פגיעה כלי מכאנית בעוברי דג הזברה

Protocol

הערה: נהלי שימוש בדג זברה אושרו על ידי הטיפול בבעלי חיים המוסדי של קליפורניה בסן פרנסיסקו וועדת שימוש.

1. הכנת כלים

1. הכנס סיכת פרטים קטנה לבעל סיכה ומהדק את הסיכה.
2. בעזרת מלקחיים טיפ נאה, לכופף בזהירות את קצה הפין כדי ליצור וו קל.
3. למניפולציה וייצוב של העובר במהלך פציעה, תכופף את הקצה של מד 28 ½ מחט אינץ 'רכובה על מזרק אינסולין באמצעות צבת מחט-האף.

2. הכנת עוברי דג הזברה לפגיעה

1. הגדרת זוגות רבייה דג הזברה ולאסוף ביצים במי ביצה (60ug / מלחי אקווריום מ"ל) כפי שהוצג קודם ^22.
2. להוסיף 0.003% N-Phenylthiourea (PTU) למים ביצה כאשר הם עובר כ -8 שעות לאחר הפריה (hpf) כדי למנוע melanization.
3. עובר dechorionate שתי פוסט יום הפריה (DPF) לפני הניסוי באמצעות מלקחיים טיפ נאה.
   
4. להרדים את העוברים עם 0.02% חומצה שנאגרו 3-aminobenzoic (Tricaine) כ 10 דקות לפני מניפולציות.

3. כלי מכניים פגיעה של עוברים

1. העבר את העוברים בהרדמה לשקופית דיכאון בסטראו לנתח באמצעות pipet העברה.
2. בצד החלק הקצר של מחט המזרק כדי לתפעל את העובר עם היד הדומיננטית, למקם את העובר בצד שלה עם משטח הגחון מול מן המחט.
3. מקם את הפינים הפרטים הקטנים עם הקצה מחודד ישירות על משטח הגחון של הדגים האחוריים לפתיחה ואברי המין. מקם את הפינים פרטים הקטנים בזווית קלה, כך שהקצה המעוגל הוא מסוגל לחדור מבעד periderm ישירות לוריד הזנב (איור 1 </ Strong>).
4. שימוש במחט המזרק כדי לתפעל את העובר, לנקב את וריד הזנב עם סיכת הפרטים הקטנה על ידי הקשה על העובר לסיכה להתחבר הסיכה לתוך הווריד מעט.
5. שימוש במחט המזרק, למשוך את העובר מפיני הפרטים הקטנים כדי ליצור קרע קטן בכלי.
   הערה: פגיעה מוצלחת תגרום לדימום מיידי מהווריד.

4. ניתוח של עצירת דימום

1. בחר עוברים רק עם בעליל תאי דם להליך זה.
2. הכן להתחיל את הטיימר בהקדם סיכת הפרטים הקטן היא משכה מהספינה.
3. להפעיל את הטיימר בהקדם איבוד דם יכול להיות דמיין מהפצע. כאשר איבוד דם מהפצע מפסיק, לעצור את שעון העצר ולהקליט זמן כולל שזמן דימום. אם הקרישה היא עכבות, להקליט את הזמן כאשר יש כבר לא נראה תאי דם במחזור.

5. ניתוח של ריפוי פצעים

1. העברת קופהבעלי חיים לא-פגיעה על מנות הדמיה זכוכית תחתונה למיקרוסקופיה.
2. הסר את רוב המים הביצה.
3. מכסה את העוברים ב.3-1.2% התכה נמוכה המומסים agarose במי ביצה, מחוממים לבין 42 ו -45 מעלות צלזיוס ותוספת של 0.02% Tricaine.
4. עוברי עמדה על צדם באמצעות מלקחיים.
5. לאחר agarose מתקרר, למלא את הצלחת עם Tricaine 0.02% במי ביצה.
6. לרכוש תמונות באמצעות brightfield, epifluorescence, או confocal.
7. הסר עובר מן agarose באמצעות מלקחיים ולהעביר חזרה למי ביצה.

Representative Results

פגיעת כלי מכאנית בוצעה על 2 DPF עוברים (איור 2 א - ג). תוצאות פציעה בתגובת קרישה מהירה ואמינה, כפי שנמדדו על ידי זמן הפסקת דימום (איור 2 ד). כדי לקבוע אם או לא הבדלים בתגובת הקרישה ניתן היו למדוד, הירודין נוגד הקרישה היה מנוהל לעוברים על ידי הזרקה לתוך Duct של קיביה מייד לפני פציעתם (5-10 NL של יחידה 1 לμl הירודין מומס במים) (ל הפגנה של זריקות לDuct של קיביה, ראה מאמר יופיטר קודם ^{23) 24.} הממשל של הירודין לפני פציעה גרם לעלייה משמעותית בדימום פעמים לעומת שליטה ברכב (איור 2 ד).

עדות לניזק ספינה וקרישה ניתן לראות מייד לאחר פציעה באמצעות קווים מהונדסים לאנדותל (kdrl: egfp) ותאי דם אדומים (gata1a: DsRed 25,26. תמונות נרכשו ברצף כל 5 דקות לתקופה 12 שעות באמצעות epifluorescence. נציג עדיין תמונות מוצגות ברחבי שלבים שונים של תיקון פצע (איור 3). באמצעות שילוב של התערבות ההפרש לעומת זאת (DIC) ומיקרוסקופ פלואורסצנטי, ניתן למדוד פרמטרים שונים של תיקון פצע. כדי לקבוע אם או לא תיקון פצע אחרי דפוס לשחזור פני ניסויים, הזמן מחדש את זרימת דם נמדד ב -4 קבוצות של דגים. פגיעת כלי הביאה תגובה אמינה סטריאוטיפית של 253 ± 16 דקות להקמתה מחדש של זרימת דם בכלי הפצוע (n = 4-5 דגים בכל ניסוי, ממוצע ± SEM).

איור 1: תרשים של עובר 2 DPF מראה מיקום של פינים פרטים קטנים לPerf orming פגיעה מכאנית של וריד הזנב (CV). תא דם מוצל באפור.

איור 2: פעמים דימום ניתן למדוד באופן חזותי לאחר פגיעה מכאנית סטילס מוידאו בזמן אמת של פגיעת כלי דג הזברה על 2 DPF עוברים.. תמונות מוצגות בעת פציעה (), במהלך איבוד דם מהפצע פעיל (B), ולאחר ההפסקה של איבוד דם (C). כל הזמנים שצוינו הם בשניות. עוברים מכוונים רוחבי עם קדמי במשטח עליון וגחון מול לשמאל. בר סולם 100 מיקרומטר. מנהל של הירודין נוגד הקרישה הוביל לעלייה משמעותית בזמני דימום לעומת שליטה ברכב (D) (p <0.0001, מבחן t).pg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3:. לדמיין פגיעה מכאנית ותיקון באמצעות סמנים מהונדסים סטילס מtimelapse DIC ומיקרוסקופ פלואורסצנטי לאחר פציעת הכלי באמצעות סמנים להאנדותל של כלי דם (kdrl: egfp) ותאי דם אדומים (gata1a: DsRed) ב 2 DPF עוברים. תמונות הראו פער בכלים והצטברות מקומית דם אדום תא (t = 25), תיקון חלקי עם זרימה הוקם מחדש דם (t = 210), ושחזור של מבנה נורמלי כלי (t = 615) מלא כנראה. זמן מצויינים בדקות. עוברים מכוונים רוחבי עם קדמי במשטח עליון וגחון מול לשמאל. * מציין את המיקום של אב העורקים הגב. הפציעה (ראש החץ) שיבש את הווריד וחלק ממקלעת הזנב הזנב. Scaleבר 25 מיקרומטר.

Discussion

דג הזברה שימשה בהצלחה כמודל לסוגים שונים של פצעים כולל פציעת לייזר ^13-15, פקקת מושרה לייזר ^16, ופצע ¹⁰ אפיתל. אנו מדווחים על שיטה של פציעה מכאנית שהיא פשוט לביצוע ומייצר פציעה מבוקרת במודל in vivo כי הוא נוח מאוד למיקרוסקופיה בזמן אמת. תוצאות פציעה בתגובה לעצרת דם מהירה וניתן למדידה ותכנית תיקון פצע שחזור שניתן לנטר באמצעות מיקרוסקופ וידאו וtimelapse.

האנטומיה שלהם פשוטה והסטריאוטיפית של כלי דם, המאפשרת פגיעה לשחזור באתר מוגדר ומיקרוסקופי נגיש, ואת הנוכחות של רוב כלי דם וסוגי hematopoietic תא להפוך את עוברי דג הזברה שימושיים במיוחד ללימוד תגובות לפציעה. עם זאת, אין לי עוברי דג הזברה לימפוציטים פונקציונליים בשבועות הראשונים של התפתחות ^5,6, מה שהופך את רוב ap המערכת זוpropriate ללימוד התרומה של חסינות מולדת בדלקת ותיקון. נכון לעכשיו, במגוון רחב של דג הזברה מהונדס קיים עם סמנים לתאים וחלבונים המשתתפים בהיווצרות קריש דם, קרישה, דלקת, ותיקון פצע, כולל קווים שתווית טרומבוציטים, פיברינוגן, אריתרוציטים, כדוריות דם לבנות והאנדותל של כלי דם ^{17,21,25- 31.} כלים אלה ואחרים צריכים לעשות את זה אפשר לעקוב אחר התהליכים מעורבים בעצירת דימום ותיקון בפירוט משמעותי.

פגיעה מכאנית משלימה פציעת לייזר לחקר עצירת הדימום בדג זברה. בעוד פגיעה הנגרם לייזר הייתה בשימוש כבר שנים כדי לעורר היווצרות קרישי דם בעוברי דג הזברה ומודלים של עכברים, מנגנונים שבאמצעותם פגיעת לייזר מפעילה קרישה והפעלת thrombocyte / טסיות דם אינן ידועות במלואם ^16,32. פגיעה מכאנית מספקת שיטה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית לגרימת קרישה על ידי הפרת כלי דם ו, ככל הנראה,רקמות גורם תלוי ייזום של מפל קרישה. הממצא שטיפול הירודין גדל באופן משמעותי פעמים דימום לאחר פציעה מצביע על כך שמודל זה הוא תרומבין תלוי. פגיעה מכאנית בנוסף משלימה פציעת לייזר על ידי מתן לתת הזדמנות למעקב תיקון כלי הפרעה מספקת של כלי דם. מחקרים קודמים השתמשו בהצלחה פגיעה מכאנית על ידי חתך אזמל ולנקב מחט להראות הבדלים בדימום פעמים בתנאים של מניפולציה תרופתית וגנטית ^19,33. פציעת סיכת פרטים הקטנה ששמשה במודל הנוכחי עשויה להשלים מודלים פציעה אחרים על ידי מתן פגיעה לשחזור יותר בשל הגודל הקטן ומוגדר של הפצע שהיא מייצרת ועל ידי מתן הזדמנות ללמוד recanalization כלי ותיקון טוב יותר.

אפיתל פצע בדג הזברה הוכיח להיות מודל רב עוצמה ללימוד דלקת ופצע תיקון ^10. היכולתלהציג את פציעה של כלי דם מספקת הזדמנות להעריך תיקון של יותר פצעים מורכבים בהגדרות בי הפיברין מספק מטריקס, thrombi ופסולת זמניים נמחקים, וכלי להתחדש. כתהליכים אלה להשתתף בתיקון רקמות נורמלי ובדלקת אקוטית וכרונית ופתולוגיה של כלי הדם, בשיטה זו אמורה לעזור לדגמן היבטים של מחלה אנושית במערכת שבה ניתן לנטר התנהגויות סלולריות בזמן אמת במודל חיה שלם.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Minutia Pins	Fine Science Tools	26002-10	Tip diameter 0.0125 mm, rod diameter 0.1 mm
Pin Holder	Fine Science Tools	26016-12
Dumont #5 Fine Tip Forceps	Fine Science Tools	11254-20
Glass Depression Slide	Aquatic Eco-Systems	M30
Low Melting Agarose	Lonza	50081	Preheated to 42 º C
N-Phenylthiourea (PTU)	Sigma Aldrich	P7629
3-aminobenzoic acid (Tricaine)	Sigma Aldrich	E10521
Hirudin	Sigma Aldrich	H7016
Glass bottom imaging dishes	Mattek	P35G-1.5-14-C
Dissecting microscope	Olympus	SZH10
Fluorescence microscope	Zeiss	Axio Observer
Aquarium salts	Instant Ocean
Insulin syringe with 28.5 G needle	Becton Dickinson	329461