Protocol
NOT: Tüm deney protokolleri Fransız Hayvan Deneyleri Etik Kurul tarafından onaylanan ve sayı A-75-2065 ile "Hizmet Koruma et Santé Animales, Çevre'den" tarafından doğrulanmıştır. Örnek boyutları deneylerin tekrarlanabilirliğini sağlamak için seçilmiş ve hayvan etiği düzenleme 3R göredir.
Mouse 1. Hazırlık
- Anestezi
- Görüntüleme kısa bir süre (en az 1 saat) için, ketamin (100 mg / kg) ve ketamin (10 mg / kg) ihtiva eden bir tuzlu su çözeltisi içinde 200 ul karın içinden enjeksiyonu ile fare uyuşturan.
- Alternatif olarak, görüntüleme uzun süre (4 saat kadar), bir uyarlanmış maske aracılığıyla O 2 / N 2 O, bir 70/30 karışımı içinde buharlaşmış izofluran% 2.5 bir inhalasyon ile fare uyuşturan.
- NOT: Bu şekilde daha kararlı bilinçsizlik sağlar ve ilaçların seri intraperitoneal önler. Fare uyuşturulduktan sonra, pense ile ayak pedi uyarılması yoluyla bilinç için kontrol edin.
- Vasküler boyama / ek boyama
- Vasküler boyama için: kuyruk damarından damardan Rodamin-Dextran 200 ul (2 MDA salin tamponu içinde 10 mg / ml) enjekte edilir.
- Nötrofil boyama için: kuyruk damarından salin çözeltisi 100 ul (klon 1A8) Ly6G-PE 2 ug enjekte edilir.
- Sabitleme
- Immobilizasyon için, mikroskop ve anestezik gaz İnhalatörde uyarlanmış bir ölçüye stereotaktik tutucu kullanın.
NOT: sterotaktik tutucu hayvanın kafasını sıkmak için diğer çıkarılabilir ve uyarlanabilir iki metal plaka parantez, bir sabit olmak ve bir metal destek olduğunu. - Nefes hareketleri izolasyonu sağlamak için tespit plakaları arasında fare kafasını takın. Istinat plakaları ve sk germek için kafa arasındaki kulaklarını sıkıniçinde. istikrarın ve hayvan nefes refahı için kontrol edin.
- Immobilizasyon için, mikroskop ve anestezik gaz İnhalatörde uyarlanmış bir ölçüye stereotaktik tutucu kullanın.
- Saç derisini çıkarın
- Dikkatle gözlerle temas kaçınarak, steril bir aplikatör ile kafa derisi saç ıslak etanol% 70 kullanın.
- Tam frontal kemik parietal kemiğin geriye doğru derisi kaldırmak için steril makas ve pense ile cilt kesin. Kapsamlı kanamayı önlemek için gözleri ve kulakları 3 mm'ye kadar uzak tutun. Kafatası (periost) kapsayan gevşek bağ dokusu çıkarın. Sıcak PBS-batırılmış kağıt havlu ile kalan saç yıkayın.
- Daldırma sistemi kurmak
- Doğrudan dağılımını kontrol etmek, küçük bir iğne kullanılarak kafatası cerrahi yapıştırıcı ile 18mm çapında bir lastik halka yapıştırın. (30 ul yeterli olmalıdır) sızmasını önlemek için kauçuk halka tüm çevresi boyunca tutkal.
- PBS-batırılmış kağıt havlu ile halka altında son bir kez kafatası temizleyin ve sonra tam daldırma için 37 ° C PBS ekleyinkafatası. Göz kuruluğu önlemek için fare her göz NaCl% 0.9 solüsyonu veya belirli oftalmik merhem bir damla ekleyin. Amaç altında stereotaktik tutucu sürükleyin.
- Yaklaşık doğrudan iletim yoluyla mikroskop oküler kullanılarak alanını yerleştirin.
2. İki foton Görüntüleme Edinme
- Seçici 680 1.080 nm ayarlanabilir, NUR ışık 140fs darbeleri sağlayan Safir kristal lazer, lazer ve güç kontrolü için bir acousto-optik modülatör: Ti ile birleştiğinde bir multiphoton mikroskop kullanın. 2 dikroik aynalar (565 nm ve 690 nm), 565/610 ve 500/550 bant geçiren filtreler kombinasyonu ile (3 floresan kanalları aynı anda kayıt etkin) 3 harici olmayan descanned dedektörleri (NDD) içeren bir yapılandırmayı kullanın ve bir 20 (NA = 1) suya daldırma hedefi × bir plan apochromat ile 485 kısa geçiren filtre,.
- ANAES iyi homeothermy izin vermek için, ısıtma odacığı ayarlamaanestezisi sağlanır fare.,
NOT: Sıcaklık daha iyi stabilite için oturumu görüntüleme önce 1 saat ayarlanmış olabilir. Bizim durumumuzda, 32 ° C anestezi fare optimal vücut ısısını (36-37 ° C) elde etmek için seçilmiştir ve 4 saat kadar muhafaza edilir. Bu sıcaklık, kullanılan (dijital sistemi bu noktada kontrol etmek için kullanılabilir) sisteme adapte edilebilir. Buna ek olarak, kullanılan ısıtma odası siyah / koyu ve dış ışık kirlenmesini önlemek için sistemde (hedefleri ve motorlu plaka) bir kısmını kapsamaktadır. - Sistemi açın
- Safir lazer, daha sonra tüm mikroskop sistemi: Ti açın. Toplama yazılımı başlatın. 870 nm lazer dalga boyu aralığını ayarlayın. Kayıt için uygun NDD seçin.
NOT: Bizim durumumuzda, ikinci harmonik üretimi (SHG) 19 ve mavi floresan proteini (eCFP) 485 kısa geçiş filtresi sonra NDD tarafından tespit edilir. 500/550 bant geçiren filtre ve rodaminle dekstran t ile tespit edildikten sonra eCFP da NDD tarafından tespit edilirO NDD 565/610 bant geçiren filtre sonra.
- Safir lazer, daha sonra tüm mikroskop sistemi: Ti açın. Toplama yazılımı başlatın. 870 nm lazer dalga boyu aralığını ayarlayın. Kayıt için uygun NDD seçin.
- Satın alma ayarlarını yapma
- Yazılımın "canlı kazanım" görüntüleme komutunu kullanın ve mikroskop yön kontrolü kullanarak, eCFP ve Rodamin sinyali ile bir bölgeye odağı ayarlamak. En az foto-hasarı ile en iyi bir sinyal-gürültü oranı elde etmek için en az bir lazer güç.
NOT: Kullanılan güç ayarı ilgi bölgenin derinliğine göre değişir. Genellikle AOM ayarları 15 mW civarında hedefi ötesinde bir lazer gücü temsil% 20 civarında, ayarlanır. Her NDD foto-ağartma ve fotoğraf zararı azaltmak için Proje Yönetim Ekipleri kazanç gücünü artırmak için daha iyidir. Tipik satın alma ayarları tek 1.58 us piksel bekleme süresi ile tarama ve 1.5 büyütme 512 x 512 piksel çözünürlük vardır.
- Yazılımın "canlı kazanım" görüntüleme komutunu kullanın ve mikroskop yön kontrolü kullanarak, eCFP ve Rodamin sinyali ile bir bölgeye odağı ayarlamak. En az foto-hasarı ile en iyi bir sinyal-gürültü oranı elde etmek için en az bir lazer güç.
- Ilgi Seç bölgeleri
- Kayıt parametreleri ayarlandıktan sonra, tekrar "canlı" satın alma komutunu kullanınve gerçek zamanlı olarak izlenmesi gereken bir arzu (x, y, z) alanını seçmek için doku anket.
NOT: Genellikle, biz vasküler ve parankimal alanlar hem de dahil olmak üzere bir alan seçti. - "Pozisyon" yazılım komutu ile alan kaydedin.
Not: Bu komut x, y, farklı uzak alanlarda z koordinatlarını ezberler. - Seçin ve aynı prosedürü kullanarak (3 kadar) ilgi ek alanları kayıt.
- Seçilen büyütme ile gerekli hacme göre birinci hafızaya pozisyona "z-yığın" yazılım komutu ile 3D z-yığını ayarlayın. İlk derin konumunu ve daha sonra yüksek konumunu ezberleyin. Derinliği ile lazer gücünü Normale.
NOT: Birden fazla eşzamanlı alan görüntüleme için, 12 mikron kalınlığında bir hacim elde etmek her alan için 3 mikron z-adımlarla ayrılan 5 dilim kazanır. Bu ayarlar, çalışılan hücre tipine uygun olabilir.
- Kayıt parametreleri ayarlandıktan sonra, tekrar "canlı" satın alma komutunu kullanınve gerçek zamanlı olarak izlenmesi gereken bir arzu (x, y, z) alanını seçmek için doku anket.
- Başlat edinimi
- Seçmek220; zaman serileri "yazılım komutu ve zaman aralığı süresini ve döngü sayısını seçin. "Denemeyi başlatmak" yazılım komutu seçerek gerekli zaman atlamalı ve süresine göre zaman atlamalı görüntüleme başlayın.
NOT: Bizim durumumuzda, biz 30 dakika gerçek zamanlı temsil 60 döngüleri sırasında bir hacim, her 30 sn kazanır. Daha küçük zaman atlamalı damardaki hızlı hücre haddeleme izlemek için gerçekleştirilebilir. Bu durumda ince z-yığın ve en fazla 2 farklı alanlarda aynı anda kaydedilebilir. - Set up düzenli olarak izlenmesi.
- Her zaman bilinçsiz olduğundan emin olmak için hayvan izlemek.
NOT: bıyık veya hayvanın bacakları Çalkalamalı canlanma göstergeleri vardır. Hayvanın solunum sarsıntılı durumda, izofluran miktarı biraz azaltılabilir. Edinimi sırasında Güçlü doku sürüklenme fare canlanma bir göstergesidir. - Hedefi emin olunuz batırılır. 37 ° C PBS betwee yenileyinn iki satın almalar (30 dk).
NOT: edinimi sırasında sinyal Aşamalı kaybolması PBS kaçak göstergesidir.
- Her zaman bilinçsiz olduğundan emin olmak için hayvan izlemek.
- Seçmek220; zaman serileri "yazılım komutu ve zaman aralığı süresini ve döngü sayısını seçin. "Denemeyi başlatmak" yazılım komutu seçerek gerekli zaman atlamalı ve süresine göre zaman atlamalı görüntüleme başlayın.
- Prosedürün Sonu
- Gerekli videolar kaydedilir sonra, hızla resüsitasyon önce servikal dislokasyon ile hayvan euthanize.
Not: yara iyileşmesi uzunlamasına görüntüleme gerçekleştirmek için sınırlandırır 24-48 saat içinde bir yara oluşmasına yol açar.
- Gerekli videolar kaydedilir sonra, hızla resüsitasyon önce servikal dislokasyon ile hayvan euthanize.
3. Veri Analizi
- Drift düzeltme
- 3D Otomatik izleme için Imaris Bitplane yazılımını kullanın.
- Imaris 3D görüntü dizisi açın. Seçin komutunu "nokta", ve homojen alanda dağıtılan mümkünse, 4 farklı bağlantı noktaları en az her zaman noktalarında için manuel izleme (klik + shift) oluşturmak.
- "Düzenlemek parça" sekmesinde "Doğru sürüklenme" komutunu kullanarak sürüklenme düzeltme uygulayın.
- T edinO x düzeltme, y ve z özellikle kalite artefactual kararsız önlemek için.
NOT: düzeltme değil tatmin edici değilse, diğer bağlantı noktalarını deneyin ya da analiz videoyu hariç.
- Hücre izleme
- Komutu "Yeni noktalar eklemek" kullanın ve algoritma ayarı "zamanla iz noktalar" seçeneğini seçin. Bir sonraki adıma gidin.
- "Kaynak kanalı" komutunu kullanarak ilgi tüm kanalda ya otomatik hücre izleme prosedürü uygulayın. 10 mikron Set nesneleri (yani, hücreler) çapı. Bir sonraki adıma gidin.
NOT: seçim ölçülen sinyalin nesneler ve özgünlüğü arasındaki ayrım bağlıdır. Kısacası, tüm kanalda otomatik izleme Saptanan sinyal ilgi nesneye özgü yalnızca mümkündür. SHG ve eCFP hem 485 kısa geçiş filtresi sonra NDD tarafından tespit Çünkü, izleme daha spesifik ve 5 sonra NDD tarafından kaydedilen eCFP sinyalini kullanarak etkili olacak00/550 bant geçiş filtreleri. Kümelenmiş veya yoğun paketlenmiş nesneler 3.1.2 adıma benzer bireysel nesnelerin manuel seçim gerektirir. - , "Kalite" filtre türünü seçin belirsiz nesnelerin izleme dışlamak için eşik ayarlayın. Bir sonraki adıma gidin.
- İki noktalar arasındaki "Max mesafe" ve "Boşluk boyutu" doğru parametreleri ile "Brown Algoritması Motion" seçiniz. Parça nesil doğrulayın.
- Parçalar otomatik olarak hesaplanır sonra, "parça süresi" filtre türünü seçin Tracks (4 kez puan temsil eden) daha kısa, 120 sn ortadan kaldırmak için eşiğini ayarlamak.
- Zorunlu: otomatik izleme sonra, parça kalitesini kontrol edin.
- Nesneleri parça yolları takip kontrol etmek için zaman çubuğunu önüne sermek. , "Düzenlemek" sekmesinde bulunan iz noktası düzeltme seçenekleri kullanın değilse: "delete" komutu (herhangi bir iz s silmek sahte veya uygunsuz parçaları silinoint ayrı ayrı) "kesmek" komutunu kullanarak. Parça yolu süreksiz ise, eksik zaman noktaları (klik + shift) ekleyin belirli bir yolda tüm noktaları seçin ve kullanmak "düzenlemek parça" sekmesinde komutunu "connect".
- Niceleme parametreleri
- "Tercihler" komutu "İstatistik" sekmesini seçin listesinde ilgi dinamik parametrelerini seçin. Seçin komuta ve oluşturulan excel dosyasını kaydetmek "dosyasına tüm istatistikleri verme".
NOT: Çeşitli dinamik parametreler doğrudan böyle bir parça uzunlukları, anlık hız, ortalama hız gibi yazılım elde edilen ve doğruluk takip edilmektedir. Hareketlilik katsayısı 6, 20 tespit edilebilir ancak doğrudan yazılım tarafından sağlanan değil. - Her hücre için, zaman (Dt), her dönem için değiştirmelerin ortalamasını hesaplamak (30 sn zaman atlamalı film için, ¨t 30, 60, 90 sn, vb olacak).Zaman aralığının bir fonksiyonu olarak kare yerinden ortalamasını çizilir. Eğrinin doğrusal parçası eğiminin hesaplanması ile motilite katsayısı elde edilir.
- "Tercihler" komutu "İstatistik" sekmesini seçin listesinde ilgi dinamik parametrelerini seçin. Seçin komuta ve oluşturulan excel dosyasını kaydetmek "dosyasına tüm istatistikleri verme".
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fare kafatası yapısı intravital görüntüleme, kemik iliği fizyoloji çalışmak için iyi bir fırsat sunuyor. Ön-parietal alanı çevresinde ince olan kemik, kemiğin aşınma olmadan medulla nişler erişim elde etmek mümkündür. 1 MacBlue transgenik fare kafatası geniş bir 2D alanını temsil Şekil. kemik matriksi esas olarak SHG 19 tarafından kolayca tespit edilebilir kollajen oluşmaktadır. Rodaminle Dekstranın Enjeksiyon kemik iliği damar ağı lekeleri ve kemik matrisi ve gemilerin 14 arasında parankimal kemik iliği niş belirlenmesi için izin verir. ECFP hücreler kemik iliği iki bölmelerinde dağıtılan, ancak kemik matrisinden mevcut olmayan. Monositler elle doku içinde kendi konumuna göre sınıflandırılır. Vasküler monosit tüm hücre geminin büyüklüğü göz ardı, damar içinde olduğunda tanımlanır. Sadece büyük toplama venüller bizim a dışındadırnalysis. Hücre damar ile kemik matrisi arasındaki bulunduğu zaman Parenkimal monosit tanımlanır.
Çevrede (ek Video 1 ve 2) belirli bölgenin Time-lapse görüntüleme ya vasküler (Şekil 2A) veya parankimal (Şekil 2B) monositler için zamanla bireysel hücre yörünge hesaplanması için izin verir. hat uzunluğu parankimal monositler ekran vasküler monositlere göre değiştirmeyi azalttığını göstermektedir. Zaman içinde yerinden analizi, her iki bölme (Şekil 2C) monosit ortalama hızını karşılaştırır. zamanın bir fonksiyonu olarak ortalama kare deplasmanlı rasgele hareket mekansal ölçüde bir ölçüsüdür. Hareketlilik katsayısı (tartışma bölümüne bakınız) eğrinin lineer kısmının eğimi tarafından belirlenir ve hücre yerinden daha iyi bir fikir sağlar. vasküler monositler (MC = 71μm² / s) motilite katsayısı motilite coefficie daha yüksektirparankimal monositlerin nt (MC = 4.4μm² / s).
iktisap zaman çözünürlüğü ortalama hücre hızına adapte edilmelidir. Rolling damar monositler kısa bir zaman içinde önemli deplasman yapabilirsiniz. Daha doğru bir hücre izleme için, satın alma zaman aralığını azaltarak olduğu tercih. Şekil 3, iki farklı zaman çözünürlüklerde monosit izleme bir örneğini göstermektedir. 30 saniye zaman aralığı 10 saniye zaman aralığı ile karşılaştırıldığında doğruluk ve aynı zamanda (yeşil kesik çizgi ile gösterilmiştir), yolların uzunluğu azaltır.
Son olarak, Şekil 4, monositler için eş zamanlı bir hücre alt analiz olasılığını göstermektedir. Ly6G olgun fare nötrofil belirli bir belirtecidir. (Bu durumda Phyco-erythrin olarak) bir florokromla ile birlikte bir anti-Ly6G enjeksiyonu doğrudan in vivo görüntüleme dizisi leke nötrofiller önce 5 dk. Bu yaklaşım, ek dim sağlaranaliz ve olasılık ension farklı hücre alt gruplarının davranışlarını karşılaştırmak için. Bu tür bir yaklaşım, monosit bölümlerinde alt-grupların tanımlanması için kullanılabilir.
Kafatası kemik iliği örgütün Şekil 1. Geniş alan. MacBlue fare kafatası kararlı durum kemik iliği in vivo iki foton lazer tarama mikroskobu görüntüsü. (Kırmızı) damar görüntüleme oturumundan önce 2MDa Rodaminle Dextran'ın 5 dakika kuyruk boşuna enjeksiyonu ile boyanır. Kemik ikinci harmonik üretimi (mavi) tarafından görüntülenmiştir. ECFP + monositler (Mavi) parankimal nişler (damar ve kemik arasındaki karanlık alanlar) içinde yer alan ve gemiler içinde. Olan bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.
Şekil 2. Gerçek zamanlı hücre izleme. (A) damar ve (B) parankim içindeki monositlerin zaman boyunca Temsilcisi parça yolları. Her hücre için parçalar (yeşil hat) yazılım tarafından otomatik olarak oluşturulur. Kırmızı lekeler izlenen hücrelerin kütle merkezini temsil eder. Vasküler ve parankimal monositler arasında (C) Ortalama hız karşılaştırması. Mann-Whitney istatistiksel analizi *** vasküler ve parankimal monositler için temsil edilmektedir, zamanın bir fonksiyonu olarak p <0.001. (D) ortalama kare deplasmanlı (MSD) temsil eder, gerçekleştirilmiştir. Doğrusal eğri olmayan bir kısıtlı bir ortamda rastgele yürüyüş gösterir ise asimptotik eğri, zamanla hücrelerin kısıtlı değiştirmesini gösterir. Motilite katsayısı hücre yer değiştirme derecesini belirtir ve c eğrisinin eğimi tarafından belirlenir lineer regresyon ile hesaplanan urve. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Haddeleme monositlerin çalışmada Şekil 3. Zaman aralığı çözünürlüğü. Temsili resim dizileri artan zaman çözünürlüğü haddeleme hücre yörünge hassasiyetini geliştirir olduğunu göstermektedir. 10 sn zaman aralıklarıyla (Yukarı) Görüntü dizisi. 30 sn zaman aralıklarıyla (Aşağı) Görüntü dizisi. parça yolunun kalitesi artırıldı ve aynı veya zıt iki farklı hücre dikkate riski azalır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Medüller nötrofillerin ve monositlerin in vivo ko-lokalizasyonu Şekil 4.. Bu rakam, bir florokromla ile birlikte spesifik monoklonal antikor enjekte edilerek, eşzamanlı monositleriyle in vivo başka hücre alt kümesini algılamak imkanı göstermektedir. Ly6G-PE antikoru 2 ug 5 dk MacBlue fare kafatası kemik iliği görüntüleme önce damardan enjekte edilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Parankimal monositlerin Ek Video 1. Göçmen davranış. Bir MacBlue fare kafatası kemik iliği parenkimde monositlerin kararlı durum göçmen aktivite in vivo 3D görüntüleme. ECFP + sinyal mavi olduğunu. Her hücrenin (kırmızı nokta) için Göçmen yolları yeşil görünür.
vasküler monosit Ek Video 2. Göçmen davranış. Bir MacBlue fare kafatası kemik iliği damar içinde monositlerin kararlı durum göçmen aktivite in vivo 3D görüntüleme. ECFP + sinyal mavi olduğunu. (2M Da) rodamin-dekstran kemik iliği damarsal (kırmızı) ayırt etmek için görüntüleme oturumundan önce enjekte edildi. Her hücrenin (kırmızı nokta) için Göçmen yolları yeşil görünür.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
in vivo görüntüleme yönteminin kritik noktaları görüntüleme süresini maksimize etmek ve inflamatuar hücrelerin dinamiklerini etkileyebilecek bakteriyel kontaminasyon ve inflamasyon riskini en aza indirmek için odak istikrarı sağlamak için vardır. Cerrahi kemik iliği erişmek için minimal gerçekleştirilen gibi kafatası kemik iliği Görüntüleme bu amaçlarını izler. Steril malzeme ve antiseptik kullanımı hücre homeostazındaki pertürbasyon neden olabilecek enfeksiyon riskini sınırlamak için esastır.
Stereotaktik sahibinin geliştirilmesi zor olabilir ve (objektif ve motorlu mikroskop aşamasında, anestezi gaz İnhalatörde kullanımı arasındaki mesafeyi) özel her sistem için özelleştirme gerektirir olabilir. Bu daha geniş bir görüntüleme yüzey erişimi mümkün olduğunca yatay fare kafasını almak önemlidir. Hayvan bir biçimde pozisyonlandığı zaman, birkaç dakika kullana olabilir olasıdıred odak düzlemi iyi stabilite elde etmek. Bu nedenle, bu satın alma kayıt başlatmadan önce doku sürüklenme kontrol etmek için tavsiye edilir. Ilgi bölgelerin seçimi ile birlikte bu süreç bir süre sürebilir, çünkü o da düzenli Ketamin / Xylazin kullanılmış olması halinde hayvan bilinçsiz olup olmadığını kontrol etmek ve sızıntı ve buharlaşma mümkün olduğunca objektif doğru daldırma kontrol etmek için tavsiye edilir meydana gelmektedir.
kafatası kauçuk halka iyi konumlandırma sürecinde bir başka önemli adımı temsil etmektedir. Siyanoakrilat tutkal istikrar ve sızdırmazlık açısından iyi sonuçlar verir, ama bir doku ilgi bölgeye kafatası ve blok erişimi kapak olabilir tutkal aşırı yükleme önlemek gerekiyor. Bir cam lamel olmadan kafatası doğrudan daldırma avantajı kemik derin bölgelerine erişim elde etmektir. Kafatası düz bir yüzey değildir Ek olarak, bu con görüntüleme alanını sınırlamak değilŞekil 1'de gösterildiği gibi geniş bir görüntüleme alanı sağlayan kafatası ve lamel arasındaki inceliğini yüzey,.
Tüm görüntüleme teknolojileri için, satın alma hızı ve çözünürlük kalitesi arasındaki seçim bir uzlaşmadır. Bu durumda, sayı ve zaman birimi başına görüntülerin kalitesi sınırlıdır ve bu tercih ele bilimsel bulunmamasına bağlıdır. Parankimal monositler yavaş hareketli veya sesil iken Genellikle, vasküler monositler, hızlı, hücreler haddeleme. Haddeleme hücrelerin doğru bir izleme Şekil 2'de gösterildiği gibi satın alma yüksek zaman çözünürlüğü gerektirir. Sesil hücrelerin yüksek görüntüleme hızı yararsız ve yüksek x, y, z çözünürlüğü örneğin dendritlerin çıkıntılı aktivitesini analiz etmek tercih edilebilir. Hızlı hücreler z kendi yerinden daha uzun izleme almak için kalın hacmi gerektirir.
zamanın bir fonksiyonu olarak ortalama kare yer değiştirme yazılımı Imaris tarafından sağlanan değildir. principAslında dayanan bu temsilin le herhangi bir karşılaşma veya yapısal daralma olmadan balistik seyahat bir nesne için, o gitti mesafe zaman aralığı (Şekil 2B) ile orantılı olacağını, söyledi. Böylece yamaç doğrusallığı olmayan kısıtlı bir ortamda rastgele bir yürüyüş gösterir. Bunun aksine, eğrisinin asimptotik şeklini hücre nüfusunun zaman içinde bir kısıtlı yer değiştirme yansıtır. Bu hesaplamanın ikinci bir avantajı, hızı bazen kütle merkezinin artefakt değiştirmesi ile abartılmıştır olmasıdır. Bu çıkıntılı aktivite yavaş hareketli bir hücre için özellikle önemlidir. Bu durumda, doğrusal regresyon ıle hesaplanmıştır eğrisinin eğimi tarafından hareket kabiliyeti katsayısı hesaplama cellover süresi 21 gerçek yer değiştirmesini gösterir.
In vivo Ly6G boyama görüntüleme işlemi sırasında analiz yeni bir parametre eklemek için olasılığı göstermektedir (Şekil 3 ark) düşündüren kendi hareketlilik hiçbir kusur gözlemledik. Vasküler nötrofil% 98'den daha fazla uygun şekilde etiketlenmiş rağmen, kemik iliği nötrofillerin boyama daha az etkin olduğunu ve ortalama florasan yoğunluğu güçlü kemik iliği parankimi doğru antikorun indirgenmiş erişim işaret azalır (veriler gösterilmemiştir). Hücre fonksiyonları için Rodamin dekstran, kuantum noktaları, ya da Dapi, propidyum iyodür gibi apoptotik ya da nekrotik hücre başka özel boyalar, Sytox 22 ya da floresan haberci reaktif oksijen türleri 23 üretimi gibi, görüntüleme sırasında kuyruk damarı yoluyla damardan eklenebilir süreç ve hücre ölümü, fagositoz ve nötrofil hücre dışı tuzak gibi fonksiyonel özelliklere ölçmek için iyi bir fırsat sunuyoruz. Mazo ve arkadaşları 12, güzel iki farklı vasküler boyalar kullanılıriyi kontrast parankimi ve damar için düşük ve yüksek molekül ağırlığına sahip. floresan boya seçimi farklı floresan muhabir birlikte alımının için çok önemlidir. Gerçekten de, emisyon dalga boyu kullanılan tüm floresan boyalar arasında en iyi dengeyi elde etmek için uygun şekilde seçilecektir.
Bu buluşta kullanılan protokol, in vivo olarak ana kadar zor bir çalışma olan, bir hücre bölmesi, biyolojik aktivitesini analiz etmek mümkün kılar. Kemik iliği dokusunun histolojik analiz genellikle ince bölüm izin vermek için, kemik yumuşatma uzun bir hazırlık gerektirir ve sadece doku statik görünüm sağlar. dinamik bir görünüm parankimi ve kemik iliği sinüsoidlerinden arasındaki hücre değişimi oranını vurgulamaktadır. Bu hızlı süreç inflamatuar sinyal 5 veya myeloaplasive kemoterapi önkoşullanma üzerine hücre mobilizasyonu mekanizmasının daha iyi anlaşılması için deşifre etmek için önemli bir adımdır6 rejimin. Biz cep intravasation 6 olay bildirilmiştir ancak bu süreç nedeniyle kararlı durumda düşük frekansa ancak saptanabilir. Ancak, enflamatuar sinyal üzerine geliştirilmiş olması muhtemeldir. Böyle CCR2, CX3CR1 veya CXCR4 gibi kemokin reseptörleri yüksek, intravazasyonunda sürecinde hücre göç yollarında yeni temel bakış açıları vermelidir bu reseptörlerin genetik geçersiz dolayısıyla kullanımı sorumlu tutulmaktadır
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Yazarlar editoryal yardım için Anne Daron ve Pierre Louis Loyher teşekkür etmek istiyorum, iki-foton mikroskop ve yardım damızlık fareler için hayvan Facility "NAC" ve Camille Baudesson yardım için Plateforme Imagerie Pitié-Salpêtrière (PICPS). Hibe sözleşmesi kapsamında bu sonuçlara önde gelen araştırma Avrupa Topluluğu'nun Yedinci Çerçeve Programı fon aldı (FP7 / 2007-2013) n 304.810 ° - baskınlar, ve n Université Pierre et Marie Curie gelen Inserm den 241.440-Endostem, ° "Ortaya "la gelen" "dan," Ligue contre le kanser Derneği la Recherche sur le Kanser dökün "ve gelen" Agence Nationale de la Recherche "Program Doğuşu 2012 (ANR-EMMA-050). PH la "Ligue contre le kanser" tarafından desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamin | Merial | 100 mg/ml, anesthetic | |
| Xylazin | Bayer HealthCare | 10 mg/ml, anesthetic | |
| Isofluran | Baxter | 2.5%, anesthetic | |
| O2/NO2 | 70/30 mixture, anesthetic | ||
| Rhodamin-Dextran | Invitrogen | 2 MDa, 10 mg/ml, Vascular staining | |
| Ly6G-PE | Becton-Dickinson | clone 1A8, neutrophils staining | |
| Stereotactic holder | Home made | surgery | |
| Ethanol 70% | surgery | ||
| Sterile scissors and nippers | surgery | ||
| Rubber ring | 18 mm diameter, surgery | ||
| Glubran 2 | Queryo Medical | Surgical Glue, rubber ring fixation | |
| Small gauge needles | Terumo | surgery | |
| Zeiss LSM 710 NLO multiphoton microscope | Carl Zeiss | Microscope | |
| Ti:Sapphire crystal laser | Coherent Chameleon Ultra | 140 fsec pulses of NIR light | |
| Zen 2010 | Carl Zeiss | Acquistion Software | |
| Imaris Bitplane | Bitplane | Analysis Software, 3D automatic tracking | |
| PBS 1X | D. Dutscher | surgery | |
| Thermostated chamber | Carl Zeiss | intravital imaging |
References
- Ovchinnikov, D. A., et al. Expression of Gal4-dependent transgenes in cells of the mononuclear phagocyte system labeled with enhanced cyan fluorescent protein using Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP double-transgenic mice. J Leukoc Biol. 83, 430-433 (2008).
- Parihar, A., Eubank, T. D., Doseff, A. I. Monocytes and macrophages regulate immunity through dynamic networks of survival and cell death. J Innate Immun. 2, 204-215 (2010).
- Geissmann, F., Jung, S., Littman, D. R. Blood monocytes consist of two principal subsets with distinct migratory properties. Immunity. 19, 71-82 (2003).
- Robbins, C. S., Swirski, F. K. The multiple roles of monocyte subsets in steady state and inflammation. Cell Mol Life Sci. 67, 2685-2693 (2010).
- Shi, C., et al. Bone marrow mesenchymal stem and progenitor cells induce monocyte emigration in response to circulating toll-like receptor ligands. Immunity. 34, 590-601 (2011).
- Jacquelin, S., et al. CX3CR1 reduces Ly6Chigh-monocyte motility within and release from the bone marrow after chemotherapy in mice. Blood. 122, 674-683 (2013).
- Swirski, F. K., et al. Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites. Science. 325, 612-616 (2009).
- Germain, R. N., Miller, M. J., Dustin, M. L., Nussenzweig, M. C. Dynamic imaging of the immune system: progress, pitfalls and promise. Nat Rev Immunol. 6, 497-507 (2006).
- Charo, I. F., Ransohoff, R. M. The many roles of chemokines and chemokine receptors in inflammation. N Engl J Med. 354, 610-621 (2006).
- Milo, I., et al. Dynamic imaging reveals promiscuous crosspresentation of blood-borne antigens to naive CD8+ T cells in the bone marrow. 122, 193-208 (2013).
- Cavanagh, L. L., et al. Activation of bone marrow-resident memory T cells by circulating, antigen-bearing dendritic cells. Nat Immunol. 6, 1029-1037 (2005).
- Mazo, I. B., et al. Bone marrow is a major reservoir and site of recruitment for central memory CD8+ T cells. Immunity. 22, 259-270 (2005).
- Travlos, G. S. Normal structure, function, and histology of the bone marrow. Toxicol Pathol. 34, 548-565 (2006).
- Mazo, I. B., et al. Hematopoietic progenitor cell rolling in bone marrow microvessels: parallel contributions by endothelial selectins and vascular cell adhesion molecule 1. J Exp Med. 188, 465-474 (1998).
- Rashidi, N. M., et al. In vivo time-lapse imaging of mouse bone marrow reveals differential niche engagement by quiescent and naturally activated hematopoietic stem cells. Blood. , (2014).
- Sipkins, D. A., et al. In vivo imaging of specialized bone marrow endothelial microdomains for tumour engraftment. Nature. 435, 969-973 (2005).
- Cariappa, A., et al. Perisinusoidal B cells in the bone marrow participate in T-independent responses to blood-borne microbes. Immunity. 23, 397-407 (2005).
- Junt, T., et al. Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow. Science. 317, 1767-1770 (2007).
- Zoumi, A., Yeh, A., Tromberg, B. J. Imaging cells and extracellular matrix in vivo by using second-harmonic generation and two-photon excited fluorescence. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 11014-11019 (2002).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296, 1869-1873 (2002).
- Cahalan, M. D., Parker, I. Choreography of cell motility and interaction dynamics imaged by two-photon microscopy in lymphoid organs. Annu Rev Immunol. 26, 585-626 (2008).
- Yost, C. C., et al. Impaired neutrophil extracellular trap (NET) formation: a novel innate immune deficiency of human neonates. Blood. 113, 6419-6427 (2009).
- Devi, S., et al. Multiphoton imaging reveals a new leukocyte recruitment paradigm in the glomerulus. Nat Med. 19, 107-112 (2013).
