Protocol
참고 : 제브라 피쉬를 사용하는 절차는 UCSF의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.
도구 1. 준비
- 핀 홀더에 특징점 핀을 삽입하고 핀을 고정.
- 좋은 팁 집게를 사용하여 조심스럽게 약간의 훅을 만들기 위해 핀의 끝을 구부리십시오.
- 조작 부상 중에 배아 안정화, 펜치를 이용한 인슐린 주사기에 장착 ½ 인치 28 게이지 바늘 끝을 구부리.
부상에 대한 제브라 피쉬 배아 2. 준비
- 제브라 피쉬의 번식 쌍을 설정하고 이전에 (22)과 같이 계란 물 (60ug / mL의 수족관 염)에서 계란을 수집합니다.
- 배아는 약 melanization을 방지하기 위해 8 시간 포스트 수정 (HPF) 때 달걀 물에 0.003 % N-페닐 티오 (PTU)를 추가합니다.
- 좋은 팁 집게를 사용하기 전에 실험에 Dechorionate 이일 포스트 수정 (DPF) 배아.
- 0.02 % 버퍼링 -3- 아미노 벤조산 (Tricaine) 조작 이전에 약 10 분으로 배아를 마취.
3. 기계 선박 태아의 부상
- 전송 피펫을 사용하여 해부 실체 현미경에 우울증 슬라이드에 마취 된 배아를 전송합니다.
- 지배적 인 손으로 배아를 조작 주사기 바늘의 짧은 평평한면을 사용하여, 바늘에서 떨어져 대향 복부 표면과 측면에 위치 배아.
- 팁과 특징점 핀이 비뇨 생식기 개방에 물고기 후방의 복부 표면에 직접 지적 놓습니다. 약간의 각도에서 특징점 핀의 위치를 같은 곡선 팁은 꼬리 정맥 (그림 1 <에 직접 주피 관통 할 수 있는지/ strong>을).
- 배아를 조작 주사기 바늘을 이용하여 정맥 내로 약간 핀 후크 핀에 배아를 두드려 특징점 핀 꼬리 정맥을 관통.
- 주사기 바늘을 이용하여 용기 내의 작은 눈물을 만들 떨어진 특징점 핀으로부터 배아를 당긴다.
주 : 성공적인 부상 정맥에서 즉시 출혈이 발생합니다.
지혈 4. 분석
- 눈에 띄게이 절차 혈액 세포를 순환 만 배아를 선택합니다.
- 즉시 특징점 핀이 용기로부터 인출 될 때 타이머를 시작하도록 준비한다.
- 즉시 출혈량 상처 시각화 될 수 타이머를 시작. 상처에서 출혈이 중단되면, 타이머를 중지하고 출혈 시간으로 총 시간을 기록한다. 응고 억제하면 더 이상 가시적 순환 혈액 세포가 없을 때까지의 시간을 기록한다.
상처 치유 5. 분석
- 전송 POS현미경 유리 바닥 이미징 요리 상 t-부상 동물.
- 계란 물의 대부분을 제거합니다.
- ºC (42) 사이에 45로 가열하고 0.02 % Tricaine 보충 아가로 오스 계란 물에 용해 0.3-1.2 % 저 융점의 배아를 커버.
- 집게를 사용하여 자신의 양쪽에 위치 배아.
- 아가로 오스의 온도가 내려 가면, 달걀 물에 0.02 %의 Tricaine와 접시를 채운다.
- 시야, 표면 형광 또는 공 초점 현미경을 사용하여 이미지를 획득.
- 집게를 사용하여 아가로 오스에서 배아를 제거하고 달걀 물로 다시 전송합니다.
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Representative Results
기계 혈관 손상은 배아 (- C도 2A), DPF (2) 상에 수행 하였다. 신속하고 신뢰성있는 응집 부상 응답 결과 (도 2D)를 출혈 중단 시간에 의해 측정. 응고 반응의 차이를 측정 할 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 항응고제 히 루딘은 (대 직전 (5-10 NL을 물에 용해 히 루딘 μL 당 1 단위)을 상처에 퀴비에의 덕트 내로 주입하여 배아 투여했다 퀴비에의 덕트에 주사의 데모는, 이전 조브 제 23 조) (24)을 참조하십시오. 부상 이전에이 결과 히 루딘의 관리는 크게 차량 제어 (그림 2D)에 비해 배 출혈 증가했다.
(: EGFP kdrl) 및 적혈구 (gata1a : 혈관 손상과 응고의 증거는 내피 세포에 대한 유전자 변형 라인을 사용하여 즉시 후 부상을 볼 수는 DsRed (25), (26) 마커. 표면 형광 이미지를 순차적으로 사용하여 12 시간 동안 5 분마다 취득 하였다. 대표 정지 화상 상처 수리 (그림 3)의 여러 단계에 걸쳐 표시됩니다. 미분 간섭 대비 (DIC) 및 형광 현미경의 조합을 사용하여, 상처 복구 고유 파라미터를 측정 할 수있다. 권취 수리 실험에 걸쳐 재현 가능한 양상을하는지 여부를 결정하기 위해, 혈액의 흐름을 재 확립하는 시간은 물고기의 4 그룹으로 측정 하였다. 혈관 손상은 상처 용기 통해 혈액의 흐름을 재개하기에 253 ± 16 분의 안정적인 박힌 응답 결과 (N = 4-5 실험 당 피쉬, 평균 ± SEM).
그림 1 : 2 DPF 배아의도를 성능에 대한 특징점 핀의 배치를 보여주는 꼬리 정맥 (CV)의 기계적인 부상을 orming. 혈관 구획은 회색 음영 처리됩니다.
그림 2 : 출혈 시간은 시각적으로 기계적 손상 후 측정 할 수 스틸 배아 DPF 2 제브라 피쉬의 혈관 손상의 실시간 비디오에서.. 이미지가 부상 (A)의 시간에 도시되어, 상처 (B)에서 활성 실혈시 및 혈액 손실 (C)의 정지 후에. 표시된 모든 시간은 초 단위입니다. 배아는 왼쪽에 직면 상단과 복부 표면에서의 전방 측 방향으로 배향된다. 스케일 바 100 μm의. 항응고제 히 루딘의 관리는 크게 차량 제어 (D) (P <0.0001, 학생의 t- 테스트) 대 출혈 배 증가되었다.페이지 "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
배아 DPF 2 (: EGFP kdrl) 적혈구 (DsRed를 gata1a) : 그림 3. 혈관 손상은 혈관 내피 세포에 대한 마커를 사용 후 timelapse에 DIC에서 유전자 마커를 사용하여 기계 손상 및 수리를 시각화 스틸과 형광 현미경. 이미지는 혈관 재 확립 혈류 (t = 210), 및 정상 혈관 구조 (t = 615)의 외관상 완전한 복원 로컬 적혈구 축적 (t = 25), 부분 수리 갭을 보였다. 시간은 분 단위로 표시됩니다. 배아는 왼쪽에 직면 상단과 복부 표면에서의 전방 측 방향으로 배향된다. * 지느러미 대동맥의 위치를 나타냅니다. 부상 (화살촉)는 꼬리 정맥 꼬리 신경총의 일부를 파괴. 규모25 μm의 바.
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Discussion
지브라 피쉬 10 부상 레이저 부상 13-15, 레이저 유발 혈전증 (16), 및 상피의 상처를 포함한 다양한 유형의 모델로서 성공적으로 사용되어왔다. 우리는 실행할 간단하며 실시간 현미경에 매우 의무가 생체 내 모델에서 부상 제어 기계적 상처를 생성하는 방법을보고한다. 신속한 지혈하고 측정 응답 및 비디오와 timelapse에 현미경을 사용하여 모니터링 할 수 재현성 상처 복구 프로그램 부상 결과.
그들의 단순하고 틀에 박힌 혈관 정의 현미경으로 접근 사이트에서 재현 부상을 허용 해부학, 대부분의 혈관과 조혈 세포 유형의 존재는 부상에 대한 응답을 연구하는 제브라 피쉬 배아에 특히 유용합니다. 그러나, 제브라 피쉬 배아는이 시스템 대부분의 AP를 제작, 개발 5,6의 첫 번째 주 동안 기능 림프구가 없습니다염증과 수리 타고난 면역의 기여를 공부 방법은 적절한. 현재, 형질 전환 제브라 피쉬의 다양한 혈소판, 피브리노겐, 적혈구, 백혈구 및 혈관 내피 세포에 레이블을 선 포함 혈전 형성, 응고, 염증, 상처 수리에 참여 세포와 단백질 마커 존재 17,21,25- (31). 이러한 및 기타 도구는 가능한 중요한 세부 사항에서 지혈 및 수리에 관련된 프로세스를 수행해야합니다.
기계 손상은 제브라 피쉬의 지혈의 연구 레이저 부상을 보완합니다. 레이저 유발 부상 지브라 피쉬 배아 및 마우스 모델, 레이저 부상 및 혈소판 응집 / 활성화 혈소판 16, 32를 완전히 알려지지 않은 트리거하는 메커니즘의 혈전 형성을 트리거하는 동안 사용되었지만. 기계 부상, 아마도, 혈관 위반에 의해 응고를 유도하는 생리 학적 관련 방법을 제공하고,조직 요인에 의존하는 응고 캐스케이드의 개시. 히 루딘 치료는 크게 손상 후 출혈 배 증가한다는 연구 결과는이 모델이 트롬빈에 의존하는 것이 좋습니다. 기계 부상 별도로 용기 수리를 수행 할 수있는 기회를 제공하기 위해 혈관의 충분한 중단을 제공하여 레이저 부상을 보완한다. 이전의 연구가 성공적으로 약물 및 유전자 조작 19,33의 조건에서 시간을 출혈의 차이를 보여 메스 절개 바늘 구멍에 의한 기계적 손상을 사용했다. 현재의 모델에 사용 특징점 핀 부상으로 인해, 작성된 상처 작고 정의 된 크기 및 더 나은 혈관 개통 및 수리를 연구 할 수있는 기회를 제공함으로써보다 재현성 부상을 제공함으로써 다른 손상 모델을 보완 할 수있다.
제브라 피쉬에 상처 상피 염증 및 상처 수리 (10) 연구를위한 강력한 모델로 입증되었습니다. 할 수있는 능력혈관 손상은 섬유소가 임시 매트릭스, 혈전 파편이 해제되어 제공 설정에서 더 복잡한 상처의 복구를 평가할 수있는 기회를 제공 소개하고 혈관 재생. 이러한 프로세스는 정상 조직 복구 및 급성 및 만성 염증 및 혈관 병리에 참여할 때,이 방법은 셀룰러 동작과 전체의 동물 모델에서 실시간으로 모니터링 할 수있는 시스템에서 인간 질병의 양상을 모델링하는데 도움이 될 것이다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Minutia Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | Tip diameter 0.0125 mm, rod diameter 0.1 mm |
| Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Dumont #5 Fine Tip Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Glass Depression Slide | Aquatic Eco-Systems | M30 | |
| Low Melting Agarose | Lonza | 50081 | Preheated to 42 º C |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma Aldrich | P7629 | |
| 3-aminobenzoic acid (Tricaine) | Sigma Aldrich | E10521 | |
| Hirudin | Sigma Aldrich | H7016 | |
| Glass bottom imaging dishes | Mattek | P35G-1.5-14-C | |
| Dissecting microscope | Olympus | SZH10 | |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axio Observer | |
| Aquarium salts | Instant Ocean | ||
| Insulin syringe with 28.5 G needle | Becton Dickinson | 329461 |
References
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