Summary
Veel verschillende methoden bestaan voor de meting van extracellulaire blaasjes (EV) met flowcytometrie (FCM). Verschillende aspecten moeten worden overwogen bij het bepalen van de meest geschikte methode om te gebruiken. Twee protocollen voor het meten van EV's worden gepresenteerd, met behulp van individuele detectie of een kraal-gebaseerde benadering.
Abstract
Extracellulaire Vesicles (EV's) zijn kleine, membraan-afgeleide blaasjes gevonden in lichaamsvloeistoffen die zeer betrokken bij cel-cel communicatie en helpen reguleren van een breed scala van biologische processen. Analyse van EV's met behulp van flowcytometrie (FCM) is notoir moeilijk geweest vanwege hun geringe omvang en het ontbreken van discrete populatie positief voor markers van belang. Methoden voor EV-analyse, terwijl aanzienlijk verbeterd in de afgelopen tien jaar, zijn nog steeds een work in progress. Helaas, er is geen one-size-fits-all-protocol, en een aantal aspecten moeten worden overwogen bij het bepalen van de meest geschikte methode om te gebruiken. Hier gepresenteerde zijn verschillende technieken voor de verwerking van EV's en twee protocollen voor het analyseren van EV's met behulp van individuele detectie of een kraal-gebaseerde benadering. De hier beschreven zal helpen bij het elimineren van het antilichaam aggregaten aangetroffen in commerciële preparaten werkwijzen toenemende signaal-ruisverhouding en het instellen poorten rationeel fashion dat detectie van de achtergrond fluorescentie minimaliseert. Het eerste protocol gebruikt individuele detectiemethode die bijzonder geschikt voor het analyseren van een grote hoeveelheid klinische monsters, terwijl het tweede protocol gebruikt een kraal benadering te vangen en detecteren kleinere EV en exosomes.
Introduction
Extracellulaire Vesicles (EV's) zijn kleine, membraan-afgeleide blaasjes gevonden in lichaamsvloeistoffen die zeer betrokken bij cel-cel communicatie en helpen reguleren van een breed scala van biologische processen. Analyse van EV's met behulp van flowcytometrie (FCM) is notoir moeilijk geweest vanwege hun geringe omvang en het ontbreken van discrete populatie positief voor markers van belang. Methoden voor EV-analyse, terwijl aanzienlijk verbeterd in de afgelopen tien jaar, zijn nog steeds een work in progress. Helaas, er is geen one-size-fits-all-protocol, en een aantal aspecten moeten worden overwogen bij het bepalen van de meest geschikte methode om te gebruiken. Hier gepresenteerde zijn verschillende technieken voor de verwerking van EV's en twee protocollen voor het analyseren van EV's met behulp van individuele detectie of een kraal-gebaseerde benadering. De hier beschreven zal helpen bij het elimineren van het antilichaam aggregaten aangetroffen in commerciële preparaten werkwijzen toenemende signaal-ruisverhouding en het instellen poorten rationeel fashion dat detectie van de achtergrond fluorescentie minimaliseert. Het eerste protocol gebruikt individuele detectiemethode die bijzonder geschikt voor het analyseren van een grote hoeveelheid klinische monsters, terwijl het tweede protocol gebruikt een kraal benadering te vangen en detecteren kleinere EV en exosomes.
EV's, ook wel bekend als microdeeltjes, zijn klein, membraan-afgeleide blaasjes aangetroffen in lichaamsvloeistoffen die betrokken zijn bij cel-cel communicatie en helpen reguleren van een breed scala van biologische processen 1. Door expressie van diverse oppervlakte markers en / of rechtstreekse overdracht van biologisch materiaal, EV kunnen de functie van ontvangende cellen veranderen spelen ofwel activeren of onderdrukken rollen in intercellulaire communicatie 2-4. Klinisch bloedplaatjes afgeleide EV bekend sterke anticoagulerende activiteit 5 hebben, terwijl andere zijn aangetoond te dragen aan een breed scala aan omstandigheden, het bevorderen van tumor metastasis 6 aan het beschermen tegen de ziekte 7. EV's kunnen worden onderverdeeld in kleinere groepen van cellen afgeleide blaasjes zoals exosomes en microvesicles (MV), afhankelijk van hun grootte en het mechanisme van de generatie 8. De nomenclatuur van de cel afkomstige vesikel subpopulaties steeds een onderwerp van debat 8,9, echter, exosomes algemeen beschreven als kleine, 40 tot 100 nm deeltjes afkomstig van endosomale fusie met de plasmamembraan, terwijl MV groter 100 tot 1000 nm deeltjes gevormd door het afstoten van de plasmamembraan 10. Hier wordt de algemene term "EV" worden gebruikt voor alle soorten van extracellulaire biologische blaasjes vrijgegeven door cellen.
Isolatie van EV uit volbloed een meerstaps procedure en vele bewerkingsvariabelen is aangetoond EV inhoud, waaronder opslagtemperatuur en duur 11,12, antistollingsmiddel / conserveermiddel gebruikt 13 en beïnvloedencentrifugatie methode 14. Een behoefte aan standaardisatie van deze variabelen heeft geleid tot de aanbevelingen van de International Society op trombose en hemostase Wetenschappelijk Comité en normalisatie (ISTH SSC) voor een correcte verwerking van bloed en EV isoleringsprocedures 15,16, maar er bestaat geen consensus tussen onderzoekers op het optimale protocol gebruik 12. Meest echter over eens dat strak pre-analytische variabelen zijn cruciaal voor nauwkeurige en reproduceerbare gegevens.
Om EV's te analyseren, hebben de onderzoekers gebruik gemaakt van verschillende methoden, met inbegrip van transmissie elektronenmicroscopie 17, scanning elektronenmicroscopie 18,19, atomic force microscopie, dynamische lichtverstrooiing 20,21 en western blotting 22,23. Terwijl FCM is de voorkeursmethode voor veel onderzoekers 9,24 - 26 vanwege de hoge doorvoer capaciteit, analyse van EV gebruik FCM geweestnotoir moeilijk vanwege hun grootte en het ontbreken van discrete positieve populatie 27-32. Vergeleken analyse van cellen, de kleine afmeting van de EVS leidt 1) minder fluorescentie geëmitteerd door het kleinere aantal antigenen per deeltje en 2) beperkte haalbaarheid van post-vlek wassen, nodig om achtergrondfluorescentie te verminderen. Gemeenschappelijke uitdagingen onder onderzoekers onder meer signalen die voortvloeien uit immunoglobuline aggregaten 27,28 en zelf-aggregatie van antilichamen 29. Bovendien is de lange doorlooptijden en langdurige wassen / isolatieprocedures gebruikt door veel van de huidige protocollen 33,34 vereisen meerdaagse tijdverplichtingen een klein aantal te analyseren, waardoor ze minder dan ideaal voor high throughput toepassingen. Sommige onderzoekers af te zien van een wasstap helemaal, waardoor traditioneel gebruikt FCM negatieve controles, zoals fluorescentie min één (FMO) en antilichaamisotypen nutteloos voor nauwkeurig te beoordelen background fluorescentie 30.
De protocollen richten drie gemeenschappelijke problemen juiste FCM analyse van EV kan belemmeren: signalen die door antilichaam aggregaten en andere niet-vesicles, moeilijk verwijderen van ongebonden antilichaam en het gebrek aan waarneembare positieve populaties. De hier beschreven technieken zullen helpen bij het elimineren van het antilichaam aggregaten aangetroffen in commerciële preparaten, toenemende signaal-ruisverhouding en het instellen poorten beredeneerd dat detectie van de achtergrond fluorescentie minimaliseert. Twee verschillende detectiemethoden worden hier gepresenteerd: het eerste protocol gebruikt individuele detectiemethode is bijzonder geschikt voor het analyseren van een grote hoeveelheid klinische monsters, terwijl het tweede protocol gebruikt een kralen gebaseerde methode voor de weergave en sporen kleiner EV en exosomes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: De volgende protocollen zijn uitgevoerd in overeenstemming met alle institutionele, nationale en internationale richtlijnen voor het menselijk welzijn. Alle menselijke subject monsters werden getest onder een institutionele Review Board (IRB) -gekeurd protocol en met geïnformeerde toestemming van de proefpersonen.
1. METHODE A: Individuele Detection Method
1.1) Verwerking van Bloedmonster / Isolatie van EV's
- Trekken bloed van de donor / patiënt in twee 10 ml glazen buizen met 1,5 ml van ACD-Solution Een of andere geschikte antistollingsmiddel en proces onmiddellijk (binnen 30 min max) met behulp van de volgende 2-step differentiële centrifugatie protocol.
LET OP: Dit protocol zal ongeveer 10 ml van bloedplaatjes arm plasma (PPP) opbrengst uit de gecombineerde ~ 17 ml bloed getrokken. Indien meer of minder PPP nodig is, kan het aantal buisjes bloed verzameld dienovereenkomstig aangepast. - Centrifugeer de monsters bij 1500 xg gedurende 10 min bij RThet plasma scheiden van de bufferlaag en de rode bloedcellen. Transfer 1,2 ml porties van het bovenstaande plasma tot 1,5 ml centrifuge buizen, dat evenwel niet tot de onderste lagen met de buffy coat en rode cellen verstoren.
- Spin bij 13.000 xg gedurende 10 min bij RT bloedplaatjes en grote cel fragmenten verwijderen. Breng zorgvuldig de PPP achterlating 200 pl niet te verstoren de pellet en voeg de PPP naar een nieuwe buis.
- Op dit moment, onmiddellijk PPP voor analyse of overdracht in 1.0 ml aliquots nieuwe 1,5 ml centrifugebuizen en bewaar bij -80 ° C gedurende twee jaar voor latere analyse (zie figuur 1A voor overzicht).
- Als gezuiverd EV nodig voor functionele experimenten overdracht 6 ml PPP een ultracentrifuge buis en voeg 28 ml van 0,2 urn gefiltreerd fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Centrifugeren gedurende 60 min bij 100.000 xg bij kamertemperatuur met een ultracentrifuge uitgerust met een swinging bucket rotor. Zuig supernatant en resuspendeer EV pellaat in 1,5 ml media.
OPMERKING: Voor de hoogste reproduceerbaarheid, moeten bloedmonsters zo consequent mogelijk worden verwerkt van de donor tot donor. Variaties in de EV isolatie methode kan van grote invloed zijn het aantal en de aard van de EV's gedetecteerd.
1.2) Het voorbereiden van monsters voor analyse
Opmerking Vanaf dit punt, de stappen toelichten high throughput protocol voor de analyse van 12 monsters voor 14 markers in 3 panelen. Maar andere combinaties van antilichamen die hier worden gebruikt; het protocol kan worden aangepast aan andere EV populaties te bestuderen door het substitueren van de voorgestelde markers voor die plaats.
- Verwijder 12 monsters uit diepvriezer (indien opgeslagen bij -80 ° C) en ontdooien bij 37 ° C.
- Inhoud pipet op en neer meerdere malen om te mengen. Verwijder 320 pi van elk monster en aan de bovenste rij van een 96 putjesplaat.
OPMERKING: breedte verstelbare multiwell-pipet is zeer nuttig voor deze en vele andere stappen gehele ezelay, met name bij de analyse van meerdere monsters tegelijk.
1.3) kleuring EV Monsters
- Voorafgaand aan vlekken, filteren alle antilichamen (Abs) om aggregaten te verwijderen, die positieve signalen kunnen veroorzaken.
- Combineer antilichamen worden gebruikt in elk van de 3 panelen in afzonderlijke 0,22 pm centrifugaal filter en centrifugeer met een vaste hoek single speed centrifuge (~ 750 xg) bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten, of totdat alle Ab mengsel door het filter en zonder antilichaam vloeistof achterblijft op het oppervlak van het filter. Store Ab cocktails in de koelkast voor maximaal twee weken, maar re-filter elke keer voor gebruik.
- Voeg de juiste hoeveelheid gefilterd Ab mengsel aan elk putje in rij 2 (bijvoorbeeld monsters Panel I worden gekleurd met 2 pl van elk Ab, dus een totaal van 12 ul van de gefiltreerde Ab cocktail toegevoegd per putje naar rij 2). Zie Figuur 1B voor een overzicht van de voorgestelde plaat kaart. Herhaal deze aanvullings om de rijen eronder als er meer panelen worden uitgebaat (hier, voeg 8 pl / putje van het Panel II cocktail naar rij 3 en 11 pl / putje van het Panel III cocktail naar rij 4; zie Materialen Lijst voor specifieke paneel informatie).
- Met de multichannel pipet, meng de PPP monsters in rij 1 op en neer en breng 100 ui van de putjes in rij 1 aan de putjes in rij 2. Meng en neer. Verandering tips en herhaal, overdragen 100 ul van rij 1 tot rijen 3 en 4. Incubeer bij 4 ° C gedurende 30 min.
1.4) Wassen MV Monsters
- Verwijder de plaat met 96 putjes bij 4 ° C en overdracht biologische veiligheidskast. Met een multichannel pipet wordt 220 pl PBS / putje rijen 6-8 (te gebruiken voor het spoelen / wassen van de putjes met gekleurd PPP).
- De inhoud van elk putje te gelabelde centrifugaal filter buizen met de breedte verstelbare multichannel pipet (voor 12 monsters, met 3 panelen van antilichamen, 12 x 3 = 36 filter eileidersvereist). Met dezelfde tips, verwijder 200 pl PBS wassen van de rijen en aan de corresponderende putten waaruit PPP net werd verwijderd.
- Meng en omlaag om de putjes te spoelen en breng de spoeloplossing dezelfde filters waarop de PPP is eerder toegevoegd. Sluiten toppen van centrifugale filters. Verandering tips.
- Herhaal dit proces met de resterende lood monsters totdat alle gekleurde PPP monsters zijn overgedragen samen met hun spoeloplossingen centrifugale filters.
- Breng de centrifugale filters om een vast rotor centrifuge en centrifugeren bij 850 g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur.
OPMERKING: Zorg ervoor dat er geen vloeistof blijft op het filter toppen. Na centrifugeren moet het filter verschijnen naar "dry" met geen zichtbare vloeistoflaag nog bovenop. Hoewel de kans kunnen bepaalde PPP monsters langere centrifugeertijd om effectief bewegen door het filter. - Verwijder de centrifugaal filter buizen en terug te keren naar de biologische veiligheid kabinet.Met de multichannel pipet, resuspendeer de toppen van de filters in 300 pl PBS. Breng de geresuspendeerd inhoud naar vooraf gelabelde buizen voor onmiddellijke FCM analyse.
Opmerking: Het is zeer belangrijk om de kracht en het aantal pipet zuiger depressies overeenstemming tussen monsters bij monster tot monster variatie voorkomen. Dit zou idealiter worden gemaakt van een elektronische pipet die is geprogrammeerd om op en neer specifiek volume pipet (bijvoorbeeld 280 ui) een geheel aantal keren (bijvoorbeeld 8 keer) voor elk monster.
1.5) Cytometer Setup
- Open de FCM-software. Voorafgaand aan de opstelling te experimenteren, uit te voeren dagelijkse kalibratie en setup met setup instrument kralen (volgens de instructies van de fabrikant).
- Als ES monsters werden gekleurd met meer dan één antilichaam en meerdere fluorochromen moeten worden gemeten tegelijk berekenen correctiewaarden als volgt:
- Voeg 2 druppels van de schadevergoeding kralen voor een pregemerkte buizen (1 buis voor elke fluorochroom-geconjugeerd antilichaam) en voeg de aanbevolen hoeveelheid antilichaam. Voeg 2 druppels van negatieve compensatie kralen aan een andere buis te gebruiken als de ongekleurd compensatieregeling.
- Incubeer bij 4 ° C gedurende 30 minuten, wassen met PBS en resuspendeer in 400 ul van PBS.
- Met behulp van de flowcytometer software die bij het instrument, voert elke compensatie buis en pas fluorescerende spanningen aan elke piek plaats op ongeveer 10 4 op een 5-decennium log schaal. Zorg ervoor dat de fluorescentie piek hoogste (helder) in zijn eigen kanaal fluorescentie in vergelijking met alle andere kanalen en spanningen van fluorescerende parameters aan te passen indien nodig opnieuw. Run elk individueel gekleurd comping buis en vastleggen van minstens 5.000 evenementen per buis.
- Selecteer het tabblad "Experiment", selecteer vervolgens "Compensatie", selecteer vervolgens "Bereken Compensation" op schadevergoeding waarden gelden voor alle monsters.
- Tijdens het uitvoeren van een buis van 0,22 pm gefiltreerd PBS, passen de FSC en SSC spanningen op de hoogste waarden die de meerderheid van achtergrondruis (dat wil zeggen, net onder de spanning drempel waarbij incidentie overtreft 5 events / sec) uitsluiten.
- Vervolgens voert u een buis met 0,2 micrometer - 1,0 micrometer kralen, verdund in PBS indien nodig. In een FCS vs. SSC plot, trek een hek rond de kraal bevolking om gebeurtenissen vast te leggen tussen 0,2 micrometer en 1,0 micrometer. Als alternatief, in een SSC-H histogram, trek je een poort naar alle evenementen kleiner dan de 1,0 micrometer kralen bevatten.
- Stel het debiet van de cytometer op "Lo" (ongeveer 8-12 pl / min). De kralen buis (of ander buisje dat een bekende concentratie van korrels) Stel het debiet knop op de cytometer tot de avondnt tarief bereikt ongeveer 200 evenementen / sec. Lees alle monster buizen bij hetzelfde debiet en maken gebruik van dezelfde kraal concentratie in toekomstige experimenten te zorgen voor een consistente tussen runs die debieten blijven.
- Voer een buis regenboog fluorescerende deeltjes verdund in PBS. Verwerven 5.000 evenementen. Noteer de gemiddelde intensiteit waarden voor FSC, SSC, en elk kleurkanaal. Met deze waarden spanningen in toekomstige experimenten aangepast om die fluorescentie-intensiteiten overeenstemming tussen experimenten blijven.
1.6) Monster Reading
- Stel stroomsnelheid van de cytometer op "Lo" (ongeveer 8-12 ul / min) en elk monster gedurende precies 1 of 2 min draaien.
- Na de eerste lezing, voeg 20 ui 10% NP-40 aan elk monster, pipet op en neer, en herlezen voor dezelfde tijd (1 of 2 min), om de aftrekking van positieve gebeurtenissen gedetecteerd in de gelyseerde steekproef over een gelijke periode.
OPMERKING: Het is zeer important dat monsters gemengd worden met een pipet in plaats van een vortex. In onze ervaring, kunnen vortexen veroorzaken zelf-aggregatie van een aantal antilichamen, wat leidt tot-EV nabootsen positieve gebeurtenissen. - Nadat alle monsters zijn gelezen, export .fcs alle bestanden in een apart bestand worden gebruikt voor verdere analyse met behulp FCM-analyse software.
1.7) Data Analysis
- Open de FCM analyse software. Importeer alle .fcs bestanden in een nieuw experiment bestand.
- Open de kralen alleen-buis. In het FSC-A vs. SSC-A plot, trek een hek rondom alle kralen grootte tussen 0,2 micrometer en 1,0 micrometer. Dit is de EV-poort. Sleep om toe te voegen aan alle monsters.
- Met behulp van de gelyseerde monsters als negatieve controles, trekken poorten aan de rand van de achtergrond fluorescentie in elke fluorescentie kanaal gebruikt. Sleep fluorescerende poorten in de EV poort van elke overeenkomstige niet-gelyseerde monster.
LET OP: Op dit punt is het ook nuttig om twee fluorescerende bi-parameter plots onderzoeken. Raket vormen indubbele-positieve kwadrant (zie figuur 8), met name wanneer de merkers bekend-verbonden celtypen te wonen, kan een aanwijzing artefact door aggregatie of andere vesikels nabootsen evenementen. - Voor elke fluorescerende marker, aftrekken van het aantal gebeurtenissen in de gelyseerde monster van het aantal gebeurtenissen in de niet-gelyseerde monster. Eventueel verdeel dit aantal door het totale aantal EV binnen het niet-gelyseerde EV poort% positieve waarden krijgen.
2. B METHODE: Kralen Methode
2.1) Verwerking van Bloedmonster / Isolatie van EV's
- Raadpleeg het bloed verwerkingsmethode in methode A (punt 1.1) beschreven.
2.2) Het voorbereiden van monsters voor analyse
- Indien gewenst, fractioneren PPP of ultracentrifugeerd EV's in exosomen en microvesicles. Voeg 250 ul van PPP of geultracentrifugeerd EVs 0,22 pm centrifugale filters en over te dragen aan een vaste rotor centrifuge en draaien op 750 xg gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
OPMERKING: Zorg ervoor dat er geen vloeistof blijft op het filter toppen. Na centrifugeren moet het filter verschijnen naar "dry" met geen zichtbare vloeistoflaag nog bovenop. Hoewel de kans kunnen sommige monsters een iets langere centrifugeertijd voor het fluïdum effectief bewegen door het filter vereist. - Was ongecoat 6 urn polystyreen korrels (bijvoorbeeld negatief AbC korrels) 2x met RPMI media en resuspendeer in 2 ml. Voeg 6,000 kralen elke FACS buis. De negatieve controle buis, voeg 400 ul van RPMI medium alleen aan de kralen. Om alle andere buizen, voeg 200 ul van PPP of ultracentrifugeerd EV (of fracties) en 200 ul van RPMI media.
- Stel het uiteindelijke volume van alle buizen 400 ul met media en incubeer overnacht bij 4 ° C op een schudder.
- De volgende ochtend was kralen met 2 ml medium. Zuig het supernatant.
- Blokkeren met 5% bovine serum albumine (BSA) in medium (400 ul) gedurende 3 uur bij 4 &# 176, C op een schudder.
- Was kralen met 2 ml medium. Zuig en resuspendeer pellet in 100 pl medium.
2.3) kleuring EV Monsters
- Filter alle antilichamen. Gebruik hetzelfde antilichaam panelen van methode A, of indien gewenst, maakt een andere combinatie van antilichamen zolang hun fluorochromen verenigbaar zijn met elkaar.
- Combineer alle antilichamen voor gebruik in een paneel in een 0,22 urn filter centrifugale buis. Centrifuge met een vaste hoek enkele snelheid centrifugeer gedurende 2 minuten of totdat alle Ab mengsel door het filter en zonder antilichaam vloeistof achterblijft op het oppervlak van het filter.
- Voeg het juiste volume gefiltreerd antilichaam cocktail alle buizen en incubeer gedurende 30 minuten bij 4 ° C.
- Was kralen met 2 ml van de media, resuspendeer in 400 ul van media en onmiddellijk uit te voeren (of binnen dezelfde dag) op stroomcytometer.
2.4) Cytometer Setup en Sample Reading
- Open de FCM-software. Voorafgaand aan de opstelling te experimenteren, uit te voeren dagelijkse kalibratie en setup met setup instrument kralen (volgens de instructies van de fabrikant).
- Als ES monsters werden gekleurd met meer dan één antilichaam en meerdere fluorochromen moeten worden gemeten tegelijk berekenen correctiewaarden als volgt:
- Voeg 2 druppels van de schadevergoeding kralen om vooraf gelabelde buizen (1 buis voor elke fluorochroom-geconjugeerd antilichaam) en voeg de aanbevolen hoeveelheid antilichaam. Voeg 2 druppels van negatieve compensatie kralen aan een andere buis te gebruiken als de ongekleurd compensatieregeling. Incubeer bij 4 ° C gedurende 30 minuten, wassen met PBS en resuspendeer in 400 ul van PBS.
- Met behulp van de FCM-software, draaien elke compensatie buis en pas fluorescerende spanningen aan elke piek plaats op ongeveer 10 4 op een 5-decennium log schaal. Zorg ervoor dat de fluorescentie piek is het hoogst (helderste) in zijn eigen tl-kanaal in vergelijking met alle andere kanalen, eneventueel spanningen van fluorescerende parameters instellen weer. Run elk individueel gekleurd comping buis en vastleggen van minstens 5.000 evenementen per buis.
- Selecteer het tabblad "Experiment" en vervolgens "Compensatie" en vervolgens "Bereken Compensation" op schadevergoeding waarden gelden voor alle monsters.
- Wijzig de FSC en SSC spanning parameters op schaal te melden en selecteer de laagste drempels toegestaan door de cytometer (FSC = 200 en SSC = 200) voor elk.
- Run monsters, hek aan de singlet kralen bevolking en het verwerven van 2.000 gebeurtenissen in deze poort. Bestanden export .fcs.
- Gebruik FCM analyse software om .fcs analyseren bestanden. Poort op singlet kralen. Bereken de geometrische gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI) van elk fluorochroom en vergelijken met de MFI van de negatieve controle.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 schetst de algemene opzet voor de isolatie en detectie van EV behulp van de korrel gebaseerde methode of afzonderlijke detectiemethode verwerking. Individuele detectie van EV gebruik FCM werkt goed voor het analyseren grotere EV maar de meeste cytometers niet kunnen afzonderlijk detecteren deeltjes tot exosomes. Een kraal aanpak kunnen kleine EV's te detecteren, maar er zijn nadelen verbonden met deze methode, zoals aangegeven in tabel 1. In het algemeen, isolatie van EV met ultracentrifugatie (met of zonder toevoeging van een sucrose gradiënt fractionering) is aanbevolen wanneer EV's nodig voor functionele bepalingen. Ultracentrifugatie verwijdert onzuiverheden zoals serumeiwitten en andere oplosbare verontreinigingen uit het plasma, wat invloed kan hebben functionele experimentele resultaten. Echter, ultracentrifugatie is tijdrovend en kan EV kwantiteit en kwaliteit 12 veranderen.
"> Verwachte resultaten voor de twee detectie-assays zijn weergegeven in Figuren 2-3. Voor de afzonderlijke detectie assay, de gelyseerde controle (onderste rij, figuur 2) wordt gebruikt om poorten voor de overeenkomstige niet-gelyseerde monster (bovenste rij ingesteld figuur 2). Het overgrote deel van de gebeurtenissen binnen de EV poort vallen. Quadrant poorten mag niet onthullen dubbele positieve gebeurtenissen wanneer de twee markers in vergelijking worden niet normaal op dezelfde cel. De juiste biparameter percelen in Figuur 2 tonen de markers CD108a en CD235a die twee rode bloedcel markers bekend naast elkaar op cellen. Hier, aan EV meer dan de helft van de positieve gebeurtenissen positief voor beide markers, zoals verwacht. Op dezelfde wijze celoppervlak markers bekend op dezelfde cel bevinden dienen vertonen gelijkaardige patronen van dubbele positiviteit op EV's. Het centrum biparameter kavels tonen EV expressie van twee markers die bekend staan niet naast elkaar op cellen. In deze analyse van CD235a (een rode Blood cel marker) en CD41a (een bloedplaatjes marker), de EV's tonen duidelijke, aparte, positieve populatie, waarvan wordt verwacht, omdat ze afkomstig zijn uit verschillende celtypen. Wanneer lyseerden, moet positieve gebeurtenissen verdwijnen. In het algemeen positieve gebeurtenissen overblijft na lysis de aanwezigheid van signaal van niet-vesikel deeltjes, aggregaten en / of detergens-resistente EV. Figuur 3 toont verwachte resultaten met de kraal gebaseerde detectiemethode. In tegenstelling tot de afzonderlijke detectiemethode deze gegevens kan / moet niet worden gezien bi-parameter plots. In de bovenste puntdiagrammen, geen scheiding tussen de positieve en negatieve populaties bestaan en gebeurtenissen worden in een dubbele positieve kwadranten hoewel ze niet normaal op dezelfde celtypen vanwege het feit dat beide soorten EV zal binden aan een kraal. Voor de kraal-gebaseerde detectiemethode, worden de gegevens het best geanalyseerd met behulp van het histogram overlays met de negatieve controle (afgebeeld onder de puntdiagrammen). Positiviteit is gemeten met MFI van een marker (gemiddelde fluorescentie-intensiteit) en direct vergeleken met die van de negatieve controle. Indien een monster is positief voor de marker betrokken zal zijn MFI hoger dan de negatieve controle. De negatieve controle voor de kraal methode is eenvoudig kralen geblokkeerd met BSA (zonder toegevoegde EV), die zijn gekleurd met dezelfde antilichamen en langs de EV-beklede parels gewassen. Een vergelijking van de verwachte resultaten met de twee methoden is te zien in figuur 4.Het vermogen van de individuele opsporing test om EV fenotypes goed te kunnen beoordelen leunt zwaar op de juiste gating naar Ab-positieve gebeurtenissen uit de achtergrond fluorescentie te scheiden. Daarom is het essentieel om een negatieve controle die het beste worden nabootst / voorspelt achtergrond fluorescentie voor een gegeven monster kiezen. Als lood EVs niet vóór het lezen van zijn gewassen, vaak gebruikt negatieve controles (bv isotypen) niet aan de achtergrond fluorescenc nauwkeurig te voorspellene voor alle markers (figuur 5A). In deze gevallen, als wassen geen optie, gelyseerd monsters vaak beter te voorspellen achtergrondfluorescentie werken. Echter, na kleuring EV worden gewassen voordat u (middels centrifugale filtratie, in dit geval), zowel negatieve controles (isotypes en gelyseerd monsters) goed voor het voorspellen achtergrond fluorescentie van een monster (figuur 5A). Er zij opgemerkt, dat terwijl alle negatieve controles "werk" gelyseerde controles voorkeur omdat zij aanvullende informatie over een monster (bijvoorbeeld de aanwezigheid van detergens resistent niet vesikel-gerelateerde gebeurtenissen en / of aggregaten) die kan leiden tot niet-EV positieve signalen en onjuist opblazen Ab telt. Bovendien kan isotype controles soms onbetrouwbaar, zelfs in gewassen monsters, zoals getoond in figuur 5B, waarbij het gekleurde monster minder positieve gebeurtenissen dan hetzelfde monster gekleurd met isotype gematched controle antilichamen. Zonder grondige verwijdering van ongebonden antilichaam, FCM puntdiagrammen van sommige EV markers zijn bijna onmogelijk te interpreteren, zoals opgenomen in de wolken van vaag fluorescerende deeltjes niet te onderscheiden van hun zeer fluorescerende achtergronden (Figuur 6, top perceel). Wassen in lood monsters met behulp van centrifugale filters verbetert de scheiding tussen de achtergrond en positieve marker signalen (Figuur 6, onderaan perceel); echter, kunnen kleine EV en exosomes verloren door de poriën van het filter.
Het gebruik van een detergens lysis stap laat positieve vesikel nabootsen gebeurtenissen uit immuuncomplexen en eiwit aggregaten 21. Wanneer PPP wordt geanalyseerd met behulp van individuele detectie, stuit positieve gebeurtenissen die niet verdwijnen met lysis is een vrij vaak voorkomen. Deze detergent-resistente gebeurtenissen verschijnen vaak als verdachte, zeer fluorescerende diagonale signalen in zowel enkele parameter en biparameter percelen (Figuur7). Klinisch deze eiwitcomplexen en / of onoplosbaar immuuncomplexen meer voorkomen bij patiënten lijden aan verschillende ziekten 21 zoals reumatoïde artritis 28, nefrotisch syndroom 19, en systemische lupus erythematosus 29. Daarom, afhankelijk van het doel van het onderzoek, kan men wil opnemen of verwijderen uit de analysis.Another manier diagonale signalen gevormd is door vortexen de monsters, met name na de toevoeging van de lysis reagens (Figuur 8). Monsters moeten altijd worden gemengd en door een pipet aan de vorming van aggregaten te voorkomen.
Figuur 1: Gemiddelde verwerkingsschema voor de isolatie en detectie van EV behulp van de korrel gebaseerde methode of individuele detectiemethode. (A) Volbloed wordt eerst verwerkt tot PPP. Van dere, PPP kan ofwel verder worden verwerkt met behulp van ultracentrifugatie om geïsoleerde EV's opleveren of gebruikt als-is in de individuele opsporing of-bead-gebaseerde testen. (b) een overzicht van voorgestelde plaat kaart voor hoge doorvoer analyse van het monster met behulp van de individuele detectiemethode. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2:. Verwachte resultaten voor Individuele Detection Doorstroomcytometrie puntdiagrammen tonen vertegenwoordiger kleuring van gelyseerd en niet-gelyseerde EV monsters. Waarden geven de percentages positieve gebeurtenissen. De meerderheid van de gebeurtenissen binnen de EV poort vallen. Evenementen in de juiste biparameter percelen liggen binnen het FSC / SSC EV poorten aan de linkerkant. De gelyseerde monster (onderste rij) wordt gebruikt om op basis van fluorescentie poorten voor TEAch bijbehorende (niet-gelyseerde) monster. Quad poorten mag niet onthullen dubbele positieve gebeurtenissen wanneer de twee markers in vergelijking worden niet normaal op dezelfde cel. Hier, de biparameter CD235a en CD41a plot geeft grafisch weer een duidelijke scheiding tussen de EV uiten rode bloedcel markers en die uiten bloedplaatjes cel markers. Evenzo moeten celoppervlak merkers bekend op dezelfde cel te verblijven soortgelijke gemiddelde dubbele positiviteit op EV tonen. De juiste biparameter plot laat zien dat meer dan de helft van CD235a-positieve EV's zijn ook positief voor de secundaire rode bloedcellen (RBC) marker, CD108a. Wanneer lyseerden, moet positieve gebeurtenissen verdwijnen. Positieve gebeurtenissen overblijft na lysis de aanwezigheid van signaal van niet-vesikel of reinigingsmiddelenbestendige deeltjes en / of aggregaten.
Figuur 3: Verwachte resultaten met behulp van de kraal-gebaseerde detectiemethode. Flowcytometrie dot plots tonen representatieve kleuring van EV gekoppeld aan korrels, in vergelijking met korrels geblokkeerd met BSA, die dient als negatieve controle. Waarden geven de percentages positieve gebeurtenissen. Evenementen in de juiste biparameter percelen liggen binnen het FSC / SSC kralen poorten aan de linkerkant. Voor de-kralen gebaseerde detectiemethode worden gegevens best geanalyseerd met behulp van het histogram overlays met de negatieve controle (afgebeeld onder de puntdiagrammen). Positiviteit wordt gemeten met MFI van een marker (gemiddelde fluorescentie-intensiteit) en direct vergeleken met die van de negatieve controle.
Figuur 4:. Vergelijking van de verwachte resultaten met behulp van kralen versus individuele detectie Doorstroomcytometrie puntdiagrammen tonen vertegenwoordiger kleuring van EV's gekoppeld aan kralen (bovenste rij), ten opzichte van EV's te analyseren met behulp van individuele detectie (onderste rij). Evenementengetoond in de juiste biparameter percelen liggen binnen het FSC / SSC kralen poorten aan de linkerkant.
Figuur 5:. Vergelijking van verschillende negatieve controles in individuele detectie analyse Waarden geven de percentages positieve gebeurtenissen. Evenementen getoond zijn binnen het FSC / SSC EV gate. (A) Vergelijking van de negatieve controles in ongewassen vs. gewassen monsters. Isotype of gelyseerde controles werden geëvalueerd op hun vermogen om de juiste indicaties achtergrondfluorescentie voorzien in twee merkers in een volledig gekleurd monster (onderste rij). Poorten voor elke marker werden gemaakt met behulp van de gelyseerde monster (bovenste rij) en vervolgens gekopieerd naar de rijen eronder. Gewassen monsters werden gewassen met behulp van post-vlek filtratie. (B) Voorbeeld van een monster gekleurd met de isotypecontrole met meer positieve gebeurtenissen dan het monster gekleurd with werkelijke antilichaam.
Figuur 6:. Het effect van post-vlek wassen in de individuele opsporing Waarden geven de percentages en aantallen positieve gebeurtenissen. Evenementen getoond zijn binnen het FSC / SSC EV gate. Poorten voor elk monster werden gemaakt met behulp lyseerden tegenhanger elk monster's (niet weergegeven; zie vorige figuur voor de poort-instelling in ongewassen vs gewassen monsters). Hoge achtergrond fluorescentie maakt het onderscheiden positieve van negatieve gebeurtenissen moeilijk (top perceel). Bij gewassen, maar de positieve populatie wordt geopenbaard als ongebonden fluorescerende antilichamen verwijderd en de achtergrond fluorescentie wordt (onderste grafiek).
Figuur 7: Detergent lysis bevestigt de aanwezigheid van niet-EV signals. Evenementen getoond zijn binnen het FSC / SCC EV gate. Waarden geven de percentages positieve gebeurtenissen. Gekleurd EV monsters werden vóór (linker kolom) gelezen en na toevoeging van detergens (rechterkant) positieve signalen door immuuncomplexen en andere niet-EV-gerelateerde gebeurtenissen identificeren.
Figuur 8: vortexen veroorzaakt het ontstaan van niet-EV signalen Evenementen getoond zijn binnen het FSC / SCC EV gate.. Waarden geven de percentages positieve gebeurtenissen. Gekleurd EV monsters werden vóór (linker kolom) en na toevoeging van detergens (rechterkant) gelezen. Met behulp van een vortex om monsters te mengen kan veroorzaken-EV nabootsen, diagonaal populatie te vormen (bovenste rij). Wanneer gemengd zachtjes op en neer met behulp van een pipet, maar de vorming van deze populaties kunnen worden vermeden (onderste rij). Vortexen wordt niet aanbevolen voor het mengen, als het aggregatie in sommige monsters kunnen veroorzaken, leaDing om diagonaal-verschijnen, positieve populaties. In het algemeen moeten gebeurtenisnummer bij een positieve poort niet toe na lyseren.
| Kraal-gebaseerde detectie | Individuele Detection | |
| EV Maten | aanbevolen voor <100 nm | aanbevolen> 100 nm alleen |
| Tijd | vereist overnacht incubatie | kunnen voltooien <1 dag |
| Gevoeligheid | cluster detectie | enkel deeltje detectie |
| Resultaten | kwalitatieve | kwantitatief |
| Het wassen | eenvoudige, standaard centrifugeren | vereist centrifugale filters |
| Negatieve controle | BSA beklede parels | lyseerden monsters |
Tabel 1: Voors en tegens van beide detectiemethoden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Twee verschillende protocollen voor de isolatie, de behandeling en analyse van EV's werden gepresenteerd, met behulp van een individuele opsporing of-bead gebaseerde aanpak. Het selecteren van de meest geschikte methode te gebruiken is niet altijd eenvoudig en vereist een goed begrip van het monster wordt ook getest als de individuele subpopulaties van belang. Bovendien moet de gevoeligheid van de cytometer voor verwerving worden overwogen bij het kiezen van de meest geschikte methode. Vaak is er geen enkele beste protocol te gebruiken, eerder een combinatie van werkwijzen verschaft meer informatie over een monster dan één methode alleen. Idealiter verschillende isolatie- en detectietechnieken eerst bestudeerd om een maat protocol dat rekening houdt met individuele cytometer prestaties met betrekking tot de specifieke EV onderzochte populatie ontwikkelen. Alternatieve isolatietechnieken omvatten ultracentrifugatie, sucrose dichtheid fractionering immunomagnetische bead scheiding, chromatografie en affiniteit zuivering 12, terwijl alternatieve detectiemethoden omvatten scanning elektronenmicroscopie transmissie elektronenmicroscopie, atomic force microscopie, dynamische lichtverstrooiing en western blotting 8. Door verschillende technieken, kan de hier gepresenteerde werkwijzen worden aangepast om protocollen meest geschikt voor het bestuderen van verschillende populaties EV plaats creëren.
In het algemeen individuele detectie van EV's met behulp van FCM werkt goed voor het analyseren van grotere EV's maar verliest gevoeligheid als EV's kleiner. Terwijl de individuele opsporing is meer consistent in het opsporen van grotere EV's, kraal-gebaseerde detectie minder gevoelig is in het opsporen van grotere EV's en gevoeliger voor exosomen. Grotere EV's kunnen eenvoudig via de post-vlek filtratie worden gewassen en via FCM afzonderlijk gedetecteerd. Kleinere EV en exosomes, anderzijds, niet goed individueel gedetecteerd met FCM en zijn veel moeilijker na kleuring wassen. De kraal-captureprotocol lost beide problemen, waardoor EV gemakkelijk te wassen en meerdere EV elkaar worden gemeten om grotere positieve signalen gedetecteerd door FCM creëren. Er zijn echter nadelen verbonden met deze methode, zoals aangegeven in tabel 1.
Bij het werken met een minder gevoelige cytometer, de capaciteit voor afzonderlijke detectie beperkt. Vóór EV analyse moet de gevoeligheid van de cytometer worden vastgesteld door een mengsel van korrelgroottes variëren 0,1-1,0 urn. Niet de cytometer de meerderheid van deeltjes kleiner dan 1,0 urn te detecteren zou het gebruik van de parel gebaseerd protocol noodzakelijk. Zeer uitgedrukt markeringen zijn gemakkelijk gedetecteerd met behulp van protocol. Zeldzamer populaties soms gemakkelijker te detecteren via het uniforme deeltjes detectieprotocol plaats van de kraal capture protocol, maar dit kan variëren afhankelijk van variabelen zoals: de helderheid van het fluorochroom het monster EV: bead ratie en de omvang van de EV met het zeldzame celoppervlaktemarker. Detectie van meerdere merkers op een enkel deeltje is het gebruik van de afzonderlijke detectiemethode. De met parels gebaseerde methode niet kan individuele EV detectie. Daarom zal de kraal gebaseerd protocol data die zijn kwalitatief van aard opleveren, terwijl de individuele detectiemethode meer kwantitatieve gegevens geven.
Extra isolatie technieken moeten worden gebruikt wanneer EV's zijn nodig voor verdere toepassingen. EV in functionele testen worden ultracentrifuge met de 3-staps differentiële centrifugatie protocol, aangezien de oplosbare serumeiwitten in plasma kunnen beïnvloeden functionele experimentele resultaten. Voor karakterisering van EV echter ultracentrifugatie wordt afgeraden, omdat deze toegevoegde stap EV kwaliteit en kwantiteit kunnen beïnvloeden door de hoge krachten uitgeoefend op de deeltjes 12.
De individuele detectie protocol bevat several belangrijke stappen geoptimaliseerd voor high-throughput testen, waaronder: 1) de toepassing van centrifugale filters voor de snelle en efficiënte verwijdering van positieve gebeurtenissen door Ab aggregaten, 2) het gebruik van filters als een praktisch alternatief ultracentrifugatie of sucrose gradiënt fractionering voor het wassen van ongebonden Ab van EV monsters na kleuring, en 3) het gebruik van detergens lysis als een negatieve controle, die niet alleen blijkt positieve gebeurtenissen veroorzaakt door niet-EV maar geeft een goede benadering van achtergrond fluorescentie positieve onderscheiden van negatieve populaties voor tekenen poorten. De individuele detectieprotocol wordt aanbevolen wanneer een groot aantal monsters nodig tests als in één dag kunnen worden uitgevoerd, terwijl de kraal gebaseerde methode vereist een nacht incuberen.
De negatieve controles in elk protocol verschillende voor- en nadelen afhankelijk van de detectiemethode gebruikt. Een voordeel van het gebruik van de kraal gebaseerde eenssay is dat hetzelfde monoklonale antilichamen kunnen worden gebruikt voor negatieve en positieve buizen en hetzelfde negatieve controle kan worden gebruikt voor alle monsters. De individuele detectiemethode, daarentegen, vereist afzonderlijke bedieningsorganen te lezen voor elk getest monster. De negatieve controle die door de afzonderlijke detectie protocol gebruikt gelyseerde monsters, die niet vereisen het gebruik / verbruik van extra antilichamen maar vereisen dat elke buis een tweede keer na toevoeging van het lyseermiddel worden gelezen. De gelyseerde controles het extra voordeel van de mogelijkheid om het percentage positieve signaal dat kan worden toegeschreven aan niet-vesikel-gerelateerde gebeurtenissen identificeren als immuuncomplexen 21. De kraal-gebaseerde test niet over dit vermogen todistinguish tussen positieve signalen die voortvloeien uit echte EV's en producten die voortkomen uit niet-blaasjes.
Beperkingen van de techniek
Hoewel er geen gestandaardiseerde methode voor het isoleren van EV, differentiëlecentrifugeren is een veel gebruikte techniek bij EV onderzoekers. De differentiële centrifugatie hier beschreven methode is gebaseerd op gemeenschappelijke protocollen voor het isoleren PPP die gewoonlijk vereisen een initiële centrifugering tussen 1,200-1,500 g gedurende 10-20 minuten om cellen te verwijderen, gevolgd door een tweede centrifugatie tussen 10.000-13.000 xg gedurende 10-30 min aan bloedplaatjes 35 verwijderen. De hierin beschreven protocol gebruikt een centrifugatie bij 1500 xg gedurende 10 min, gevolgd door een centrifugatie bij 13.000 xg gedurende 10 min. Hoewel hogere krachten van 25,000-100,000 xg typisch moeten EV pellet, kunnen sommige van de grotere EV verwijderen met differentiële centrifugatieprotocol we gepresenteerd.
Tot 90% van EV gedetecteerd door FCM verloren één uur ultracentrifugatie bij 100.000 xg (gegevens niet getoond). Langere centrifugeren tijden moet worden beschouwd, zij het voorzichtig, want dit kan een negatieve invloed hebben op de samenstelling van het monster. Als extra bewerking nodig fof karakterisering studies, filtratie kan worden uitgevoerd na de 2-staps centrifugatie (vóór kleuring) monsters op basis van deeltjesgrootte verder fractioneren. Vergelijkbaar met ultra-centrifugatie, filtratie kan resulteren in een verlies van maximaal 50% positieve marker gebeurtenissen en tot 90% van gedetecteerd door FCM totale deeltjes (gegevens niet getoond). Terwijl de toename van signaal-ruisverhouding is duidelijk voordeel, verlies kleinere EV vertegenwoordigt een belangrijke beperking bij het onderzoek van wassen of isolatiemethode.
Ten slotte anticoagulans (bijv, heparine, ACD, ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA), etc.) tijdens bloedafname kan de kwaliteit en kwantiteit van EV inhoud beïnvloeden. Hoewel ACD heeft bewezen een goede en betrouwbare antistollingsmiddel voor onze studies, testen meerdere oplossingen wordt aanbevolen dat de meest geschikte anticoagulans voor de toepassing gekozen. Dit is vooral belangrijk wanneer EV wordt gebruikt stroomafwaarts assayswaar het antistollingsmiddel gebruikt kan de uitkomst beïnvloeden. Bijvoorbeeld, sommige antistollingsmiddelen (bijvoorbeeld EDTA en heparine) bekend interfereren met PCR reacties terwijl anderen (bijvoorbeeld theofylline, adenosine en dipyridamol) is aangetoond EV afgifte van bloedplaatjes 12 remmen.
Methoden voor EV-analyse, terwijl aanzienlijk verbeterd in de afgelopen tien jaar, zijn nog steeds een work in progress. Uiteindelijk is de beste methoden voor het analyseren EV zal afhangen van de onderzoek gedaan en hulpmiddelen voor de onderzoeker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen graag Dale Hirschkorn van Blood Systems Research Institute bedanken voor zijn hulp bij doorstroomcytometer instrument instellingen. Dit werk werd ondersteund door NIH verleent HL095470 en U01 HL072268 en DoD contracten W81XWH-10-1-0023 en W81XWH-2-0028.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LSR II benchtop flow cytometer | BD Biosciences | 3-laser (20 mW Coherent Sapphire 488 nm blue, 25 mW Coherent Vioflame 405 nm violet, and 17 mW JDS Uniphase HeNe 633 nm red) | |
| FACS Diva software | BD Biosciences | PC version 6.0 | |
| FlowJo software | Treestar US | Mac version 9.6.1 or PC version 7.6.5 | |
| Sphero Rainbow fluorescent particles | BD Biosciences | 556298 | used to adjust all channel voltages to maintain fluorescence intensity consistency |
| Ultra Rainbow fluorescent particles | Spherotech | URFP-10-5 | used in addition to Megamix-Plus SSC beads to ensure EV gating consistency from batch to batch |
| Megmix-Plus SSC beads | Biocytex | 7803 | used to adjust FSC and SSC voltages to maintain consistency between runs. Can also used to monitor flow rate and ajust flow rate dial in order to ensure that same flow rate is used in all runs |
| AbC Anti-Mouse Bead Kit | Life Technologies | A-10344 | used for compensation controls & negative AbC beads used for beads-based method |
| Nonidet P-40 Alternative (NP-40) (CAS 9016-45-9) | Santa Cruz | sc-281108 | used in the individual detection method only to lyse samples after initial reading for use as negative controls. Stock may be diluted to 1:10 in PBS and stored in fridge for up to 1 month. |
| BD TruCOUNT Tubes | BD Biosciences | 340334 | used whenver absolute EV concentrations are needed |
| Ultrafree-MC, GV 0.22 µm Centrifugal Filter Units | Millipore | UFC30GVNB | used to post-stain wash Evs and/or fractionate EVs based on size |
| Vacutainer glass whole blood tubes ACD-A | BD Biosciences | 364606 | |
| Facs tubes 12x75 polystrene | BD Biosciences | 352058 | |
| 50 ml Reservoirs individually wrapped | Phenix | RR-50-1s | |
| Green-Pak pipet tips - 10 µl | Rainin | GP-L10S | |
| Green-Pak pipet tips -200 µl | Rainin | GP-L250S | |
| Green -Pak pipet tips - 1,000 µl | Rainin | GP-L1000S | |
| Stable Stack L300 tips presterilized | Rainin | SS-L300S | |
| Pipet-Lite XLS 8 Channel LTS Adjustable Spacer | Rainin | LA8-300XLS | |
| 96 well tissue culture plates | E&K Scientific | EK-20180 | |
| RPMI 1640 Media (without Hepes) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAE001 | media used for bead-based detection method |
| Dulbeccos PBS D-PBS, CaMg-free, 0.2 µm filtered | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL003 | |
| Ultracentrifuge Tube, Thinwall, Ultra-Clear | BECKMAN COULTER INC | 344058 | |
| PANEL I | |||
| CD3 PerCP-Cy5.5 | Biolegend | 344808 | 2 µl |
| CD14 APC-Cy7 | Biolegend | 301820 | 2 µl |
| CD16 V450 | BD Biosciences | 560474 | 2 µl |
| CD28 FITC | biolegend | 302906 | 2 µl |
| CD152 APC | BD Biosciences | 555855 | 2 µl |
| CD19 A700 | Biolegend | 302226 | 2 µl |
| PANEL II | |||
| CD41a PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 340930 | 2 µl |
| CD62L APC | Biolegend | 304810 | 2 µl |
| CD108 PE | BD Biosciences | 552830 | 2 µl |
| CD235a FITC | biolegend | 349104 | 2 µl |
| PANEL III | |||
| CD11b PE-Cy7 | Biolegend | 301322 | 2 µl |
| CD62p APC | Biolegend | 304910 | 2 µl |
| CD66b PE | Biolegend | 305106 | 2 µl |
| CD15 FITC | exalpha | X1496M | 5 µl |
| CD9 PE | Biolegend | 555372 | |
| CD63 APC | Biolegend | 353008 | |
| APC-Cy7 Ms IgG2a, κ | Biolegend | 400230 |
References
- Andaloussi, S., Mäger, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. A. Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).
- Sugawara, A., Nollet, K. E., Yajima, K., Saito, S., Ohto, H. Preventing platelet-derived microparticle formation--and possible side effects-with prestorage leukofiltration of whole blood. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 134 (5), 771-775 (2010).
- Théry, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nature Reviews Immunology. 9 (8), 581-593 (2009).
- Mause, S. F., Weber, C. Microparticles Protagonists of a Novel Communication Network for Intercellular Information Exchange. Circulation Research. 107 (9), 1047-1057 (2010).
- Bouvy, C., Gheldof, D., Chatelain, C., Mullier, F., Dogne, J. -M. Contributing role of extracellular vesicles on vascular endothelium haemostatic balance in cancer. Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).
- Hood, J. L., San, R. S., Wickline, S. A. Exosomes Released by Melanoma Cells Prepare Sentinel Lymph Nodes for Tumor Metastasis. Cancer Research. 71 (11), 3792-3801 (2011).
- Gatti, S., Bruno, S., et al. Microvesicles derived from human adult mesenchymal stem cells protect against ischaemia-reperfusion-induced acute and chronic kidney injury. Nephrology Dialysis Transplantation. 26 (5), 1474-1483 (2011).
- Barteneva, N. S., Fasler-Kan, E., et al.
- Van der Pol, E., Böing, A. N., Harrison, P., Sturk, A., Nieuwland, R. Classification functions, and clinical relevance of extracellular vesicles. Pharmacological Reviews. 64 (3), 676-705 (2012).
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
- Dinkla, S., Brock, R., Joosten, I., Bosman, G. J. C. G. M. Gateway to understanding microparticles: standardized isolation and identification of plasma membrane-derived vesicles. Nanomedicine (London, England). 8 (10), (2013).
- Witwer, K. W., Buzas, E. I., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
- Shah, M. D., Bergeron, A. L., Dong, J. -F., López, J. A. Flow cytometric measurement of microparticles: Pitfalls and protocol modifications. Platelets. 19 (5), 365-372 (2008).
- Dey-Hazra, E., Hertel, B., et al. Detection of circulating microparticles by flow cytometry: influence of centrifugation, filtration of buffer, and freezing. Vascular Health and Risk Management. 6, 1125-1133 (2010).
- Lacroix, R., Judicone, C., et al. Standardization of pre-analytical variables in plasma microparticle determination: results of the International Society on Thrombosis and Haemostasis SSC Collaborative workshop. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (6), 1190-1193 (2013).
- Mullier, F., Bailly, N., Chatelain, C., Chatelain, B., Dogné, J. -M. Pre-analytical issues in the measurement of circulating microparticles: current recommendations and pending questions. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (4), 693-696 (2013).
- Peramo, P., et al. Physical Characterization of Mouse Deep Vein Thrombosis Derived Microparticles by Differential Filtration with Nanopore Filters. Membranes. 2 (1), 1-15 (2012).
- Tilley, R. E., Holscher, T., Belani, R., Nieva, J., Mackman, N. Tissue Factor Activity is Increased in a Combined Platelet and Microparticle Sample from Cancer Patients. Thrombosis research. 122 (5), 604-609 (2008).
- Rood, I. M., Deegens, J. K. J., et al. Comparison of three methods for isolation of urinary microvesicles to identify biomarkers of nephrotic syndrome. Kidney international. 78 (8), 810-816 (2010).
- Van der Pol, E., Hoekstra, A. G., Sturk, A., Otto, C., van Leeuwen, T. G., Nieuwland, R. Optical and non-optical methods for detection and characterization of microparticles and exosomes. Journal of Thrombosis And Haemostasis: JTH. 8 (12), 2596-2607 (2010).
- György, B., Szabó, T. G., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (16), 2667-2688 (2011).
- Miguet, L., Béchade, G., et al. Proteomic Analysis of Malignant B-Cell Derived Microparticles Reveals CD148 as a Potentially Useful Antigenic Biomarker for Mantle Cell Lymphoma Diagnosis. Journal of Proteome Research. 8 (7), 3346-3354 (2009).
- Smalley, D. M., Root, K. E., Cho, H., Ross, M. M., Ley, K. Proteomic discovery of 21 proteins expressed in human plasma-derived but not platelet-derived microparticles. Thrombosis and Haemostasis. 97 (1), 67-80 (2007).
- Lacroix, R., Robert, S., Poncelet, P., Dignat-George, F. Overcoming Limitations of Microparticle Measurement by Flow Cytometry. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 36 (08), 807-818 (2010).
- Mobarrez, F., Antovic, J., et al. A multicolor flow cytometric assay for measurement of platelet-derived microparticles. Thrombosis Research. 125 (3), e110-e116 (2010).
- Van der Pol, E., van Gemert, M. J. C., Sturk, A., Nieuwland, R., van Leeuwen, T. G. Single vs. swarm detection of microparticles and exosomes by flow cytometry. Journal of Thrombosis And Haemostasis: JTH. 10 (5), 919-930 (2012).
- György, B., Szabó, T. G., et al. Improved Flow Cytometric Assessment Reveals Distinct Microvesicle (Cell-Derived Microparticle) Signatures in Joint Diseases. PLoS ONE. 7 (11), e49726 (2012).
- György, B., Módos, K., et al. Detection and isolation of cell-derived microparticles are compromised by protein complexes resulting from shared biophysical parameters. Blood. 117 (4), e39-e48 (2011).
- György, B., Pasztoi, M., Buzas, E. I. Response: systematic use of Triton lysis as a control for microvesicle labeling. Blood. 119 (9), 2175-2176 (2012).
- Trummer, A., De Rop, C., Tiede, A., Ganser, A., Eisert, R. Isotype controls in phenotyping and quantification of microparticles: a major source of error and how to evade it. Thrombosis Research. 122 (5), 691-700 (2008).
- Shet, A. S., Aras, O., et al. Sickle blood contains tissue factor-positive microparticles derived from endothelial cells and monocytes. Blood. 102 (7), 2678-2683 (2003).
- Connor, D. E., Exner, T., Ma, D. D. F., Joseph, J. E. The majority of circulating platelet-derived microparticles fail to bind annexin V, lack phospholipid-dependent procoagulant activity and demonstrate greater expression of glycoprotein Ib. Thrombosis and Haemostasis. 103 (5), 1044-1052 (2010).
- Nolte-’t Hoen, E. N. M., van der Vlist, E. J., et al. Quantitative and qualitative flow cytometric analysis of nanosized cell-derived membrane vesicles. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, And Medicine. 8 (5), 712-720 (2012).
- Van der Vlist, E. J., Nolte-’t Hoen, E. N. M., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J. A., Wauben, M. H. M. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nature Protocols. 7 (7), 1311-1326 (2012).
- Orozco, A. F., Lewis, D. E. Flow cytometric analysis of circulating microparticles in plasma. Cytometry Part A. 77 A. 77A (6), 502-514 (2010).
