Abstract
Endosomale verzuring is van cruciaal belang voor een breed scala van processen, zoals eiwitten recycling en degradatie, receptor desensibilisatie, en neurotransmitter laden in de synaptische blaasjes. Deze verzuring wordt beschreven te worden gemedieerd door proton ATPasen gekoppelde CIC chloride transporters. Sterk geconserveerde electroneutrale protonen transporters, worden de Na + / H + uitwisselaars (NHE) 6, 7 en 9 ook die in deze compartimenten. Mutaties in de genen verbonden met menselijke cognitieve en neurodegeneratieve ziekten. Paradoxaal genoeg, hun rol blijven ongrijpbaar, als hun intracellulaire lokalisatie heeft verhinderd gedetailleerde functionele karakterisatie. Het manuscript geeft een methode om dit probleem op te lossen. Deze bestaat uit de selectie van mutante cellijnen, bestand zijn tegen acute cytosolische verzuring door behoud intracellulaire NHEs op het plasmamembraan. Het toont dan twee aanvullende protocollen bij het ion selectiviteit en activiteit te metenDeze wisselaars: (i) één gebaseerd op intracellulaire pH-metingen via fluorescentie microscopie video, en (ii) een op basis van de snelle kinetiek van lithium opname. Dergelijke protocollen kunnen worden geëxtrapoleerd naar andere niet-elektrogene transporters meten. Bovendien is de selectieprocedure gepresenteerde genereert cellen met een intracellulaire retentie defect fenotype. Daarom zullen deze cellen ook andere vesiculaire membraaneiwitten in de plasmamembraan drukken. De experimentele strategie hier afgebeelde derhalve een potentieel krachtig hulpmiddel om andere intracellulaire eiwitten die dan wordt uitgedrukt in het plasmamembraan met vesiculaire Na + / H + warmtewisselaars gebruikt voor de selectie.
Introduction
De meeste intracellulaire compartimenten geven een zure luminale pH, dat is een belangrijke parameter voor de rijping, mensenhandel, recycling van eiwitten of hormonen en neurotransmitters geladen. Aangetoond is dat de pH-gradiënt tussen cytosol en vesiculaire inhoud wordt gegenereerd door vacuolair H + ATPasen 1, gekoppeld met vesiculaire ClC chloride transporteurs 2. Zowel in de knock-out (KO) muizen en menselijke patiënten, het belang van deze transporters werd benadrukt door de zware fenotypes veroorzaakt door mutaties in hun genen 3-6.
De leden van de natrium-waterstof wisselaars SLC9A familie, aangeduid ook NHEs voor Na + / H + wisselaars, is aangetoond sleutel effectoren in intracellulaire pH en celvolume regulatie, evenals in vectoriële transport van zuur-base-equivalenten in epithelia worden . Naast de plasmamembraan NHEs, drie zeer geconserveerde Na + / H + wisselaars NHE 6, 7en 9 worden uitgedrukt in trans-Golgi netwerk en begin endosomen 7. Mutaties in hun genen hebben in verband gebracht met het Angelman-achtige of Christianson syndromen 8-9, familie-gebaseerde autisme 10 en Attention Deficit Hyperactivity Disorder 11-12. Deze warmtewisselaars zijn ook betrokken geweest bij neurodegeneratieve problemen zoals Alzheimer ziektegevoeligheid 13 en X-gebonden mentale retardatie aaneengesloten genen syndromen 14. Tezamen bieden deze studies benadrukken het belang van deze intracellulaire NHEs in ontwikkeling van de hersenen en / of functie.
De intracellulaire lokalisatie van deze wisselaars voorkomt nauwkeurige metingen van hun ionselectiviteit, transport richting, kinetische parameters en regelgeving. Zoals bij alle transporteurs uitgedrukt in intracellulaire compartimenten, is het uiterst moeilijk om hun biochemische activiteiten te beoordelen en daarmee tot volle hun fysiologische rol en de Mechanismen onderliggende hun pathologische gevolgen. Gebaseerd op de hoge cytosolische K + concentratie, de meest algemeen aanvaarde hypothese was dat ze werken als K + gekoppelde proton efflux transporters. Het bestaan van dergelijke proton lek werd verondersteld, omdat proton pomp kan compenseren door de V-ATPasen om een steady state vesiculaire pH te handhaven. Het doel van dit visuele artikel is (i) een werkwijze die de genetische selectie van cellijnen die dergelijke vesiculaire transporters op de plasmamembraan expressie, en (ii) twee onafhankelijke benaderingen om de functies van deze transporters meten zichtbaar blijft tonen.
Drie decennia geleden hebben Pouysségur en Franchi een genetische benadering die de moleculaire klonering en karakterisering van de leden van de NHE familie 15 ingeschakeld bood. Dit was gebaseerd op de toxiciteit van intracellulaire protonen als screeningsmethode. De eerste stap was om cellijnen deficiënt te verkrijgenin een Na + / H + uitwisseling uitgedrukt op het plasmamembraan, waarbij de reversibiliteit van deze transporter. Fibroblasten (CCL39 cellijn) werden voorgeladen met Na + of Li + en daarna in een zuur extracellulaire medium (pH 6,5) gedurende 2 uur. Dit leidde tot de dood van cellen die een functioneel Na + / H + uitwisseling en de selectie van antiporter-deficiënte cellen (PS120 cellijn) 16. Wanneer gekweekt in bicarbonaat-vrij medium, deze cellen zijn zeer gevoelig voor acute intracellulaire aanzuring. Bijgevolg zal de expressie van een functioneel proton efflux mechanisme het plasmamembraan positief worden geselecteerd (zie 17) of dergelijke cellen zijn afkomstig van acute intracellulaire acidifications. Dergelijke verzuring technieken kunnen worden gebruikt om cellijnen te isoleren met verhandelen gebreken waarvan de geforceerde expressie van WT intracellulaire NHEs het plasmamembraan.
Als eukaryotische Na + / H+ Wisselaars electroneutrale, zijn ze niet meetbaar door de elektrofysiologische benaderingen die zijn met succes gebruikt om kanalen te meten. Dit manuscript toont dus hoe de activiteit van dit wisselaar te meten door intracellulaire pH-metingen en snelle kinetiek van lithium opname. Als de onderliggende begrippen hetzelfde is interessant op te merken dat veel van de werkwijzen ontwikkeld voor het gedeelte selectie ook rechtstreeks worden gebruikt voor functionele metingen.
Interessant, hebben we vastgesteld dat de handel defect in de cellijnen geselecteerd met de in dit manuscript beschreven aanpak leidt tot een grotere expressie van andere vesiculaire eiwitten in het plasmamembraan zoals vesiculaire kaliumkanaal TWIK1 18. Dit wijst in de richting van de selectie van een algemene retentie defect mechanisme voor vesiculaire transmembraaneiwitten. Vandaar deze selectieprocedure en de cellen die het genereert meivormen een veelbelovend hulpmiddel voor de wetenschappelijke gemeenschap aan het membraaneiwitten van intracellulaire compartimenten. Zowel de meettechnieken hier gepresenteerde zou gelden voor het bestuderen van andere niet-elektrogene transporters zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. H + Killing Selection
- Cellijnen
- Stabiel transfecteren NHE-deficiënte cellen (bijvoorbeeld het CCL39-afgeleide PS120 cellijn 16) met combinatie van zoogdierlijke expressievector en transfectie werkwijze eventuele die efficiënte transfectie opbrengsten en selectie zal produceren in een fibroblast cellijn.
OPMERKING: Voor vele jaren calciumfosfaatprecipitatiewerkwijze 19 werd gebruikt met goede transfectie opbrengsten. Dit werd onlangs vervangen door commerciële reagentia zoals Lipofectamine2000, de transfecties wordt uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant.
- Stabiel transfecteren NHE-deficiënte cellen (bijvoorbeeld het CCL39-afgeleide PS120 cellijn 16) met combinatie van zoogdierlijke expressievector en transfectie werkwijze eventuele die efficiënte transfectie opbrengsten en selectie zal produceren in een fibroblast cellijn.
- Oplossingen
- Bereid drie steriele oplossingen zoals hieronder beschreven. Steriliseer deze oplossingen door filtratie (0,22 pm).
- Bereid een NH4 + geladen (pH 7,4) bestaande uit 50 mM NH4CI, 70 mM cholinechloride, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 5 mM GLucose en 15 mM MOPS pH 7,4.
- Bereid een spoeloplossing (pH 7,0) bestaande uit 120 mM choline chloride, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 5 mM glucose en 15 mM HEPES bij pH 7,0.
- Bereid een Recovery oplossing (pH 7,4) bestaande uit 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 5 mM glucose en 15 mM HEPES bij pH 7,4.
- Bereid drie steriele oplossingen zoals hieronder beschreven. Steriliseer deze oplossingen door filtratie (0,22 pm).
- Voordat de selectie, het verkrijgen van een celkweek incubator die kunnen worden gebruikt bij 37 ° C zonder extra CO2 uit buitentank (aangeduid CO 2 - "vrij" incubator), 5% CO2 leidt tot buffering die kan verminderen de verzuring. Amplify de cellijn de NHE plaats tot ongeveer 2 x 10 8 cellen (gewoonlijk ongeveer 20 confluente 100 mm platen).
- H + doden procedure:
- Incubeer de cellen die de intracellulaire NHE plaats gedurende 1 uur in de beladingsoplossing, 37 ° C in de CO2-vrije incubator.
- Zuig het laden oplossing en spoel ze tweemaal in de bovenbeschreven-spoeloplossing. Voer deze stap efficiënt om de resterende extracellulaire NH4Cl dat de oprichting van een steile NH4 + gradiënt dat de verzuring zal genereren afbreuk zou elimineren.
- Elimineer het spoelmedium door afzuiging en incubeer de cellen gedurende een uur recovery oplossing opnieuw bij 37 ° C in de CO2 incubator vrij.
- Vervang het herstelmedium regelmatig kweekmedium (DMEM typisch 7,5% FCS) en groeien de cellen in standaard kweekcondities (37 ° C in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2 en 95% lucht).
- Herhaal deze cyclus van selectie tweemaal per week tot stabiele klonen ontstaan.
OPMERKING: Wees extra voorzichtig met betrekking tot de celcultuur en selectievoorwaarden. Maanden van het werk kan worden geruïneerd door elke vorm van verontreiniging, dat is meer vatbaar voor occur na een lange periode van cultuur en herhaalde cel manipulaties.- Hier kiezen of u de klonen te versterken en te karakteriseren hen individueel zoals nader beschreven in de paragrafen 2-3, of bundelen ze samen om een mobiele bevolking vóór karakterisering genereren.
- Breng incidentele selectie (ongeveer om de twee weken) het aanzuren-resistente cellen behouden door toonbank selecteren die kunnen teruggekeerd naar de ouderlijke zuur-gevoelige fenotype (Figuur 1B).
2. De intracellulaire pH Metingen
2.1) Fluorescentie pH Imaging
- Gebruik de ratiometrisch pH-gevoelige fluorescente kleurstof BCECF / AM, dat is pH-gevoelig bij excitatie bij 490 nm en beschikt over een 445 nm isosbestic punt, volgende protocollen van de fabrikant.
- Alternatief gebruik andere pH-gevoelige probes volgende protocollen van de fabrikant.
- Gebruik een imaging set consteld uit een omgekeerde microscoop gekoppeld aan een hoge gevoeligheid videocamera. Rusten deze set met 450 nm en 490 nm smalle band interferentie filters gecombineerd met de juiste kwarts neutrale dichtheid filters voor excitatie.
- Indien mogelijk, gebruik maken van de juiste set van filters en verlichting voorwaarden setup vergelijkbaar fluorescentie waarden voor λ1 en λ2, zodat de verhouding benadert 1. Vermijd ook basale fluorescentie waarden die zijn ingesteld ofwel verzadigen of te laag is, zowel voor λ1 en / of λ2. Dit kan van belang artefacten opleveren als toen het quotiënt mag niet detecteerbaar zijn, hoewel de intracellulaire pH is aan het veranderen.
Opmerking: Dit systeem moet snelle perfusie, time-lapse excitatie bij de twee bovengenoemde golflengten en verwerving mogelijk op de juiste emissiegolflengte (535 nm voor BCECF). Voorzie het systeem met software waarmee de automatische data-acquisitie en opslag.
- Indien mogelijk, gebruik maken van de juiste set van filters en verlichting voorwaarden setup vergelijkbaar fluorescentie waarden voor λ1 en λ2, zodat de verhouding benadert 1. Vermijd ook basale fluorescentie waarden die zijn ingesteld ofwel verzadigen of te laag is, zowel voor λ1 en / of λ2. Dit kan van belang artefacten opleveren als toen het quotiënt mag niet detecteerbaar zijn, hoewel de intracellulaire pH is aan het veranderen.
2.2) Meting van NHE Forward Activity (Extrusie vanProtonen uit het cytosol)
- Zuur cellen door een 1 uur incubatie in de NH4 + geladen oplossing (zie stap 1.4) bij afwezigheid van CO 2.
- Voeg BCECF-AM (5 uM eindconcentratie) aan de oplossing van de laatste vijf minuten en spoel het met NH4 + beladingsoplossing de extracellulaire probe elimineren.
- Monteer de cellen op de microscoop en neemt meerdere afbeeldingen een stabiele basislijn te nemen. Perfuseren de spoeloplossing (zie hierboven). Dit resulteert in een daling van fluorescentie overeenkomt met de verzuring.
- Na pH stabilisatie perfuseren een van de onderstaande oplossingen tot pH opbrengst gemedieerd door Li + / H +, Na + / H + of K + / H + uitwisseling meten. Elke oplossing bevat een mogelijke koppeling catie te worden getest op H + uitwisseling. Als een van deze wordt getransporteerd, zal dit resulteren in een fluorescentie verhoging bij 495 nm die correspondond een verhoging van de intracellulaire pH:
120 mM LiCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 5 mM glucose en 15 mM HEPES bij pH 7,4
120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 5 mM glucose en 15 mM HEPES bij pH 7,4
125 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 5 mM glucose en 15 mM HEPES bij pH 7,4
2.3) Meting van NHE Reverse Activity
OPMERKING: Het principe is hier om de transmembraan ionische gradiënten omkeren.
- Voorafgaand aan de meting, laden de cellen met de intracellulaire catie van belang (zie hieronder).
- Incubeer ze gedurende 5 minuten met BCECF / AM (zie stap 2.2.2); spoel ze af, monteer ze op de video microscoop.
- Perfuse het laden oplossing en neem verschillende beelden naar een stabiele basislijn te nemen.
- Na de basislijn stabilisatie, imago van de schommelingen in de pH wanneer de cellen perfusie met een extracellulaire zuur medium met 120 mM choline chloride, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 5 mM glucose en 15 mM MES bij pH 6,5.
- Voor LiCl laden, incubeer cellen gedurende 2 uur in een oplossing bestaande uit 120 mM LiCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 5 mM glucose en 15 mM HEPES bij pH 7,4. Intracellulaire lithium gemeten met atoomabsorptie spectroscopie levert een waarde van ongeveer 60 mM.
- Voor Na + laden, incubeer cellen gedurende twee uur in een oplossing bestaande uit 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 5 mM glucose en 15 mM HEPES bij pH 7,4 in aanwezigheid van 1 mM ouabaïne de Na / K ATPase blokkeren. In deze omstandigheden intracellulaire Na + concentratie in het traject van 40 mM.
OPMERKING: K + belasting is niet noodzakelijk als cytosolische K + concentratie in het gebied van 140 mM en een naar buiten gerichte K + gradiënt is dus eenvoudig te realiseren.
2.4) De gegevens Behandeling en kalibratie:
OPMERKING: Deze stap geldt zowel voor het vooruit en achteruit metingen.
- Aan het einde van elk experiment perfuseren cellen met een oplossing van 140 mM KCI, 20 mM HEPES en 5 uM nigericine op pH-waarden tussen 6,5 en 7,4.
- Verzamel gegevens als fluorescentie metingen van de beelden (grijs niveaus vertegenwoordigen intensiteit niveaus) en export onder tekstformaat en behandelen als toegelicht met behulp van een spreadsheet programma.
- Bereken intracellulaire pH-waarden voor elke afzonderlijke cel of gebied van belang met de volgende vergelijking:
pH = pKa + (Log (R-Rmin) / (R max -R)) x F min (λ2) / F max (λ2) - Gebruik de F min (λ2) / F ma x (λ2) verhouding als er probe bleken of lekken, wat resulteert in een afname in de 450 nm fluorescentie gedurende de experimenten. Dit is echter zeer zelden waargenomen in de bij de des voorwaardencribed experimenten.
- Aangezien de kalibratiegegevens bij het einde van elke pH meting, controleert of de overeenkomstige berekende waarden afwijken van de pH worden gebruikt voor kalibratie. Als dit het geval dan met de volgende procedure pas alle experimenteel bepaalde pH-waarden aan de kalibratie:
- Bereken de volgende quotiënt (Q, het verschil tussen de meetwaarden / Verschil tussen de kalibratiewaarden). Vermenigvuldig de hele dataset door Q. Maak de laatste aanpassing door optellen of aftrekken, zodat de berekende waarden van de bijbehorende kalibratie waarden zal evenaren.
3. Metingen van Initial tarieven van NHE7 door Fast Li + Opname
- Zaad cellen op meerdere putjes (6 tot 24-well) en zuur ze met behulp van de NH4 + ladingstechniek boven of afwisselend de nigericine / bovine serum albumine (BSA) verzuring 20 beschreven beschreven.
- Onderhouden kort en consistente opname duur (meestal een minuut of hieronder) om ervoor te zorgen dat het vervoer werkt in eerste tarieven omstandigheden. Zorg er ook voor dat alle gebruikte voor opname oplossingen zijn isotone.
- Aan het einde van de opname tijd voorzichtig elimineren het opname medium en was de cellen vier keer met ijskoude fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Voer deze wast zo snel mogelijk (minder dan 10 sec voor de vier van hen is ideaal) lithium uitstroom te voorkomen.
- Lyse van de cellen in 25% salpeterzuur. Breng 250 ui per putje van 25% salpeterzuur en laat het zitten gedurende ten minste 1 uur, daarna schroot elk putje met het uiteinde van de pipet en breng het geheel goed suspensie in een nieuw microcentrifuge buis.
- Breng het lysaat in 1,5 ml microcentrifuge buizen centrifugeer ze gedurende 5 minuten bij 15.000 xg (kamertemperatuur) om de celresten te verwijderen.
- Meet de lithium van de bovenstaande vloeistoffen door atoomabsorptiespectroscopie 21.
OPMERKING: Verschillende bedrijven bieden atomaire absorptie spectrometers, die moeten worden uitgerust met een Lithium holle kathode lamp. Volg de instructies van de fabrikant, zoals deze machines zijn zeer nauwkeurig, maar ook heel delicaat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Selectie:
De H + doden selectie is gebaseerd op de diffusie van de ammonium zwakke base, zoals weergegeven in figuur 1A. Het effect van zwakke basen en zuren diffusie op intracellulaire pH is ontwikkeld door Walter Boron en medewerkers 22. De elegante idee om dit fenomeen te gebruiken voor de productie van een dodelijke verzuring voor positieve genetische selectie werd vervolgens ontwikkeld door Jacques Pouysségur 17. In het kader van een dergelijk protocol, de intracellulaire pH daalt tot ongeveer 5,5 na de spoeling stap. Cellen die niet drukken een functionele NHE bij het plasmamembraan kan een neutrale pH-waarde niet herstellen en tonen een typische aangezuurd aspect met een platte vorm en een korrelige cytosol (Figuur 1B). Na herhaalde selectie cycli (ongeveer twee H + doden procedures / week), cellen die volledig en stabiel overleven verzuring (figuur 1C) ontstaan, met een frequentie van ongeveer 10 -7.Dit resulteert in de vorming van afzonderlijke cellulaire klonen die afzonderlijk kunnen worden gekarakteriseerd of samengevoegd om celpopulaties verkrijgen indien gewenst. Standaard experimenten zoals celoppervlak biotinylering of RNA silencing kan worden uitgevoerd om te controleren of het eiwit expressie in de plasmamembraan inderdaad een intracellulair NHE zoals NHE7 (zie bijvoorbeeld Milosavljevic et al. 18). Eveneens, dient RT-PCR en daaropvolgende sequencing uitgevoerd om te controleren op eventuele mutaties in de sequentie van de intracellulaire NHEs uitgedrukt in de geselecteerde cellijn.
Functionele karakterisering:
Fluorescentie videomicroscopie:
De activiteit en selectiviteit van de ion intracellulaire NHEs uitgedrukt op het plasmamembraan kan worden gekarakteriseerd door het meten van de veranderingen in intracellulaire pH veroorzaakt door deze NHEs in verschillende omstandigheden. Hiervoor is een videomicroscopie set uitgerust met verlichting eend overname instellingen om een beeld van ratiometrisch sonde zoals BCECF / AM wordt geschematiseerd in figuur 2A. Figuur 2B en 2C tonen de typische variaties in fluorescentiewaarden rechtstreeks verkregen voor excitaties bij 490 en 450 nm, na een NH4 + laden van verzuring. Figuur 2D toont de pH-curve verkregen uit deze fluorescentiewaarden volgende gegevens behandeling in 2.4 beschreven).
Lithium Opname:
Samen met waterstof en natrium, lithium omvat een deel van de eerste kolom van het periodiek systeem en blijkt een efficiënte koppeling kation voor Na + / H + wisselaars zijn. Het is mogelijk gebruik te maken van deze informatie aan opstelling snelle kinetiek van lithium opname, om te meten in detail de functionele parameters van Na + / H + wisselaars. Aangezien dit kation afwezig celcytoplasma, haar accumulatie na CYTosolic verzuring wordt kwantitatief weerspiegelen de activiteit van het plasmamembraan NHE. Bovendien kan nanomolair tot picomolaire concentraties van lithium worden gemeten met grote nauwkeurigheid met behulp van atomaire absorptiespectrometrie. Aldus is deze benadering is zeer krachtig in combinatie met de keuze van plasmamembraan uitgedrukt vesiculaire uitwisselaars. Figuur 3 illustreert het meetprotocol in 3 beschreven) van het protocol. Cellen, bij voorkeur geënt op meerdere putjes (6-24) worden aangezuurd zoals eerder beschreven. De kinetische begint met de incubatie van de cellen in medium dat lithium, en de andere kationen of remmers van belang (figuur 3A).
Om de opname te stoppen cellen worden vervolgens vier snelle spoelingen in ijskoude PBS ingediend. Snel te bedienen verwijdert alle extracellulaire lithium, terwijl ervoor te zorgen dat er geen significante lithium efflux optreedt (Figuur 3B). Lithium-concentratie in elk putje wordt vervolgensgemeten met atoomabsorptie spectroscopie (figuur 3C) en uitgangspercentages Lithium opname, die direct leveren de activiteit van de warmtewisselaar bij steady-state verkregen als hellingsgraad metingen van de lithium accumulatie tijdsverloop (Figuur 3D).
Wat enzymkinetiek, kunnen dosis-respons van beginsnelheden worden gebruikt Km waarden voor substraten (figuur 4A) van Ki-waarden leiden voor remmers. Een interessante eigenschap van de vervoerders is dat verschillende koppeling kationen zullen strijden om het vervoer. Dit geeft de mogelijkheid van het meten van de Km voor natrium door competitie met lithium opname (Figuur 4B).
Figuur 1: Selectie van cellen die een intracellulaire Na + / H + </ Strong> uitwisselaar hun plasmamembraan. (A) Strategie voor de drie stappen H + doden selectie van cellen die een functioneel niet-gemuteerde en niet-gelabelde intracellulaire NHE het plasmamembraan. (B) Fase contrast microscopie beeld van PS120 oudercellen om een zuur belasting ingediend. Schaal bar: 25 micrometer (C) fasecontrastmicroscopie beeld van PS120 cellen geselecteerd voor de expressie van een vesiculaire uitwisselaar in de plasmamembraan na een zuurbelasting. Schaalbalk: 25 pm Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Intracellulaire pH metingen (A) Principe van videomicroscopie pH meting.. (B) Evolutie van de geëmitteerde fluorescentie (595 nm) van de BCECF pH probe na excitatie bij 490 nm. L: zuur belasting, Ri; Spoelen, Re: herstel, Cal6.5: kalibratie op een intracellulaire pH van 6,5, Cal7.0: kalibratie op een intracellulaire pH van 7,0 (C) Evolutie van de uitgezonden fluorescentie (595 nm) van het BCECF pH-sonde na een excitatie bij 450 nm. L: zuur belasting, Ri; Spoelen, Re: herstel, Cal6.5: kalibratie op een intracellulaire pH van 6,5, Cal7.0: kalibratie op een intracellulaire pH van 7,0 (D) Evolutie van de intracellulaire pH berekend op basis van de 490/450 nm fluorescentie verhoudingen van de BCECF pH sonde en uit de kalibratie punten. L: zuur belasting, Ri; Spoelen, Re: herstel, Cal6.5: kalibratie op een intracellulaire pH van 6,5, Cal7.0: kalibratie op een intracellulaire pH van 7,0 Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3:. NHE activiteit gemeten door initiële tarieven van Li + opname (A - C) Regeling beeltenis van de verschillende kritische stappen van de meettechniek (D) Voorbeeld van een gemeten tijdsverloop van lithium-opname voor de vesiculaire NHE7 wisselaar uitgedrukt in het plasma membraan. Let op de lineariteit van de kinetische binnen de experimentele omstandigheden, zodat de initiële tarieven meting. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: Typische Dosisresponscurves voor NHE7 (originele gegevens van 18).Beginsnelheid van Lithium opname werden gemeten met behulp van 1 minuut kinetiek. (A) Dosis-responscurve extracellulaire lithium. (B) De concurrentie van verschillende concentraties van extracellulaire natrium op 1mM extracellulaire lithium opname. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol wordt beschreven hoe cellen die intracellulaire Na + / H + uitwisselaars bij de plasmamembraan selecteren zonder dat hun primaire sequentie door plaatsgerichte mutagenese. Deze wisselaars kunnen nu worden gekarakteriseerd.
Deze methode is gebaseerd op de cellulaire toxiciteit van intracellulaire protonen cellijnen die vesiculaire Na + / H + uitwisselaars zal drukken op de plasmamembraan selecteren. Het zou mogelijk zijn in principe andere kationen die worden verdacht worden vervoerd, zoals Li +, K +, of Cs + gebruiken. Echter, dit voegt een extra niveau van onzekerheid. Als de selectie positieve kloon oplevert, dan zal het moeilijk zijn om te beoordelen of het geteste kation niet wordt getransporteerd of de uitwisselaar niet in de plasmamembraan. Daarom zijn selecties uitgevoerd met Na + als koppelmiddel kation aangezien dit het extracellulaire substraten gevonden in de hoogste overvloed in fysiologische omstandigheden. Dit leidde tot de selectie van varianten tot expressie NHE7 18, alsmede NHE6 en NHE9 het plasmamembraan (Poët en Counillon, ongepubliceerde resultaten).
Deze plasmamembraan expressie maakt de meting van de transporteurs functionele parameters door werkwijzen die konden tot nu toe alleen gebruikt voor plasmamembraan transporters. Natuurlijk is het niet mogelijk uit te sluiten dat een dergelijke verandering in membraan milieu kunnen beïnvloeden de functionele kenmerken van de vesiculaire NHEs. Echter, zou deze strategie waard om te gebruiken voor ten minste drie redenen: (i) de intracellulaire expressie van NHE6, 7 en 9 verzet tegen een gedetailleerde functionele meting, (ii) membraan omgevingen en eiwit of lipide partners hebben vooral aangetoond dat invloed subtiele regelgeving mechanismen van de andere NHEs en niet hun fundamentele kenmerken van deze transporters (affiniteiten voor koppeling kationen, selectiviteit, gerichtheid, pharmacological functies). Zo is het zeer waarschijnlijk dat deze onveranderd door het membraan expressie van de vesiculaire NHEs. (Iii) kennen de functionele mechanismen en farmacologische profielen van een plasmamembraan-expressie vesiculaire mechanisme is het dan mogelijk om vesiculaire pH metingen om deze mogelijke verschillen tussen plasmamembraan en vesiculaire expressie pakken.
Een andere potentiële beperking van deze techniek is dat de hier beschreven strategie kan leiden tot de selectie van cellen die andere H + extrusiemechanisme dan de getransfecteerde vesiculaire Na + / H + exchanger (zoals een plasmamembraan NHE, of H + ATPase bijvoorbeeld ). Hoewel het nooit waargenomen in het laboratorium, is het daarom cruciaal klassieke celoppervlak labeling gekoppeld om silencing daadwerkelijk controleren of de NHE plaats inderdaad uitgedrukt op het plasmamembraan en bemiddelt de Na + of Li + et al. 18).
Om de activiteit van deze transporters karakteriseren twee protocollen, respectievelijk gebaseerd op intracellulaire pH variaties en ionfluxen worden beschreven. De eerste werkwijze vereist het gebruik van pH-gevoelige fluorescente probes en voldoende fluorescentie videomicroscopie systeem. Deze methode, die wordt gebruikt door een groot aantal in het veld, is ontwikkeld in de jaren 1980, eerst gebruikt fluorimeters signalen vorm cellen in suspensie 23 meten, vervolgens met behulp van digitale verwerving individuele cellen door het koppelen fluorescentie excitatie en overname videomicroscopie 24 meten. Deze techniek is nu zeer gemakkelijk geworden, vanwege de hoge prestaties van camera, verlichting en computersystemen. Interessant is dat bedrijven bieden meestal zeer informatief technische fiches samen met hun fluorescerende probes. Deze schommelingen in de pH bieden belangrijke informatiede aard van de extracellulaire kationen combinatie met proton efflux bepalen. In dit verband is het belangrijk op te merken dat de duur van de ammonium voorincubatie moet zorgvuldig worden aangepast aan de cellen die voor de metingen. -CCL39 afgeleide fibroblasten, steunen heel goed een uur laden met 50 mM NH 4 Cl. Dit resulteert in een sterke verzuring dat NHE volledige activering maakt en produceert een sterk signaal voor metingen (Vmax omstandigheden). Echter, zouden andere cellen, zoals cardiomyocyten of primaire niercellen geen ondersteuning voor zo'n belangrijke ammonium laden. Het verdient uitvoeren verscheidene voorbereidende onderzoeken met verschillende incubatietijden of NH4 Cl concentraties. De reden voor deze verschillen in gevoeligheid voor NH4Cl niet duidelijk. Zij kan verband houden met de mogelijke expressie van ammonium transportsystemen 25,26. Ook de natriumvrij oplossing wordt gebruikt voor het spoelen van de lading oplossing kan niet worden getolereerddoor cellen, zoals cardiomyocyten bijvoorbeeld. Hoewel beginsnelheden minder nauwkeurig worden bepaald, moet rechtstreeks perfuseren met het herstel oplossing na ammonium laden.
Bovendien intracellulaire pH metingen geven een eenvoudige manier om de reversibele eigenschappen van deze warmtewisselaars als omgekeerde functie onderzoeken, een verzuring die gemakkelijk kan worden gedetecteerd door een afname in de fluorescentie BCECF niveau dat kan worden uitgedrukt als een pH-waarde na ijking produceren . De beperkingen van deze experimenten is het ontbreken van een nauwkeurige kwantificering van transport activiteiten, zoals de experimenten maatregel pH variaties, die werken op een logaritmische schaal en beperkt door intracellulaire buffercapaciteit. De laatste kan worden gemeten en pH variaties vermenigvuldigd met buffercapaciteit opbrengst ionfluxen. Echter, dit proces combineert verschillende experimentele fouten (op pH-metingen, metingen buffercapaciteit, en Calibratie) en is daarom niet sterk kwantitatief. Vandaar om de enzymatische constanten van het plasmamembraan uitgedrukt transporter, snelle ion flux technieken zijn veel eenvoudiger en nauwkeuriger.
Omdat intracellulaire inhoud in het millimolaire bereik detecteren NHE-gemedieerde veranderingen in cytosolisch natrium is niet mogelijk. Voortaan jaren dergelijke opname technieken zijn gebaseerd op het gebruik van radioisotopen zoals 22 Na +. Dit manuscript beschrijft een niet-radioactieve methode die 22 Na + vervangen door lithium, gebaseerd op de grondgedachte dat dit kation, dat ook gebruikt wordt door NHEs, afwezig van cel cytosol en kan worden gemeten met grote nauwkeurigheid met behulp van atomaire absorptiespectrometrie 21. Zodra de juiste omstandigheden (tijd en lithium concentratie) om lineaire opnamen te meten (bijv., Het zijn in de initiële tarieven omstandigheden) worden bepaald, affiniteiten voor de andere potentiële koppeling kationen en / ofremmers kunnen nauwkeurig worden gemeten zoals getoond in figuren 3 en 4. Een laatste mogelijke beperking is dat de lithium-opname methode uiteraard alleen kan functioneren als de wisselaar van de rente aanzienlijk transporteert deze catie. Als dit niet het geval is, zal de onderzoeker moet ofwel afhankelijk bovengenoemde intracellulaire pH metingen of moeten radioactief natrium opname gebruiken.
Een dergelijke reeks experimenten hebben geleid recentelijk geleid tot de waarneming dat de NHE7 intracellulaire Na + / H + exchanger, die aanvankelijk werd aangenomen dat een H + / K + transporter die vesicles zouden alkalinize in feite een endosomale verzuring mechanisme gekoppeld met natrium 18. Dit heeft diepe implicaties voor intracellulaire compartimenten zoals tot nu toe deze rol werd gedacht te worden besteed aan de VH + ATPasen. Aangezien elk lid van de familie NHE blijkt een zeer specifieke kinetische handtekening èvleugel aan zijn fysiologische rol, is het verleidelijk om te veronderstellen dat de karakterisering van NHE6 en NHE9 het gebruik van de in dit artikel beschreven methoden zullen nieuwe en onverwachte mogelijkheden die hun fysiologische functies zullen markeren onthullen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Standard cell culture equipement | Used for H+ killing selection composed of many devices with different catalog numbers | ||
| Incubator with CO2 | Sanyo | MCO15A | |
| Incubator without CO2 | Heraeus instrument | BB6220 | |
| Laminar flow hood PSM1200NF | Fisher | 52010120 | |
| DMEM medium | sigma | D5796 | |
| FBS gold | GE Healthcare | A15-151 | |
| Penicilin/streptomycin | PAA | P11-010 | |
| Trypsin 10x | PAA | L11-003 | |
| Atomic Absorption spectrometer with Zeeman furnace system | Thermo Scientific | ICE 3500 GFZ | |
| LiCl | sigma | L4408 | |
| Nitric Acid | sigma | 438073 | |
| Fluorescence videomicroscopy set | Leica | Composed of many devices with different catalog numbers | |
| Inverted automated microscope | Leica | DMI6000B | |
| microscope stand | leica | 11888906 | |
| 11888911 | |||
| 11505180 | |||
| 11888377 | |||
| incident fluorescence | leica | 11888901 | |
| 11504166 | |||
| motor bracket | leica | 11888379 | |
| 11505234 | |||
| 11521505 | |||
| 11522106 | |||
| LED transmission light | leica | 8097321 | |
| 8102034 | |||
| 11521580 | |||
| motorized plate | leica | 11522068 | |
| 11531172 | |||
| 11521734 | |||
| 11521719 | |||
| 11888423 | |||
| 11888424 | |||
| camera output | leica | 11888373 | |
| 11507807 | |||
| 11888393 | |||
| 11888259 | |||
| 11888258 | |||
| 11541510 | |||
| images acquisition/analysis software | leica | 11888375 | |
| optics | leica | 11506507 | |
| 11506243 | |||
| 11506203 | |||
| fluorescence Xenon lamp | leica | DMI6000 | |
| camera | hamamatsu | 8100601 | |
| metafluor/Mmfluor software | 11640905 | ||
| pH sensitive probe, BCECF-AM | life technologies | B1170 | |
| Nigericin | Sigma | N7143 |
References
- Marshansky, V., Futai, M. The V-type H+-ATPase in vesicular trafficking: targeting, regulation and function. Curr Opin Cell Biol. 20 (4), 415-426 (2008).
- Jentsch, T. J. Chloride and the endosomal-lysosomal pathway: emerging roles of CLC chloride transporters. J Physiol. 578 (3), 633-640 (2007).
- Kornak, U., et al. Mutations in the a3 subunit of the vacuolar H(+)-ATPase cause infantile malignant osteopetrosis. Hum Mol Genet. 9 (13), 2059-2063 (2000).
- Gunther, W., Piwon, N., Jentsch, T. J. The ClC-5 chloride channel knock-out mouse - an animal model for Dent's disease. Pflugers Arch. 445 (4), 456-462 (2003).
- Kasper, D., et al. Loss of the chloride channel ClC-7 leads to lysosomal storage disease and neurodegeneration. Embo J. 24 (5), 1079-1091 (2005).
- Poet, M., et al. Lysosomal storage disease upon disruption of the neuronal chloride transport protein ClC-6. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (37), 13854-13859 (2006).
- Nakamura, N., Tanaka, S., Teko, Y., Mitsui, K., Kanazawa, H. Four Na+/H+ exchanger isoforms are distributed to Golgi and post-Golgi compartments and are involved in organelle pH regulation. J Biol Chem. 280 (2), 1561-1572 (2005).
- Gilfillan, G. D., et al. SLC9A6 mutations cause X-linked mental retardation, microcephaly, epilepsy, and ataxia, a phenotype mimicking Angelman syndrome. Am J Hum Genet. 82 (4), 1003-1010 (2008).
- Mignot, C., et al. Novel mutation in SLC9A6 gene in a patient with Christianson syndrome and retinitis pigmentosum. Brain & Development. 35 (2), 172-176 (2013).
- Morrow, E. M., et al. Identifying autism loci and genes by tracing recent shared ancestry. Science. 321 (5886), 218-223 (2008).
- Lasky-Su, J., et al. Genome-wide association scan of the time to onset of attention deficit hyperactivity disorder. Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet. 147B (8), 1355-1358 (2008).
- Franke, B., Neale, B. M., Faraone, S. V.
- Meda, S. A., et al. A large scale multivariate parallel ICA method reveals novel imaging-genetic relationships for Alzheimer's disease in the ADNI cohort. Neuroimage. 60 (3), 1608-1621 (2012).
- Zhang, L., et al. A microdeletion in Xp11.3 accounts for co-segregation of retinitis pigmentosa and mental retardation in a large kindred. Am J Med Genet A. 140 (4), 349-357 (2006).
- Sardet, C., Franchi, A., Pouysségur, J. Molecular cloning, primary structure, and expression of the human growth factor-activatable Na+/H+ antiporter. Cell. 56 (2), 271-280 (1989).
- Pouyssegur, J., Sardet, C., Franchi, A., L'Allemain, G., Paris, S. A specific mutation abolishing Na+/H+ antiport activity in hamster fibroblasts precludes growth at neutral and acidic pH. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (15), 4833-4837 (1984).
- Franchi, A., Cragoe, E., Pouysségur, J. Isolation and properties of fibroblast mutants overexpressing an altered Na+/H+ antiporter. J Biol Chem. 261 (31), 14614-14620 (1986).
- Milosavljevic, N., et al. The Intracellular Na+/H+ Exchanger NHE7 effects a Na+ coupled, but not K+ coupled proton-loading mechanism in endocytosis. Cell Reports. 7 (3), 1-8 (2014).
- Wigler, M., et al. Transformation of mammalian cells with genes from procaryotes and eucaryotes. Cell. 16 (4), 777-785 (1979).
- Lacroix, J., Poët, M., Maherel, C., Counillon, L. A mechanism for the activation of the Na/H exchanger NHE-1 by cytoplasmic acidification and mitogens. EMBO Reports. 5 (1), 91-96 (2004).
- Milosavljevic, N., et al. Nongenomic Effects of Cisplatin: Acute Inhibition of Mechanosensitive Transporters and Channels without Actin Remodeling. Cancer Res. 70 (19), 7514-7522 (2010).
- Boron, W. F., De Weer, P. Intracellular pH transients in squid giant axons caused by CO2, NH3, and metabolic inhibitors. J Gen Physiol. 67 (1), 91-112 (1976).
- Paradiso, A. M., Tsien, R. Y., Machen, T. E. Na+-H+ exchange in gastric glands as measured with a cytoplasmic-trapped, fluorescent pH indicator. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (23), 7436-7440 (1984).
- Paradiso, A. M., Tsien, R. Y., Machen, T. E. Digital image processing of intracellular pH in gastric oxyntic and chief cells. Nature. 325, 447-450 (1987).
- Quentin, F., et al. RhBG and RhCG, the putative ammonia transporters, are expressed in the same cells in the distal nephron. J Am Soc Nephrol. 14 (3), 545-554 (2003).
- Geyer, R. R., Musa-Aziz, R., Enkavi, G., Mahinthichaichan, P., Tajkhorshid, E., Boron, W. F. Movement of NH3 through the human urea transporter B: a new gas channel. Am J Physiol Renal Physiol. 304 (12), F1447-F1457 (2013).
