårsage beskadigelse af nethinden 4. I genterapi denne membran bliver en fysisk barriere for effektiv transduktion af nethinden hjælp AAV'er ved intravitreal injektion 5.
Gennem omfattende arborization af deres processer, Müller celler giver ernæringsmæssige og lovgivningsmæssige support både retinale neuroner og vaskulære celler. Müller celler er også involveret i reguleringen af retinal homeostase, i dannelsen og vedligeholdelsen af BRB 6. Tight junctions mellem retinale endotelceller, Müller celler, astrocytter og pericytter danne BRB. BRB forhindrer visse stoffer i at komme ind de retina.In mange sygdomme som diabetisk retinopati, retinal vene okklusion og luftvejssygdomme, hypoxi af nethinden forårsager lækage gennem BRB 7-9. Dette brud er forbundet med en stigning i vaskulær permeabilitet, der fører til vasogent ødem, nethindeløsning og retinal skade.
Müller celler er tæt forbundet med blodkar og basalmembranen, spiller en vigtig rolle i både BRB og ILM integritet. Derfor er særligt relevant for studiet af den fysiske tilstand af disse retinale barrierer mærkning Müller gliaceller.
Klassiskallierede er BRB permeabilitet målt ved anvendelse af Evans blue assay bestående af systemisk injektion af Evans blåt farvestof, som binder ikke-covalent til plasma-albumin. Denne analyse måler albumin lækage (protein af mellemliggende størrelse, ~ 66 kDa) fra blodkarrene i nethinden (se protokoller afsnit 5) 10. Alternativt kan vaskulær lækage visualiseres ved fluorescens retinal angiografi godtgør for lækage af fluorescein (lille molekyle, ~ 359 Da; se protokoller afsnit 6) 11. Ikke desto mindre er begge metoder tillader evaluering af BRB permeabilitet for små molekyler og proteiner, men de giver ikke oplysninger om ILM integritet.
Derfor, for at studere BRB permeabilitet, anvendte vi en AAV baseret metode, der giver oplysninger om BRB permeabilitet for større molekyler (f.eks AAV partikler, 25 nm diameter). Faktisk kan vores metode detektere tilstedeværelsen af AAV transgenet i blodet, hvilket tyder på, at ~ partikler 25 nm diameter villevære i stand til at infiltrere i blodbanen. Denne fremgangsmåde giver også oplysninger om strukturen af ILM og ekstracellulære matrixproteiner i patologiske tilstande. To AAV varianter er nyttige til en sådan undersøgelse: AAV5 og ShH10. Subretinalt injiceret AAV5 har en naturlig tropisme for fotoreceptorer og retinale pigmentepitel 12, men det kan ikke komme over til den ydre retina, når det indgives i glaslegemet i vildtype-nethinder med intakt ILM 5,13. ShH10 er en AAV variant, der er blevet manipuleret til specifikt at målrette gliaceller end neuroner 14,15. ShH10 selektivt mærker Müller celler i både raske og syge nethinder med øget effektivitet i nethinder med kompromitterede barrierer 16. Disse virale værktøjer kombineret med immuhistochemistry og blod-DNA-analyse giver oplysninger om tilstanden af retinale barrierer og deres involvering i sygdom (figur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr, der anvendes i denne undersøgelse blev plejet og behandlet i overensstemmelse med ARVO Erklæring om anvendelse af dyr i Ophthalmic og Vision Research.
1. Produktion af rekombinant AAV (rAAV) ved transient transfektion af HEK-293-celler 17,18
Bemærk: Se McClure C, JOVE (2011) 19.
- Oprens en storstilet plasmidpræparation (mindst 1 mg / ml) af AAV vektor plasmider. Brug 3 plasmider. AAV helper plasmid, der bærer replikation og capsid generne uden AAV inverterede terminale gentagelser ITR'er transgenet ekspressionskassette bærer AAV ITR benævnt transfer plasmid, og plasmidet forsyning af adenovirus helper generne E2, E4 og VA-RNA-gener er omhandlet som pHELPER.
- Transficere 293-celler med disse 3 plasmider under anvendelse af polyethylenimin (eller anden transfektionsreagens). Over 80% af transfektionseffektivitet er nødvendig for god VIRAL udbytter.
- Oprens rekombinant AAV fra 293 cellelysater på en iodixanol gradient. 15%, 25%, 40% og 60% iodixanol anvendes til at opnå gradienten. Collect 40% iodixanol fraktion indeholdende AAV partikler koncentreres fraktion efter ultracentrifugering ved 500.000 x g i 1 time og buffer udveksling mod PBS (phosphatpufret saltvand) med 0,001% Pluronic.
- For at bestemme viral genomisk titer 20, udføre en DNAse ProteinaseK digest efterfulgt af QPCR. Frem og tilbage primere opformere 62 bp region beliggende i AAV2 ITR. For plasmidet standard, er proben mærket med FAM og har et sort hul quencher (BHQ).
- Udfør qPCR (kvantitativ polymerasekædereaktion) i et endeligt volumen på 25 pi ved hjælp 340 nM reverse ITR primer, 100 nM fremad ITR primer, 100 nM AAV2 ITR probe, 0,4 mM dNTP'er, 2 mM MgCI2, 1 x Platinum Taq Buffer, 1U Platinum Taq og 5 pi template (standard, prøve og ingen template kontrol).
- Forstandard bruge plasmid til transfektion i 7 x 10-fold seriefortyndinger (5 pi hver af 2 x 10 9 til 2 x 10 3 genomer / ml resulterede i en slutkoncentration fra oktober 10-April 10 genomer / ml).
- Begynd programmet ved et indledende denatureringstrin ved 95 ° C i 15 minutter efterfulgt af 40 cyklusser af denaturering ved ved 95 ° C i 1 min og annealing / forlængelse ved 60 ° C i 1 min. Opbevares ved 4 ° C i en kort tids opbevaring eller ved -20 ° C i lange opbevaringsperioder.
2. intravitreal injektion af AAV
- Bedøver C57BL6J mus med ketamin (50 mg / kg) og xylazin (10 mg / kg) og kontrollere tabet af stabilitetsrefleks, tilbagetrækning refleks og hale knivspids respons indikerer en ordentlig bedøvelse. Spile eleverne ved corneal anvendelse af neosynephrine 5% og mydriaticum 0,5% øjendråber. Brug dyrlæge salve på øjne for at forhindre tørhed, mens under anæstesi.
- Pass en ultrafine 30 G disposable nålen gennem ækvator og ved siden af limbus, i glaslegemet hulrum (se Chiu K, JOVE (2007) 21). Injicer 1 pi stock indeholdende 1 til 4 x 10 11 vp af ShH10-GFP eller AAV5-GFP med direkte observation af nålen i midten af glaslegemet hulrum (figur 1). Brug det ene øje som en kontrol for ILM eksperimenter. Indsprøjtes begge øjne i BRB eksperimenter. Påfør en anti-inflammatorisk og antibakteriel lokalbehandling på injicerede øjne.
- Spile eleverne med neosynephrine og mydriaticum øjendråber til billeddannelse. Udfør fundus undersøgelser med et øje funduskamera at følge GFP (grønt fluorescerende protein) ekspression 1 uge, 2 uger, 1 måned og 2 måneder efter intravitreal injektion (figur 1). Sacrifice mus ved CO 2 inhalation 1 til 2 måneder efter injektion.
3. Immunohistokemi
- For retinale kryosektioner (figur 1), dissekere tømte øjne til at fjerne lENS og hornhinde, og fordybelse fix i 4% paraformaldehyd i 1 time.
- Cryoprotect den tidligere fastsatte øjne i 10% saccharose i 1 time ved stuetemperatur, 20% sucrose for en anden time ved stuetemperatur. Cryoprotect i 30% saccharoseopløsning, natten over ved 4 ° C. Frys og indlejre øjestykker i indlejring harpiks, såsom Cryo-matrix. Lav 10 um kryosnit og montere på dias specialbehandlet for frosne vævssnit og at forbedre vævsvedhæftning under farvning.
- Permeabilisere sektioner med 0,1% Triton X100 i PBS pH 7,4 i 5 min. Wash 2x i PBS og blokeret i 1 time ved stuetemperatur i PBS med 1% BSA, 0,1% Tween 20.
- For retinale flatmounts (figur 1), fastsætte tømte øjne i 4% paraformaldehyd i 15 minutter for at lette dissektion.
- I 15-30 min, dissekere øjnene til at fjerne hornhinden og linsen. Adskil nethinden fra retinal pigment epithelium (RPE) og sclera ved at skære rundt om ora serrata ogsynsnerven. Nedsænkes i 4% paraformaldehyd i yderligere 30 minutter for at fastsætte nethinden og det fluorescerende protein i transducerede retinale celler (fiksering må ikke overstige 24 timer). Vask 5 min i sterilt PBS, pH 7,4.
- Skift PBS til blokeringsbuffer (PBS med 1% BSA, 2% normal ged eller æsel serum, 0,5% Triton X-100) og inkuberes i blokerende buffer til enten 4 timer ved stuetemperatur eller 4 ° C natten over.
- Inkuber væv med primære antistoffer i blokeringspuffer til enten 4 timer ved stuetemperatur eller ved 4 ° C natten over. Vask 3 x med PBS.
BEMÆRK: De anvendte antistoffer er som følger: anti-laminin (1 / 1.000) mærkning ILM, anti-rhodopsin klon 4D2 (1/500) mærkning stænger, anti-glutaminsynthetase klon GS-6 (1 / 1.500) mærkning Müller celler , PNA lektin (1/40) mærkning kegler. - Inkuber væv med 1: 500 fortynding af Alexa Fluor konjugerede sekundære antistoffer i blokeringspuffer i 1 time (kryosnit) eller 2 timer (flatmounts) ved stuetemperatur temperatur og beskyttet mod lys. Vask 3 x med PBS.
- Gør lindre nedskæringer nethinden og flatmount det på en glasplade med enten fotoreceptoren eller retinal ganglion celle (RGC) side opad. Tilføj vandig mountingmedium, anvende dækglas og opbevares ved 4 ° C.
- Udfør konfokal mikroskopi på laser-scanning konfokal mikroskop. Anskaf billeder efter hinanden, linje for linje, for at reducere excitation og emission krydstale. Definer trin størrelse efter Nyquist-Shannon prøvetagning teorem. Eksponering indstillinger, der minimerer overmættede pixels i de endelige billeder. Proces 12-bit-billeder med Fiji, projektledere Z-sektioner på et enkelt plan ved hjælp af maksimal intensitet under Z-projekt funktion og til sidst konvertere til 8-bit RGB-farvetilstand.
4. PCR-analyse af muse Blodprøver
- Injicer 100 pi stock indeholdende 1 til 4 x 10 11 partikler af et AAV-GFP i penis vene bedøvede C57BL6J mus (5% isoflurantil induktion i en tæt kammer og 2,5% af isofluran gennem en næse kegle under kirurgi) ved anvendelse af en insulinsprøjte med en ultra-fine 6 mm nål. Dette dyr vil tjene som en positiv kontrol af cirkulerende AAV partikler.
- Blodprøve fra mus hale før injektion og 3 timer, 24 timer, 2 dage, og 3 dage efter ShH10 intravitreal injektion eller efter intrapenile injektion (figur 1). Ca. 10-20 pi opsamles i heparin rør. Sacrifice mus ved CO 2 inhalation efter afslutningen af proceduren.
- Uddrag genomisk DNA fra blodprøver ved hjælp af udvinding kit efter eget valg.
- Udfør PCR-amplifikation af genomisk DNA. For denne protokol bruge følgende primerpar: GFP fornemmer 5'-CGACACAATCTGCCCTTTCG-3 ', antisense 5'-CATGGACGAGCTGTACAAGGGA-3'. Følgende PCR-programmet blev udført: 95 ° C 2 min (1 cyklus); 95 ° C 45 sek, 55 ° C 1 min, 72 ° C 45 sekunder (30 cykler); 72 ° C 5 min (1 cyklus);4 ° C hold.
5. Valgfrit Evans Blå Method
BEMÆRK: Kvantificér vaskulær permeabilitet ved at måle albumin lækage fra blodkarrene i nethinden ved hjælp af Evans blue metode 10.
- Forbered Evans blå farvestof ved opløsning i en saltvandsopløsning (6 mg / ml), sonikering i 5 min i et ultrasonisk renere og filtrering gennem et 5 um filter.
- Bedøver C57BL6J mus (isofluran inhalation, se trin 4.1), skal du kontrollere tabet af stabilitetsrefleks, tilbagetrækning refleks og hale knivspids respons indikerer en ordentlig bedøvelse, og injicere Evans blue (45 mg / kg) gennem penis vene (figur 1). Kontroller at poter, snude og ører af mus bliver klart blå efter Evans blå injektion, bekræfter optagelsen og fordelingen af farvestoffet.
- Bedøver C57BL6J mus 3 timer efter injektion af farvestoffet med ketamin (50 mg / kg) og xylazin (10 mg / kg) og kontrollere tab af righting refleks indikerer en korrekt bedøvelse. Prøve intrakardial omkring 500 pi blod i heparin rør og perfundere mus i 2 min via den venstre ventrikel med en citratpuffer (0,05 M, pH 3,5; opløses 7,8 g citronsyre og 3,8 g natriumcitrat i 1 L destilleret vand) præ-opvarmet til 37 ° C for at forhindre vasokonstriktion. Mus aflives via perfusion.
- Efter perfusion, enucleate og omhyggeligt dissekere begge øjne under et operationsmikroskop at indsamle de nethinder (se afsnit 3.2). Tørre nethinder i en centrifugalfordamper natten, vejes og udtrække Evans blåt farvestof ved inkubering nethinder med 100 pi formamid i 18 timer ved 65 ° C med rystning (100 xg). Centrifuge nethinden prøver i 30K omega filterrør på 20,798.5 xg i 2 timer ved 4 ° C og centrifugeres blodprøver på 20,798.5 xg i 15 minutter ved 4 ° C.
- Brug begge supernatanter at måle absorbans. Bestem absorbansen af hver prøve ved at subtrahere den maksimale absorbans FOR Evans blue ved 620 nm til minimum absorbansen ved 740 nm. Beregn Evans blue i plasma og retina fra en standardkurve af Evans blåt i formamid. Express BRB permeabilitet i mikroliter Evans blå per gram tør nethinden timen (pi plasma / g retinal tør vægt / time).
6. Valgfrit fluoresceinangiografi
BEMÆRK: Lækage fra retinale blodkar hos mus kan visualiseres ved intraperitoneal injektion af natrium fluorescein.
- Bedøver C57BL6J mus (isofluran inhalation, se trin 4.1) og spile eleverne med øjendråber (neosynephrine og mydriaticum). Brug dyrlæge salve på øjne for at forhindre tørhed, mens under anæstesi.
- Injicer intraperitonealt 0,01-0,02 ml 10% natrium fluorescein i 0,1 ml sterilt saltvand til fluoresceinangiografi.
- Saml billeder af begge øjne efter injektion ved hjælp af et øje funduskamera. Sacrifice mus ved CO 2 inhalation efter proprocedure.
BEMÆRK: 20 sek er nødvendigt for de retinale kar til at blive synlig på angiografi. Billeder skal fanget mellem 3-10 min maksimum efter fluorescein injektion. De lækage lokationer (hvis det findes) er observerbare efter 2,5 min. På senere tidspunkter billedkvaliteten er tabt på grund af natriumfluorescein diffunderer ind glaslegemet således kun billeder kort opnået efter anvendes til analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi forventer øget retinal transduktion af Müller gliaceller hjælp ShH10 hvis dyret model viser perturbationer i strukturen af ILM (figur 2A - B). For eksempel har vi vist, at i fravær af Dp71, ShH10 mål specifikt, men mere effektivt Müller gliaceller efter intravitreal injektion, hvilket indikerer forøget permeabilitet af ILM i denne mus linje i forhold til vildtypemus 16 (figur 2C - F).
AAV5 kan også anvendes som en indikator for ILM permeabilitet. AAV5, nedbrydes ved intravitreal injektion i vildtypemus bliver stærkt effektive i gen levering til fotoreceptorer i mus med kompromitterede retinale barrierer såsom Dp71-null mus 16 eller i andre retinale degenerationer 22 (figur 2G - H). Dette bekræfter yderligere ILM forvaltningsmæssigt og potentielle permeabilitet i stigendee i den ekstra-cellulære matrix omgiver retinale neuroner.
Vi fandt, at BRB fordeling af Dp71-nul-mus er selektiv mod AAV partikler, eftersom ingen spor af AAV blev fundet i blodprøver af intravitrealt injiceret Dp71-nul-mus 16 (figur 3).
Figur 1:. Skematisk fremstilling af den generelle protokol efter AAV-produktion, er partikler injiceret i glaslegemet eller i penis vene til bedøvede voksne mus. Fundus billeder med Micron III kamera udføres for at følge den GFP-ekspression. Den GFP-ekspression mønster analyseres på retinale kryosektioner og flatmounted nethinder takket være immunhistokemi og konfokale billeder. AAV passage gennem BRB vurderes af PCR-analyse på blodprøver fra intravitrealt eller intrapenially injicerede mus, jegn for at detektere tilstedeværelsen af GFP-sekvens, indikator for AAV partikler tilstedeværelse i blodstrømmen.
Figur 2: ILM permeabilitet til AAV transduktion Konfokale billeder af flatmounted vildtype og Dp71-null nethinder mærket med en pan-laminin antistof (A, B). (Skala bar: 50 pm). Fundus billeder, der viser GFP-ekspression (C, D). Flatmounted nethinder en måned efter ShH10-GFP intravitreal injektion (E, F). Tre dimensionel rekonstitution (E *), i det område, markeret med en stjerne i E viser transducerede Müller gliaceller i grøn og astrocytter i rød (anti-GFAP-antistof). Flatmounted nethinder en måned efter intravitreal injektion af AAV5-GFP (G, H) (skala bar: 500 um). Konfokal billede af området markeret med en stjerne i H viser transducerede fotoreceptorer i grønne og kegle ydre segmenter i rød (PNA lektin farvning) (H *). Den venstre kolonne viser resultater fra vildtype mus nethinder og den midterste kolonne viser resultater fra Dp71-null mus nethinder. Skemaet (I) repræsenterer AAV transduktion af nethinden med kompromitterede barrierer som Dp71-null nethinde gennem glaslegemet. Forkortelser: CV, choroidale fartøjer; RPE, retinal pigment epithelium; PHR, fotoreceptorceller (stave og tappe); MGC, Müller gliaceller; HC, horisontale celler; BC, bipolære celler; AC, amacrine celler; M, mikroglia; EF endotelceller; P, pericytter; GC ganglieceller; A, astrocytter; ILM, indre begrænsende membran; V, glaslegeme; AAV, adenoassocieret virus. (Re-print med tilladelse fra Vacca et al., Glia (2013) 16, # 3483740951391).
tp_upload / 52451 / 52451fig3.jpg "/>
Figur 3: BRB permeabilitet for AAV partikler PCR-amplifikation af GFP transgen ekstraheret fra muse blodprøver.. Mus enten injiceret intravitrealt (IVT) med ShH10-GFP eller intrapenially (IP) med AAV-GFP på forskellige tidspunkter efter injektion. Bane 5-18, ulige tal for vildtype-mus og lige numre til Dp71-null mus; bane 2, 1 ng af AAV plasmid, pTR-SB-smCBA-hGFP; bane 3, vand; bane 5-6, blod DNA før injektion; banerne 7-8, 3 timer efter IVT; bane 9-10, 24 timer post-IVT; banerne 11-12, 24 timer efter IP; bane 13-14, 48 timer post-IVT; banerne 15-16, 48 timer efter IP; bane 17-18, 72 hr post-IVT; bane 19-20, 72 timer efter undersøgelsesperioden. Bane 1 og 4, Invitrogen skala stigen (100 bp): 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 1.000, 1.500, 2.000, 3.000 bp. (Re-print med tilladelse fra Vacca et al., Glia (2013) 16, # 3483740951391).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
BRB regulerer udvekslingen af molekyler mellem blod og retina. Dets fordeling er forbundet med forskellige sygdomme, såsom diabetisk retinopati eller aldersrelateret makulær degeneration (AMD). Vi har for nylig vist, at i en dystrofin knock-out mus, som viser permeable BRB bliver mere tolerant for genafgivelse medieret af adenoassocierede virale vektorer (AAV) nethinden. Men trods BRB permeabilitet AAV partikler injiceret intraokulært holde begrænset til okulær rum i denne model. Vores resultater viser, at genterapi til sygdomme, der viser permeable BRB repræsenterer ikke yderligere risiko for systemiske bivirkninger. Desuden de støtter, at andre barrierer, såsom ILM bliver kompromitteret under retinal sygdom giver bedre adgang til viruspartikler. Vores resultater får os til at tro, at AAV kodning reportergener er et fremragende værktøj til at studere BRB permeabilitet og ILM integritet i dyremodeller af retinal sygdom. Særmæssigt, kan AAV variant ShH10, som specifikt etiketter Müller glia bruges som et redskab til at mærke retinal glia og rapportere om status for nethinden som reaktion på sygdom. ShH10 vil selektivt mærke Müller glia i både raske og syge nethinder. Både ShH10 og andre AAV'er vil dog give en mere effektiv gen levering i nethinder med kompromitterede barrierer.
Nogle kritiske trin i at anvende de ovenfor beskrevne protokoller (1) at udvikle håndelag for at udføre den sikreste intravitreal injektion, og (2) korrekt fastsættelse vævet før og efter dissektion. Ved at studere retinale barrierer bør intravitreal injektion være velgennemført der er - uden at røre linsen eller nethinden. Beskadige linsen eller afmonterer nethinden påvirker BRB permeabilitet 23,24 den. Derudover skader linse hæmmer fundus billeddannelse. Berøring af nethinden kan briste ILM og beskadige nethinden struktur. For at undgå at røre nethinden, den erfaMIndtast bør overholde spidsen af Hamilton-sprøjte i midten af glaslegemet hulrum, foran nethinden. Et ikke-toksisk farvestof kan indgå (såsom phenol rød eller fluorescein) i den virale opløsning for at hjælpe til observation af den fluid injektion i glaslegemet. Beskadigelse af nethinden kan let observeres under fundus billeddannelse følgende procedure injektionen. En anden kritisk trin er fiksering af væv efter tilstrækkelig ekspressionsniveauer er nået. Efter enucleation skal øjnene straks nedsænket i fiksativ buffer og før væv permeabilisering en anden fiksering er nødvendig for at forhindre GFP lækage. Det kan være nyttigt at snitte hornhinden før nedsænke hele øjet i fiksativ - dette vil give fiksativ en chance for at trænge ind i glaslegemet. Dette trin kan øge den samlede væv stabilitet.
Endelig er det også vigtigt at injicere nok AAV partikler til at transducere effektivt nethinden og at observere GFP expression på øjet fundus billeder. Den optimale mængde af AAV-partikler er omkring 10 10 -10 11 vg per øje, under 10 10 partikler GFP-ekspression ikke altid overholdes af fundus billeddannelse.
Denne teknik vil ikke give mulighed for direkte at observere ILM eller kar under BRB. Men det giver en måde at undersøge nethinden barrierer og få dem ændret i sygdomstilstande, på en måde, der ikke tidligere er muligt ved hjælp af Evans blå assay og fluorescein angiografi. Brug AAV'er med specifikke retinale transduktion egenskaber, er det muligt at få bedre indblik i den tilstand af nethinden med hensyn til gliaceller, deres ekstracellulære matrix og ILM. Efter mastering denne teknik, kan man teste effektiviteten af terapeutiske strategier og deres indflydelse på BRB og retinal permeabilitet og gå i retning af en bedre forståelse af sygdommens progression og muligheden for at genoprette normale forhold efter behandling ina musemodel for retinal sygdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL6J mice strain | JANVIER LABS | mice | |
| Ketamine 500 | Virbac France | anesthetic | |
| Xylazine Rompun 2% | Bayer Healthcare | anesthetic | |
| Neosynephrine 5% Faure | Europhta | dilatant | |
| Mydriaticum 0.5% | Thea | dilatant | |
| Sterdex | Novartis | anti-inflammatory | |
| Cryomatrix embedding resin | Thermo Scientific | 6769006 | |
| Superfrost Plus Adhesion Slides | Thermo Scientific | 10143352 | slides |
| anti-laminin | Sigma | L9393 | antibody |
| anti-rhodopsin clone 4D2 | Millipore | MABN15 | antibody |
| anti-glutamine synthetase clone GS-6 | Millipore | MAB302 | antibody |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein | Dako | 334 | antibody |
| PNA Lectin | Invitrogen | L32459 | probe |
| Alexa fluor conjugated secondary antibodies | Invitrogen | antibody | |
| Fluorsave reagent | Calbiochem | 345789 | mounting medium |
| QIAmp DNA Micro Kit | QIAGEN | 56304 | |
| GoTaq DNA polymerase | Promega | M3001 | |
| Evans Blue dye | Sigma | E2129 | dye |
| 5 µm filter | Millipore | ||
| Sodium citrate | Sigma | S1804 | |
| Citric acid | Sigma | C1909-2.5KG | |
| Formamide spectrophotometric | Sigma | 295876-2L | |
| Fluorescein | Sigma | F2456 | dye |
| Micron III | Phoenix Research Labs | Microscopy system based on 3-CCD color camera, frame grabber, and off-the-shelf software enables researchers to image mouse retinas. | |
| Insulin Syringes | Terumo | SS30M3109 | |
| Syringe 10 µl Hamilton | Dutscher | 74487 | Seringue 1701 |
| Needle RN G33, 25 mm, PST 2 | Fisher Scientific | 11530332 | Intravitreal Injection |
| UltraMicroPump UMP3 | World Precision Instruments | UMP3 | Versatile injector uses microsyringes to deliver picoliter volumes |
| UltraMicroPump (UMP3) (one) with SYS-Micro4 Controller | UMP3-1 | Digital controller | |
| Binocular magnifier SZ76 | ADVILAB | ADV-76B2 | Zoom 0.66 x 5 x LEDs with stand epi and dia / Retinas dissection |
| Spring scissors straight - 8.5 cm | Bionic France S.a.r.l | 15003-08 | Retinas dissection |
| curved Vanna scissor | 15004-08 | ||
| Pince Dumont 5 | 11254-20 | ||
| Veriti 96-Well Thermal Cycler | Life technologies | 4375786 | Thermocycler |
| Ultrasonic cleaner | Laboratory Supplies | G1125P1T | |
| Nanosep 30k omega tubes | VWR | ||
| Speedvac | Fisher Scientific | SC 110 A | |
| Spectrofluorometer | TECAN | infinite M1000 |
References
- Halfter, W. Disruption of the retinal basal lamina during early embryonic development leads to a retraction of vitreal end feet, an increased number of ganglion cells, and aberrant axonal outgrowth. J Comp Neurol. 397 (1), 89-104 (1998).
- Halfter, W., Dong, S., Balasubramani, M., Bier, M. E. Temporary disruption of the retinal basal lamina and its effect on retinal histogenesis. Dev Biol. 238 (1), 79-96 (2001).
- Halfter, W., Willem, M., Mayer, U. Basement membrane-dependent survival of retinal ganglion cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (3), 1000-1009 (2005).
- Abdelkader, E., Lois, N. Internal limiting membrane peeling in vitreo-retinal surgery. Surv Ophthalmol. 53 (4), 368-396 (2008).
- Dalkara, D., et al. Inner limiting membrane barriers to AAV-mediated retinal transduction from the vitreous. Mol Ther. 17 (12), 2096-2102 (2009).
- Bringmann, A., et al. Muller cells in the healthy and diseased retina. Prog Retin Eye Res. 25 (4), 397-424 (2006).
- Eichler, W., Kuhrt, H., Hoffmann, S., Wiedemann, P., Reichenbach, A. VEGF release by retinal glia depends on both oxygen and glucose supply. Neuroreport. 11 (16), 3533-3537 (2000).
- Kaur, C., Foulds, W. S., Ling, E. A. Blood-retinal barrier in hypoxic ischaemic conditions: basic concepts, clinical features and management. Prog Retin Eye Res. 27 (6), 622-647 (2008).
- Kaur, C., Sivakumar, V., Foulds, W. S. Early response of neurons and glial cells to hypoxia in the retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (3), 1126-1141 (2006).
- Xu, Q., Qaum, T., Adamis, A. P. Sensitive blood-retinal barrier breakdown quantitation using Evans blue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (3), 789-794 (2001).
- Amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. E. Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse. Microvasc Res. 46 (2), 135-142 (1993).
- Yang, G. S., et al. Virus-mediated transduction of murine retina with adeno-associated virus: effects of viral capsid and genome size. J Virol. 76 (15), 7651-7660 (2002).
- Li, W., et al. Gene therapy following subretinal AAV5 vector delivery is not affected by a previous intravitreal AAV5 vector administration in the partner eye. Mol Vis. 15, 267-275 (2009).
- Koerber, J. T., et al. Molecular evolution of adeno-associated virus for enhanced glial gene delivery. Mol Ther. 17 (12), 2088-2095 (2009).
- Klimczak, R. R., Koerber, J. T., Dalkara, D., Flannery, J. G., Schaffer, D. V. A novel adeno-associated viral variant for efficient and selective intravitreal transduction of rat Muller cells. PLoS One. 4 (10), e7467 (2009).
- Vacca, O., et al. AAV-mediated gene delivery in Dp71-null mouse model with compromised barriers. Glia. , (2013).
- Choi, V. W., Asokan, A., Haberman, R. A., Samulski, R. J. Production of recombinant adeno-associated viral vectors. Curr Protoc Hum Genet. 12 (Unit 12 19), (2007).
- Choi, V. W., Asokan, A., Haberman, R. A., Samulski, R. J. Production of recombinant adeno-associated viral vectors for in vitro and in vivo use. Curr Protoc Mol Biol. 16 (Unit 16 25), (2007).
- McClure, C., Cole, K. L., Wulff, P., Klugmann, M., Murray, A. J. Production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors. J Vis Exp. (57), e3348 (2011).
- Aurnhammer, C., et al. Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences. Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 18-28 (2012).
- Chiu, K., Chang, R. C., So, K. F. Intravitreous injection for establishing ocular diseases model. J Vis Exp. (8), 313 (2007).
- Kolstad, K. D., et al. Changes in adeno-associated virus-mediated gene delivery in retinal degeneration. Hum Gene Ther. 21 (5), 571-578 (2010).
- Sene, A., et al. Functional implication of Dp71 in osmoregulation and vascular permeability of the retina. PLoS One. 4 (10), e7329 (2009).
- Benard, R. A New Quantifiable Blood Retinal Barrier Breakdown Model In Mice. ARVO Annual Meeting. , (2011).
