Protocol
NOTA: Os procedimentos que utilizam peixe-zebra foram aprovados pelo Institutional Animal Care da UCSF e Comitê de Uso.
1. Preparação de Ferramentas
- Insira pin minúcia em um suporte de pino e prenda o pino.
- Utilizando uma pinça de ponta fina, dobre com cuidado a ponta do pino para criar um ligeiro gancho.
- Para manipulação e estabilização do embrião durante a lesão, dobre a extremidade de um calibre 28 ½ polegadas agulha montada em uma seringa de insulina usando alicates.
2. Preparação de embriões Zebrafish por lesão
- Configure casais reprodutores de peixes-zebra e recolher os ovos em água ovo (60ug / sais aquário ml) como mostrado anteriormente 22.
- Adicionar 0,003% de N-feniltioureia (PTU) para a água de ovos quando os embriões são aproximadamente 8 horas pós-fertilização (hpf) para impedir que a melanização.
- Dechorionate dois dia após a fertilização (DPF) embriões antes da experiência com a pinça de ponta fina.
- Anestesiar os embriões com 0,02% tamponado com ácido 3-aminobenzóico (tricaina) aproximadamente 10 min antes de manipulações.
3. Vessel Mecânica Lesão de Embriões
- Transferência de embriões anestesiados para uma lâmina de depressão em um microscópio estereoscópico de dissecação usando uma pipeta de transferência.
- Usando o lado curto plana da agulha da seringa para manipular o embrião com a mão dominante, posicionar o embrião de lado, com a superfície ventral virada para fora da agulha.
- Posicionar o pino minúcia com a ponta virada directamente contra a superfície ventral do peixe para a posterior abertura urogenital. Posicionar o pino minúcia com um ligeiro ângulo de tal modo que a ponta curvada é capaz de perfurar o periderme directamente na veia caudal (Figura 1 </ Strong>).
- Usando a agulha da seringa para manipular o embrião, perfurar a veia caudal com o pino de minúcia tocando no embrião para o pino de gancho ligeiramente o pino para dentro da veia.
- Usando a agulha da seringa, puxe o embrião para longe do pino de minúcia para criar um pequeno rasgo no recipiente.
NOTA: A lesão de sucesso vai resultar em sangramento imediato a partir da veia.
4. Análise da hemostasia
- Escolha apenas os embriões com visivelmente células circulantes no sangue para este procedimento.
- Prepare-se para iniciar o temporizador assim que o pino de minúcia é puxado a partir do vaso.
- Inicie o cronometro logo que a perda de sangue pode ser visualizado a partir da ferida. Quando a perda de sangue da ferida cessa, parar o temporizador e registrar o tempo total, como o tempo de sangramento. Se a coagulação é inibida, o tempo para gravar quando não há mais visivelmente células circulantes no sangue.
5. Análise da cicatrização de feridas
- Transferência posanimais t-lesão em placas de imagem com fundo de vidro para microscopia.
- Remover a maior parte da água do ovo.
- Cubra os embriões em 0,3-1,2% baixo ponto de fusão agarose dissolvidos na água do ovo, aquecido a entre 42 e 45 ºC e suplementadas com 0,02% tricaina.
- Embriões posição sobre os seus lados, usando uma pinça.
- Após a agarose esfria, encher o prato com 0,02% tricaina em água ovo.
- Adquirir imagens usando brightfield, epifluorescência, ou microscopia confocal.
- Remover embrião do agarose usando uma pinça e transferência de volta para a água ovo.
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Representative Results
A lesão mecânica vaso foi realizada em 2 dpf embriões (Figura 2A - C). Resultados da lesão em um resposta rápida e confiável de coagulação medida pelo tempo de interrupção do sangramento (Figura 2D). Para determinar se ou não diferenças na resposta de coagulação pode ser medido, o anticoagulante hirudina foi administrada aos embriões por injecção para dentro da conduta de Cuvier imediatamente antes do ferimento (5-10 nl de 1 unidade por ul de hirudina dissolvidos em água) (por demonstração de injeções no duto de Cuvier, consulte o artigo anterior JoVE 23) 24. A administração de hirudina a uma lesão anterior resultou em aumento significativo vezes versus controlo veículo (Figura 2D) o sangramento.
A evidência de danos nos vasos e coagulação podem ser vistos imediatamente após a lesão usando linhagens transgênicas para endotelial (kdrl: EGFP) e glóbulos vermelhos (gata1a: dsRed 25,26. As imagens foram adquiridas sequencialmente a cada 5 min durante um período de 12 horas utilizando epifluorescência. Representante ainda imagens são mostradas ao longo de diferentes fases da reparação da ferida (Figura 3). Usando uma combinação de contraste de interferência diferencial (DIC) e microscopia de fluorescência, é possível medir os parâmetros distintos de reparação de feridas. A fim de determinar se ou não a reparação de feridas seguiu um padrão reprodutível através de experiências, o tempo de restabelecimento do fluxo sanguíneo foi medida em 4 grupos de peixe. Lesão do vaso resultou em uma resposta estereotipada confiável de 253 ± 16 min para o restabelecimento do fluxo sanguíneo através do vaso ferido (n = 4-5 peixe por experimento, média ± SEM).
Figura 1: Diagrama de 2 dpf embrião mostrando a colocação de pino minúcia para perf orming lesão mecânica da veia caudal (CV). compartimento Vascular é sombreado em cinza.
Figura 2: o tempo de sangramento pode ser medida visualmente após a lesão mecânica Stills de vídeo em tempo real da lesão do vaso no peixe-zebra 2 dpf embriões.. As imagens são apresentadas na altura da lesão (A), durante a perda de sangue do ferimento activa (B), e, após cessação da perda de sangue (C). Todos os horários são indicados em segundos. Os embriões são orientados lateralmente com a superfície de topo anterior ventral e voltado para a esquerda. A barra de escala 100? M. A administração do anticoagulante hirudina levou a um aumento significativamente os tempos de hemorragia versus controlo veículo (D) (p <0,0001, teste t de Student).pg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3:. Visualizando lesão mecânica e reparação utilizando marcadores transgênicos Stills de timelapse DIC e microscopia de fluorescência após a lesão do vaso utilizando marcadores para endotélio vascular (kdrl: egfp) e células vermelhas do sangue (gata1a: dsRed) em 2 dpf embriões. Imagens demonstraram que a distância em vasos e a acumulação local de células vermelhas do sangue (t = 25), reparação parcial com fluxo de re-estabelecida de sangue (t = 210), e aparentemente a restauração completa da estrutura do vaso normal (t = 615). O tempo é indicado em minutos. Os embriões são orientados lateralmente com a superfície de topo anterior ventral e voltado para a esquerda. * Indica a posição da aorta dorsal. A lesão (seta) interrompeu a veia caudal e parte do plexo caudal. Escalabarra 25 um.
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Discussion
Zebrafish têm sido utilizados com sucesso como um modelo para vários tipos de feridas, incluindo lesão de laser 13-15, trombose induzida por laser 16, e epitelial ferindo 10. Relata-se um método de ferimento mecânico que é simples de executar e produz uma lesão controlada num modelo in vivo, que é altamente favorável à microscopia em tempo real. Resultados da lesão em um resposta hemostática rápida e mensurável e um programa de reparação ferida reprodutível que pode ser controlada por meio de microscopia de vídeo e timelapse.
A sua anatomia simples e estereotipado vascular, o que permite lesão reprodutível num local definido microscopicamente e acessível, e a presença de mais vascular e tipos de células hematopoiéticas fazer embriões de peixe-zebra particularmente úteis para estudar as respostas à lesão. No entanto, os embriões de peixes-zebra não tem linfócitos funcionais durante as primeiras semanas de desenvolvimento 5,6, tornando este sistema mais appropriate para estudar a contribuição da imunidade inata na inflamação e reparo. Actualmente, uma ampla variedade de peixes-zebra transgénicos existe com os marcadores para as células e proteínas que participam na formação de trombos, coagulação, inflamação e reparação de feridas, incluindo as linhas que rotulam trombócitos, fibrinogénio, eritrócitos, leucócitos e ao endotélio vascular 17,21,25- 31. Estas e outras ferramentas devem torná-lo possível acompanhar os processos envolvidos na hemostasia e reparo em detalhe significativo.
A lesão mecânica complementa lesão laser para o estudo da hemostasia em peixes-zebra. Enquanto lesão induzida por laser tem sido usado há anos para desencadear a formação de trombos em embriões de peixes-zebra e modelos de mouse, os mecanismos pelos quais os danos de laser dispara coagulação e ativação thrombocyte / plaquetas não são totalmente conhecidos 16,32. A lesão mecânica proporciona um método fisiologicamente relevante para a indução de coagulação por ruptura vascular e, presumivelmente,-tecido dependente do factor de iniciação da cascata de coagulação. A constatação de que o tratamento com hirudina aumentou significativamente o tempo de sangramento após lesão sugere que este modelo é dependente de trombina. A lesão mecânica, adicionalmente, complementa lesão de laser, fornecendo perturbação suficiente de um vaso sanguíneo para fornecer uma oportunidade de seguir reparação navio. Estudos anteriores têm usado com sucesso lesão mecânica por incisão bisturi e punção com agulha para mostrar diferenças nos tempos de sangramento em condições de manipulação farmacológica e genética 19,33. A lesão pin minúcia usado no modelo atual pode complementar outros modelos de lesão, fornecendo uma lesão mais reprodutível devido ao tamanho pequeno e definido da ferida que produz e proporcionando uma oportunidade de estudar melhor recanalização do vaso e reparação.
Epithelial ferindo no peixe-zebra tem provado ser um poderoso modelo para o estudo de inflamação e reparo de feridas 10. A capacidade deintroduzir uma lesão vascular fornece uma oportunidade para avaliar a reparação de mais feridas complexas em ambientes onde fibrina fornece uma matriz provisória, trombos e detritos são apagadas, e os vasos se regenerar. Como estes processos de participar na reparação de tecidos normal e na inflamação aguda e crónica e patologia vascular, este método deve contribuir para modelar aspectos da doença humana num sistema onde os comportamentos celulares pode ser monitorado em tempo real em um modelo animal inteiro.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Minutia Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | Tip diameter 0.0125 mm, rod diameter 0.1 mm |
| Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Dumont #5 Fine Tip Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Glass Depression Slide | Aquatic Eco-Systems | M30 | |
| Low Melting Agarose | Lonza | 50081 | Preheated to 42 º C |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma Aldrich | P7629 | |
| 3-aminobenzoic acid (Tricaine) | Sigma Aldrich | E10521 | |
| Hirudin | Sigma Aldrich | H7016 | |
| Glass bottom imaging dishes | Mattek | P35G-1.5-14-C | |
| Dissecting microscope | Olympus | SZH10 | |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axio Observer | |
| Aquarium salts | Instant Ocean | ||
| Insulin syringe with 28.5 G needle | Becton Dickinson | 329461 |
References
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