Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

إصابة سفينة الميكانيكية في الزرد الأجنة

Published: February 17, 2015 doi: 10.3791/52460
Automatic Translation
1, 1
1Cardiovascular Research Institute, University of California

Protocol

وتمت الموافقة على إجراءات باستخدام الزرد التي كتبها المؤسسي رعاية الحيوان UCSF واللجنة الاستخدام: ملاحظة.

1. إعداد أدوات

  1. إدراج التفاصيل التافهة دبوس إلى حامل دبوس المشبك ودبوس.
  2. باستخدام ملقط غيض غرامة، وثني بعناية غيض من دبوس لخلق هوك طفيف.
  3. للتلاعب واستقرار الجنين أثناء الإصابة، ثني نهاية 28 GUAGE ½ بوصة إبرة شنت على حقنة الأنسولين باستخدام كماشة الإبر الأنف.

2. إعداد الزرد الأجنة للإصابة

  1. إعداد أزواج تربية الزرد وجمع البيض في الماء البيض (60ug / مل الأملاح الحوض) كما هو موضح سابقا (22).
  2. إضافة 0.003٪ N-الفنيل (PTU) إلى الماء البيض عندما الأجنة ما يقرب من 8 ساعات ما بعد الإخصاب (HPF) لمنع التصبغ.
  3. Dechorionate اثنين الإخصاب آخر يوم (إدارة الشرطة الاتحادية) الأجنة قبل التجربة باستخدام ملقط غيض غرامة.
  4. تخدير الأجنة مع 0.02٪ مخزنة حامض 3-أمينوبنزويك (تريكين) حوالي 10 دقيقة قبل التلاعب.

3. السفينة الميكانيكية إصابة الأجنة

  1. نقل الأجنة تخدير إلى شريحة الاكتئاب على stereomicroscope تشريح باستخدام الماصة نقل.
  2. استخدام الجانب المسطح قصيرة من إبرة حقنة لمعالجة الجنين مع اليد المهيمنة، ضع الجنين على جانبها مع السطح البطني تواجه بعيدا عن إبرة.
  3. وضع دبوس التفاصيل التافهة مع طرف وأشار مباشرة ضد السطح البطني للالخلفي الأسماك لافتتاح البولي التناسلي. وضع دبوس التفاصيل التافهة في زاوية طفيف بحيث غيض المنحني قادر على يخترق من خلال محيط بالأدمة مباشرة في الوريد الذيلية (الشكل 1 </ قوي>).
  4. باستخدام إبرة حقنة لمعالجة الجنين، يخترق الوريد الذيلية مع دبوس التفاصيل التافهة من خلال الاستفادة من الجنين إلى دبوس لربط قليلا من دبوس في الوريد.
  5. باستخدام إبرة حقنة، وسحب الجنين بعيدا عن دبوس التفاصيل التافهة لخلق تمزق صغير في السفينة.
    ملاحظة: سوف اصابة ناجحة تؤدي إلى نزيف فوري من الوريد.

4. تحليل الإرقاء

  1. اختيار الأجنة الوحيدة مع تعميم واضح خلايا الدم لهذا الإجراء.
  2. الاستعداد لبدء الموقت في أقرب وقت يتم سحبها دبوس التفاصيل التافهة من السفينة.
  3. بدء موقت في أقرب وقت فقدان الدم يمكن تصور من الجرح. عندما فقدان الدم من الجرح تتوقف، إيقاف الموقت وتسجيل الوقت الإجمالي كما نزيف الوقت. إذا تخثر هو تحول دون، تسجل الوقت إلى حين لم يعد هناك بشكل واضح خلايا الدم.

5. تحليل التئام الجروح

  1. نقل نقاط البيعالحيوانات تي إصابة على أطباق التصوير الزجاج السفلي للفحص المجهري.
  2. إزالة الغالبية العظمى من المياه البيض.
  3. تغطية الأجنة في 0،3-1،2٪ انصهار منخفضة المنحل الاغاروز في الماء البيض، ساخنة إلى ما بين 42 و 45 درجة مئوية وتستكمل مع 0.02٪ تريكين.
  4. الأجنة الموقف على الجانبين باستخدام ملقط.
  5. بعد يبرد الاغاروز، وملء الطبق مع 0.02٪ تريكين في الماء البيض.
  6. الحصول على صور باستخدام brightfield، epifluorescence، أو المجهري متحد البؤر.
  7. إزالة الجنين من الاغاروز باستخدام ملقط ونقل مرة أخرى إلى المياه البيض.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم تنفيذ إصابة سفينة الميكانيكية في 2 DPF الأجنة (الشكل 2A - C). النتائج إصابة في استجابة سريعة وموثوق بها تخثر مقاسا الوقت لوقف النزيف (الشكل 2D). لتحديد ما إذا كان الاختلاف في الاستجابة التخثر يمكن قياسها، كانت تدار من هيرودين تخثر إلى الأجنة عن طريق الحقن في القناة كوفييه على الفور قبل اصابة (5-10 NL من 1 وحدة لكل ميكرولتر هيرودين المذاب في الماء) (لل مظاهرة من الحقن في القناة كوفييه، انظر المادة السابقة إن الرب 23) 24. إدارة هيرودين قبل الاصابة أدى إلى زيادة كبيرة نزيف مرات مقابل السيطرة على السيارة (الشكل 2D).

ويمكن رؤية دليل على السفينة الضرر وتجلط الدم على الفور بعد الإصابة باستخدام خطوط المعدلة وراثيا لالبطانية (kdrl: EGFP) وخلايا الدم الحمراء (gata1a: dsred 25،26. تم الحصول على الصور بالتتابع كل 5 دقائق لفترة 12 ساعة باستخدام epifluorescence. لا يزال يتم عرض ممثل الصور طوال مراحل مختلفة من إصلاح الجرح (الشكل 3). باستخدام مزيج من النقيض تدخل الفرق (DIC) ومضان المجهري، فمن الممكن لقياس المعلمات متميزة من إصلاح الجرح. من أجل تحديد ما إذا كان أو لم يكن إصلاح الجرح يتبع نمطا استنساخه عبر التجارب، تم قياس الوقت لإعادة تأسيس تدفق الدم في 4 مجموعات من الأسماك. وأسفرت إصابة سفينة في رد النمطية موثوقة من 253 ± 16 دقيقة لإعادة تدفق الدم من خلال الأوعية الجرحى (ن = 4-5 الأسماك في التجربة، ومتوسط ​​± SEM).

الشكل (1)
الشكل 1: رسم تخطيطي ل2 DPF الجنين تظهر وضع التفاصيل التافهة دبوس للالاداء orming إصابة الميكانيكية من الوريد الذيلية (CV). المظللة مقصورة الأوعية الدموية في الرمادي.

الشكل 2
الشكل 2: نزيف الأوقات يمكن قياس البصر بعد الإصابة الميكانيكية اللقطات من الفيديو في الوقت الحقيقي من إصابة سفينة الزرد في 2 DPF الأجنة. وتظهر الصور في وقت وقوع الضرر (A)، وخلال فقدان الدم النشطة من الجرح (B)، وبعد التوقف عن فقدان الدم (C). جميع الأوقات المشار إليها هي في ثوان. موجهة الأجنة أفقيا مع الأمامي في أعلى وبطني سطح تواجه إلى اليسار. مقياس شريط 100 ميكرون. أدت إدارة هيرودين تخثر إلى زيادة كبيرة نزيف مرات مقابل السيطرة على السيارة (D) (P <0.0001، اختبار t الطالب).خريج "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل (3): تصور إصابة الميكانيكية وإصلاح باستخدام علامات المعدلة وراثيا اللقطات من timelapse DIC ومضان المجهر بعد إصابة سفينة باستخدام علامات لبطانة الأوعية الدموية (kdrl: EGFP) وخلايا الدم الحمراء (gata1a: dsred) في 2 DPF الأجنة. وأظهرت لقطات فجوة في السفن وتراكم المحلي الدم الحمراء خلايا (T = 25)، وإصلاح جزئي مع أعادت تدفق الدم (ر = 210)، وترميم ما يبدو كاملة من هيكل السفينة العادي (ر = 615). يشار الوقت بالدقائق. موجهة الأجنة أفقيا مع الأمامي في أعلى وبطني سطح تواجه إلى اليسار. * يشير إلى موقف من الشريان الأبهر الظهري. إصابة (رأس السهم) عطلت الوريد الذيلية وجزء من الضفيرة الذيلية. سلممنع 25 ميكرون.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وقد استخدمت بنجاح الزرد كنموذج لأنواع مختلفة من الجروح بما في ذلك الضرر الليزر 13-15، التي يسببها الليزر تخثر 16، والظهارية اصابة 10. نحن التقرير وسيلة لإصابة الميكانيكية التي هي بسيطة لتنفيذ وتنتج الإصابة التي تسيطر عليها في نموذج في الجسم الحي التي هي قابلة للغاية لفي الوقت الحقيقي المجهري. النتائج إصابة في رد مرقئ سريعة وقابلة للقياس وبرنامج إصلاح الجرح استنساخه التي يمكن رصدها باستخدام الفيديو وtimelapse المجهري.

من تشريح بسيط والنمطية الأوعية الدموية، والذي يسمح إصابة استنساخه في موقع محدد والوصول مجهريا، ووجود معظم الأوعية الدموية وأنواع الخلايا المكونة للدم جعل الأجنة الزرد مفيدة بشكل خاص لدراسة الردود على الاصابة. ومع ذلك، الأجنة الزرد لا تملك الخلايا الليمفاوية وظيفية خلال الأسابيع الأولى من تطوير 5،6، مما يجعل هذا النظام معظم ا ف بمالئمة لدراسة مساهمة المناعة الفطرية في التهاب والإصلاح. في الوقت الحاضر، ومجموعة متنوعة واسعة من الزرد المعدلة وراثيا موجودة مع علامات للخلايا والبروتينات التي تشارك في تكوين خثرة، تجلط الدم، والالتهابات، وإصلاح الجرح، بما في ذلك الخطوط التي تسمية thrombocytes، الفيبرينوجين، الكريات الحمراء، الكريات البيض والبطانة الوعائية 17،21،25- 31. وينبغي لهذه وغيرها من الأدوات تجعل من الممكن لمتابعة العمليات التي ينطوي عليها الارقاء وإصلاح بالتفصيل كبير.

إصابة الميكانيكية تكمل إصابة الليزر لدراسة الارقاء في الزرد. بينما الإصابة التي يسببها الليزر وقد استخدمت لسنوات لتحريك تشكيل خثرة في الأجنة الزرد ونماذج الماوس، والآليات التي الإصابة الليزر مشغلات التخثر وتفعيل الصفيحات / الصفائح الدموية ليست معروفة تماما 16،32. تقدم إصابة الميكانيكية طريقة ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية للحمل تخثر الأوعية الدموية عن طريق خرق و، ويفترض،الأنسجة عامل يعتمد بدء عملية تجلط تتالي. هذا الاكتشاف أن العلاج هيرودين زيادة كبيرة الأوقات النزيف بعد إصابة تشير إلى أن هذا النموذج هو تعتمد على الثرومبين. إصابة الميكانيكية بالإضافة إلى ذلك تكمل إصابة الليزر من خلال توفير تعطل كاف من أحد الأوعية الدموية لتوفير فرصة لمتابعة إصلاح السفينة. وقد استخدمت الدراسات السابقة بنجاح إصابة الميكانيكية التي كتبها شق مشرط وثقب إبرة لإظهار الاختلافات في النزيف مرات في ظروف الدوائية وراثي التلاعب 19،33. إصابة التفاصيل التافهة دبوس المستخدمة في النموذج الحالي قد تكمل النماذج إصابة أخرى من خلال توفير إصابة أكثر استنساخه نظرا لحجم صغير ومحددة من الجرح أنها تنتج وتوفير فرصة لدراسة أفضل إعادة الاستقناء وإصلاح السفن.

وقد ثبت الظهارية اصابة في الزرد أن تكون نموذجا قويا لدراسة التهاب الجرح وإصلاح 10. القدرة علىإدخال يوفر إصابة الأوعية الدموية فرصة لتقييم إصلاح الجروح أكثر تعقيدا في إعدادات حيث يوفر الفيبرين يتم مسح مؤقت المصفوفة، الجلطة الدموية والحطام، والأوعية التجدد. كما تشارك هذه العمليات في إصلاح الأنسجة الطبيعي والالتهاب الحاد والمزمن وأمراض الأوعية الدموية، وينبغي لهذه الطريقة تساعد على نموذج جوانب الأمراض التي تصيب البشر في نظام حيث يمكن مراقبة السلوكيات الخلوية في الوقت الحقيقي في نموذج حيواني كله.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Minutia Pins Fine Science Tools 26002-10 Tip diameter 0.0125 mm, rod diameter 0.1 mm
Pin Holder Fine Science Tools 26016-12
Dumont #5 Fine Tip Forceps Fine Science Tools 11254-20
Glass Depression Slide Aquatic Eco-Systems M30
Low Melting Agarose Lonza  50081 Preheated to 42 º C
N-Phenylthiourea (PTU) Sigma Aldrich P7629
3-aminobenzoic acid (Tricaine) Sigma Aldrich E10521
Hirudin Sigma Aldrich H7016
Glass bottom imaging dishes Mattek P35G-1.5-14-C
Dissecting microscope Olympus SZH10
Fluorescence microscope Zeiss Axio Observer
Aquarium salts Instant Ocean
Insulin syringe with 28.5 G needle Becton Dickinson  329461

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gore, A. V., Monzo, K., Cha, Y. R., Pan, W., Weinstein, B. Vascular development in the zebrafish. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (5), a006684 (2012).
  2. Boatman, S., et al. Assaying hematopoiesis using zebrafish. Blood Cells Mol Dis. 51 (4), 271-276 (2013).
  3. Ellett, F., Lieschke, G. J. Zebrafish as a model for vertebrate hematopoiesis. Curr Opin Pharmacol. 10 (5), 563-570 (2010).
  4. Liu, J., Stainier, D. Y. Zebrafish in the study of early cardiac development. Circ Res. 110 (6), 870-874 (2012).
  5. Traver, D., et al. The zebrafish as a model organism to study development of the immune system. Adv Immunol. 81, 253-330 (2003).
  6. Lieschke, G. J., Trede, N. S. Fish immunology. Curr Biol. 19 (16), R678-R682 (2009).
  7. Lesley, R., Ramakrishnan, L. Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish. Curr Opin Microbiol. 11 (3), 277-283 (2008).
  8. Oehlers, S. H., et al. A chemical enterocolitis model in zebrafish larvae that is dependent on microbiota and responsive to pharmacological agents. Dev Dyn. 240 (1), 288-298 (2011).
  9. Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends Genet. 29 (11), 611-620 (2013).
  10. LeBert, D. C., Huttenlocher, A. Inflammation and wound repair. Semin Immunol. , (2014).
  11. Henry, K. M., Loynes, C. A., Whyte, M. K., Renshaw, S. A. Zebrafish as a model for the study of neutrophil biology. J Leukoc Biol. 94 (4), 633-642 (2013).
  12. Niethammer, P., Grabher, C., Look, A. T., Mitchison, T. J. A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish. Nature. 459 (7249), 996-999 (2009).
  13. Rosenberg, A. F., Wolman, M. A., Franzini-Armstrong, C., Granato, M. In vivo nerve-macrophage interactions following peripheral nerve injury. J Neurosci. 32 (11), 3898-3909 (2012).
  14. Otten, C., Abdelilah-Seyfried, S. Laser-inflicted injury of zebrafish embryonic skeletal muscle. J Vis Exp. (71), e4351 (2013).
  15. Matrone, G., et al. Laser-targeted ablation of the zebrafish embryonic ventricle: a novel model of cardiac injury and repair. Int J Cardiol. 168 (4), 3913-3919 (2013).
  16. Jagadeeswaran, P., Carrillo, M., Radhakrishnan, U. P., Rajpurohit, S. K., Kim, S. Laser-induced thrombosis in zebrafish. Methods Cell Biol. 101, 197-203 (2011).
  17. Vo, A. H., Swaroop, A., Liu, Y., Norris, Z. G., Shavit, J. A. Loss of fibrinogen in zebrafish results in symptoms consistent with human hypofibrinogenemia. PLoS One. 8 (9), e74682 (2013).
  18. Liu, Y., et al. Targeted mutagenesis of zebrafish antithrombin III triggers disseminated intravascular coagulation and thrombosis, revealing insight into function. Blood. , (2014).
  19. Jagadeeswaran, P., Liu, Y. C. A hemophilia model in zebrafish: analysis of hemostasis. Blood Cells Mol Dis. 23 (1), 52-57 (1997).
  20. Jagadeeswaran, P., Gregory, M., Day, K., Cykowski, M., Thattaliyath, B. Zebrafish: a genetic model for hemostasis and thrombosis. J Thromb Haemost. 3 (1), 46-53 (2005).
  21. Lin, H. F., et al. Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish. Blood. 106 (12), 3803-3810 (2005).
  22. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
  23. Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. J Vis Exp. (61), (2012).
  24. Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P. Analysis of blood coagulation in the zebrafish. Blood Cells Mol Dis. 25 (3-4), 3-4 (1999).
  25. Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish. Development. 132 (23), 5199-5209 (2005).
  26. Traver, D., et al. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nat Immunol. 4 (12), 1238-1246 (2003).
  27. Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev Biol. 248 (2), 307-318 (2002).
  28. Renshaw, S. A., et al. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
  29. Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Dev Biol. 7, 48 (2007).
  30. Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), e49-e56 (2011).
  31. Gray, C., et al. Simultaneous intravital imaging of macrophage and neutrophil behaviour during inflammation using a novel transgenic zebrafish. Thromb Haemost. 105 (5), 811-819 (2011).
  32. Bellido-Martin, L., Chen, V., Jasuja, R., Furie, B., Furie, B. C. Imaging fibrin formation and platelet and endothelial cell activation in vivo. Thromb Haemost. 105 (5), 776-782 (2011).
  33. Bielczyk-Maczynska, E., et al. A loss of function screen of identified genome-wide association study Loci reveals new genes controlling hematopoiesis. PLoS Genet. 10 (7), e1004450 (2014).

Tags

علم الأحياء التنموي، العدد 96، الزرد، الارقاء، وإصابة الأوعية الدموية، والتئام الجروح، والالتهابات، المجهر
إصابة سفينة الميكانيكية في الزرد الأجنة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Clay, H., Coughlin, S. R. Mechanical … More

Clay, H., Coughlin, S. R. Mechanical Vessel Injury in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (96), e52460, doi:10.3791/52460 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter