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Biology

प्रतिदीप्ति Protease सुरक्षा का उपयोग झिल्ली प्रोटीन टोपोलॉजी निर्धारण (FPP)

Published: April 20, 2015 doi: 10.3791/52509
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Physiology and Biophysics, Chicago Medical School

Introduction

प्लाज्मा झिल्ली, साथ ही कई intracellular झिल्ली, दो जलीय डिब्बों को अलग बाधाओं के रूप में सेवा करते हैं। प्लाज्मा झिल्ली के मामले में, जुदाई के बाहर के बीच और सेल के अंदर है; intracellular organelles के लिए यह कोशिका द्रव्य और organelle लुमेन के बीच है। उदाहरण के लिए, endoplasmic जालिका (ईआर) झिल्ली पर्यावरण एक कम करने के लिए एक साइटोसोलिक से ईआर के लुमेन के भीतर एक ऑक्सीकरण वातावरण अलग करती है। झिल्ली प्रोटीन ईआर जुड़े राइबोसोम पर संश्लेषित, और ईआर झिल्ली 2 के भीतर अपने अंतिम टोपोलॉजी को प्राप्त कर रहे हैं। प्रोटीन के लिए उपयुक्त झिल्ली अभिविन्यास और टोपोलॉजी के अधिग्रहण के अपने सामान्य कार्य के लिए महत्वपूर्ण है। सही टोपोलॉजी उनके बाध्यकारी भागीदारों के साथ बातचीत करने के लिए झिल्ली प्रोटीन के प्रासंगिक डोमेन के लिए अनुमति देता है, यह महत्वपूर्ण बाद translational संशोधनों घटित करने की अनुमति देता है, और प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन के मामले में सेल के साथ बातचीत और टी प्रतिक्रिया करने की अनुमति देता हैअपने पर्यावरण ओ। पूरी तरह से एक झिल्ली प्रोटीन के समारोह की सराहना करने के लिए, यह है कि प्रोटीन यह रहता है जो भीतर की झिल्ली, यानी, अपनी झिल्ली टोपोलॉजी के लिए सम्मान के साथ उन्मुख है कैसे पता करने के लिए स्पष्ट रूप से आवश्यक है। झिल्ली प्रोटीन औषधीय लक्ष्य 3 के बहुमत शामिल के बाद से एक प्रोटीन की सतह के पहलुओं को अलग वातावरण के संपर्क में रहे एक झिल्ली प्रोटीन और जो टोपोलॉजी को समझने के बुनियादी वैज्ञानिक ज्ञान के अधिग्रहण के अलावा, नैदानिक ​​निहितार्थ के रूप में चिह्नित किया गया है। अभी हाल तक, समय और पैसे में काफी निवेश की आवश्यकता है या से आने के लिए मुश्किल हो जाता है कि अभिकर्मकों की आवश्यकता है झिल्ली प्रोटीन टोपोलॉजी का निर्धारण करने के लिए दृष्टिकोण।

दोनों प्रयोगात्मक और सिलिको में दृष्टिकोण प्लाज्मा झिल्ली के भीतर रहने वाले प्रोटीन की झिल्ली टोपोलॉजी निर्धारित करने के लिए नियोजित किया गया है। व्यक्तिगत का मूल्यांकन किया है hydrophobicity पर आधारित झिल्ली फैले डोमेन की पहली भविष्यवाणियों के बाददोहरी अमीनो एसिड 3, कई भविष्य कहनेवाला एल्गोरिदम अब इंटरनेट पर उपलब्ध हैं, और बस प्रोटीन अमीनो एसिड अनुक्रम के ज्ञान की आवश्यकता होती है। हालांकि, मान्यताओं अक्सर टोपोलॉजी 4,5 की गलत कार्य करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं कि इस तरह की मॉडलिंग कार्यक्रम, मान्यताओं के लिए केंद्रीय हैं। इन कंप्यूटर आधारित भविष्यवाणियों अंतरिम रूप से झिल्ली फैले क्षेत्रों प्रदान कर सकते हैं, जबकि इसके अलावा, वे हमेशा अमीनो या प्रोटीन की carboxy टर्मिनी organelle लुमेन या सेल बाहरी, कोशिका द्रव्य में हैं कि क्या यह निर्धारित नहीं है। कम्प्यूटेशनल शक्ति में वृद्धि हुई है, और यहां तक कि साथ मशीन सीखने एल्गोरिदम 6, इस तरह के डेटा का उपयोग अभी भी एक मॉडल है, और प्रयोगात्मक अधिग्रहीत डेटा का उपयोग कर मान्य किया जाना चाहिए। झिल्ली टोपोलॉजी के प्रत्यक्ष प्रयोगात्मक दृढ़ संकल्प उनके immunoreactivity के मूल्यांकन से पहले और सेल permeabilization के बाद किया गया है, जहां प्रोटीन, भर में वितरित जाना जाता epitopes साथ मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के पैनल का उपयोग किया गया है। यहदृष्टिकोण ब्याज की प्रोटीन के लिए उपलब्ध नहीं हो सकता जो एंटीबॉडी का एक सेट की आवश्यकता है।

एक वैकल्पिक रणनीति फिर से पहले और झिल्ली permeabilization के बाद immunoreactivity के निर्धारण के द्वारा पीछा प्रोटीन भर में विभिन्न स्थानों में MYC या hemagglutinin (हा) के रूप में इस तरह के मिलान टैग करने के लिए इंजीनियर है। Immunogenic टैग के अलावा, और इस तरह के सिस्टीन स्कैनिंग के रूप में रासायनिक संशोधनों (क्षारीय β -galactosidase फॉस्फेट, या β lactamase-सहित) एंजाइमी टैग सभी झिल्ली प्रोटीन टोपोलॉजी 7,8 निर्धारित करने के लिए नियोजित किया गया है। प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन के topological मानचित्रण के लिए कार्यरत एक अतिरिक्त विधि मिलान टैग करने के लिए एक अलग दृष्टिकोण पर निर्भर करता है। इस विधि में टैग अनुक्रम एन से जुड़े ग्लाइकोसिलेशन आम सहमति अनुक्रम NXS / टी है। इस तरह के दृश्य biosynthetic मार्ग, एक luminal बनाम में टैग की उपस्थिति के लुमेन में मौजूद है जब ग्लाइकोसिलेशन ही होता हैएक साइटोसोलिक डिब्बे आसानी से एसडीएस पृष्ठ जैल पर एक जन बदलाव के रूप में मनाया जाता है। इस तरह के एक दृष्टिकोण multispanning आयन चैनल CFTR 9 करने के लिए लागू किया गया है। इन सभी दृष्टिकोणों उपयोग किया गया है, वहीं यह है कि वे सभी पैदा करते हैं और कई गुना निर्माणों दृश्य के लिए आणविक जीव विज्ञान में काफी निवेश की आवश्यकता है कि स्पष्ट है।

Intracellular organelles के भीतर स्थित transmembrane प्रोटीन के बारे में topological जानकारी निर्धारित करने के लिए और अधिक चुनौतीपूर्ण साबित हो गया है। प्रतिदीप्ति आधारित प्रौद्योगिकियों के अनुप्रयोग हालांकि, झिल्ली टोपोलॉजी एक बहुत सरल का दृढ़ संकल्प किया है। bimolecular प्रतिदीप्ति complementation की तकनीक (BiFC) प्रोटीन है कि 10 के फ्लोरोसेंट गुणों को बहाल करने, एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन के दो गैर फ्लोरोसेंट टुकड़ों के बीच बातचीत पर निर्भर करता है। शुरू में विवो 10 में प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का निर्धारण करने के लिए वर्णित हालांकि, इस दृष्टिकोण भी उपयोग किया गया हैसंयंत्र कोशिकाओं 11 में झिल्ली प्रोटीन टोपोलॉजी निर्धारित करने के लिए। हालांकि इस दृष्टिकोण यह ब्याज की प्रोटीन, लेकिन यह भी साइटोसॉल या organelle लुमेन के लिए लक्षित संलयन प्रोटीन की एक किस्म के साथ संलयन प्रोटीन की न केवल पीढ़ी की आवश्यकता के रूप में गहन समय भी है, और ब्याज में रहता है के intracellular प्रोटीन झिल्ली जिनमें से ज्ञान की आवश्यकता है ।

झिल्ली प्रोटीन टोपोलॉजी का निर्धारण करने के लिए एक वैकल्पिक सरल दृष्टिकोण 12 में वर्णित किया गया है। परख, प्रतिदीप्ति Protease संरक्षण (FPP) GFP और ब्याज की जीन के बीच एक संलयन प्रोटीन की पीढ़ी की आवश्यकता है। दृष्टिकोण GFP के आधा भाग को गैर विशिष्ट प्रोटिएजों के रिश्तेदार पहुंच पर आधारित है; चाहे GFP के आधार पर intracellular organelles के लुमेन में रहने से प्रोटियोलिसिस से सुरक्षित है या cytosol में उपस्थित होने से प्रोटियोलिसिस से अवगत कराया है। ब्याज की प्रोटीन पर GFP के आधा भाग कोशिका द्रव्य के चेहरे इस प्रकार, यदि यह उजागर किया जाएगाप्रोटीज गतिविधि और प्रतिदीप्ति संकेत खो दिया है। ब्याज की प्रोटीन पर GFP के आधा भाग (जैसे गोल्गी लुमेन के रूप में) प्रोटीज से एक वातावरण 'संरक्षित' चेहरे विपरीत, यदि फिर प्रतिदीप्ति संकेत रहेंगे।

प्रोटिएजों सेल में प्रवेश करने की अनुमति है, लेकिन कोलेस्ट्रॉल बाध्यकारी दवा digitonin प्रयोग किया जाता है intracellular झिल्ली डिब्बों में प्रवेश नहीं करने के लिए। कोलेस्ट्रॉल रीढ़ में प्रमुख स्टेरोल है, और विशेष रूप से intracellular डिब्बों के सापेक्ष प्लाज्मा झिल्ली में समृद्ध है। ग्लाइकोसाइड विष, digitonin, संयंत्र डिजिटालिस Purpurea से निकाला जाता है। Digitonin यह 14,16 (चित्रा 1) permeabiliztion चयनात्मक झिल्ली की ओर जाता है, जहां कोलेस्ट्रॉल अमीर झिल्ली के लिए एक आकर्षण है। छोटे साइटोसोलिक घटकों के बाहर निकलने की इजाजत देने के अलावा, digitonin permeabilization के भी ऐसे proteinase कश्मीर या trypsin रूप बहिर्जात अणुओं का प्रवेश परमिट। FPP प्रोटोकॉल कारकों का लाभ लेता हैप्लाज्मा झिल्ली ऐसे ईआर के रूप में अन्य अंगों, जबकि, गोल्गी, endosomes, बहुत कम कोलेस्ट्रॉल सामग्री है जो माइटोकॉन्ड्रिया, 14 बरकरार रहेगा, सेलुलर कोलेस्ट्रॉल 17 से 80% तक होता है कि टी। प्लाज्मा झिल्ली में कोलेस्ट्रॉल के चुनिंदा समावेश एस जैसे विविध यूकेरियोटिक प्रजातियों में digitonin निर्भर प्लाज्मा झिल्ली permeabilization के उपयोग की अनुमति है, कई कोशिकाओं में देखा गया है मानव 14,18 को cerevisiae। FPP परख (क) एक प्रोटीन झिल्ली बाध्य / एसोसिएटेड या साइटोसॉल और एक झिल्ली प्रोटीन (ख) जो डोमेन में स्वतंत्र रूप से प्रसारण है कि क्या साइटोसॉल या organelle लुमेन के चेहरे का निर्धारण करने का एक सरल, तेजी से और काफी मजबूत साधन प्रदान करता है। एक झिल्ली प्रोटीन कई झुकाव होना चाहिए, संकेत प्रमुख रूप से पैदा होगा और छोटे रूपों पता नहीं होगा। ब्याज पर प्रोटीन के लिए एक GFP आधा भाग के अलावा अपने कार्य को प्रभावित कर सकता है कि कुछ चिंता का विषय हो सकता है और/ या subcellular स्थानीयकरण, इस वास्तविक तुलना में वास्तव में अधिक सैद्धांतिक है। वास्तव में कई अध्ययनों से स्पष्ट रूप से GFP टैग प्रोटीन 19,20 के गुणों को बदल नहीं है कि पता चला है।

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Protocol

फ्लोरोसेंट प्रोटीन काइमेरा 1. जनरेशन और विधिमान्यकरण

  1. मानक पुनः संयोजक डीएनए रणनीतियों 13 का उपयोग कर ब्याज की प्रोटीन के अमीनो या कार्बाक्सिल टर्मिनी को हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) जोड़ें।
    नोट: हम बड़े पैमाने पर GFP के लिए प्रयोग किया जाता है, इस तरह के सियान फ्लोरोसेंट प्रोटीन (सीएफपी), पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (YFP) के रूप में अन्य वेरिएंट, DsRed और mCherry नियोजित किया जा सकता है। फ्लोरोफोरे तह दक्षता, चमक और photostability में सुधार के लिए लगातार प्रयास किए जा रहे हैं, और जांचकर्ताओं नवीनतम पीढ़ी निर्माणों के लिए खुद को लाभ उठाना चाहिए।
    1. सही डीएनए अनुक्रम की पुष्टि करें और GFP आधा भाग हित के प्रोटीन के साथ फ्रेम में है कि सुनिश्चित करते हैं। मानक पुनः संयोजक डीएनए रणनीतियों 21 का उपयोग कर अनुक्रमण प्रदर्शन करते हैं।
      नोट: कई संस्थानों अन्वेषक अतिरिक्त जानकारी के लिए संपर्क करने के लिए प्रोत्साहित किया जाता है, जो मूल डीएनए की सुविधा है।
    2. एकल या डबल पास झिल्ली प्रोटीन के लिए, उत्पन्नसंलयन प्रोटीन 19 की amino- और carboxyl टर्मिनल दोनों संस्करणों।
    3. बहु फैले प्रोटीन के लिए ख्यात extramembrane छोरों के भीतर GFP के लिए, साथ ही टर्मिनी डालें। प्रोटीन ईआर translocon के माध्यम से पारित कर दिया गया है एक बार संकेत दृश्यों अक्सर प्रोटियोलिसिस से चिपके रहते हैं लक्ष्य के रूप में प्रोटीन के अमीनो टर्मिनस से जुड़ी फ्लोरोसेंट संलयन प्रोटीन के साथ ट्रांसमेम्ब्रेन काइमेरा उत्पन्न करते समय विशेष ध्यान रखना।
    4. एक अक्षुण्ण एमिनो टर्मिनल टैग फ्लोरोसेंट प्रोटीन युक्त एक परिपक्व प्रोटीन उत्पन्न करने के लिए इतनी के रूप में वर्तमान संकेत दृश्यों के मामले में दरार साइट के लिए फ्लोरोसेंट संलयन प्रोटीन डिस्टल डालें। काइमेरा 21 की पीढ़ी के लिए मानक पुनः संयोजक डीएनए रणनीतियों को काम।
  2. ब्याज की सेल लाइन में पर्याप्त उचित स्थानीयकृत फ्लोरोसेंट संकेत की उपस्थिति निर्धारित करते हैं।
    1. उपयुक्त तहत GFP के आंतरिक प्रतिदीप्ति का उपयोग कर epifluorescence माइक्रोस्कोपी के तहत कोशिकाओं का पालनफिल्टर निर्धारित शर्तों को खा लिया। 510-560 एनएम धरना कि GFP फिल्टर सेट के लिए, सही फिल्टर कार्यरत फ्लोरोफोरे के लिए उपयोग किया जाता है की पुष्टि करें।
      नोट: आंखों से आकलन संकेत रहता है जिसके भीतर सेलुलर संरचना आसानी से पृष्ठभूमि से ऊपर हल हो गई है कि एक मजबूत पर्याप्त संकेत प्रदान करता है जब एक पर्याप्त संकेत हासिल की है। इसके अलावा में GFP-प्रोटीन का धुंधला पैटर्न उपयुक्त organelle के लिए मार्कर के साथ संगत, और देशी untagged प्रोटीन की है कि अधिमानतः समान होना चाहिए।
  3. एक स्थिर या क्षणिक अभिकर्मक दृष्टिकोण प्रोटीन का मूल्यांकन किया जा रहा है पर आधारित का उपयोग किया जाएगा कि क्या निर्धारित करते हैं।
    नोट: स्थिर transfectants आम तौर पर क्षणिक प्रणालियों की तुलना में अभिव्यक्ति के निचले स्तर पर बनती हैं। क्षणिक अभिव्यक्ति (प्रोटीन पर निर्भर करता है ~ 5-24 घंटे बाद अभिकर्मक) प्रोटीन और वृद्धि के संकेत तीव्रता के उच्च स्तर अभिव्यक्ति पैदावार हालांकि, यह भी इस तरह के प्रोटीन aggr रूप overexpression कलाकृतियों के लिए नेतृत्व कर सकते हैंगलत subcellular स्थानीयकरण करने के लिए अग्रणी egation या प्रोटीन को लक्षित रास्ते में से संतृप्ति,।

कोशिकाओं और सेल संस्कृति की 2. अभिकर्मक

नोट: कोशिकाओं की एक किस्म HEK293, हेला, भंडार नियंत्रक-7 और चो कोशिकाओं 14 सहित FPP विश्लेषण करने के लिए उत्तरदायी हैं। निम्नलिखित विवरण HEK293 कोशिकाओं में झिल्ली प्रोटीन व्यक्त पर आधारित है।

  1. बढ़ो मानव भ्रूण गुर्दे की कोशिकाओं (HEK293) पक्षपाती monolayers के रूप में 6 37 डिग्री से कम 5% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 1% सोडियम पाइरूवेट, और 250 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक Dulbecco संशोधित ईगल्स मध्यम (DMEM) के मिलीलीटर 5% सीओ 2 के साथ सी। एक लामिना का प्रवाह टिशू कल्चर हुड में कोशिकाओं के साथ सभी काम करते हैं। T-75 फ्लास्क में 80% मिला हुआ ~ जब तक मध्यम संस्कृति में कोशिकाओं को विकसित।
  2. Transien उत्पन्न करने के लिए lipid-, viral- या electroporation आधारित प्रौद्योगिकियों सहित किसी भी मानक उच्च दक्षता, कम विषाक्तता अभिकर्मक विधि का उपयोग करते हुए transfect कोशिकाओंटी या स्थिर अभिव्यक्ति। आम तौर पर 1 x 10 6 कोशिकाओं प्रति प्लास्मिड डीएनए के दो माइक्रोग्राम प्रति अच्छा प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रोटीन अभिव्यक्ति देता है। सीओ 2 सक्षम टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर उपयुक्त टिशू कल्चर मीडिया में 5-48 घंटे के लिए कोशिकाओं को बनाए रखने।
  3. निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार उपयुक्त फिल्टर सेट का उपयोग कर, GFP के आंतरिक प्रतिदीप्ति संकेत का उपयोग, epifluorescence माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर GFP-संलयन प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए कोशिकाओं की निगरानी करें। प्रतिदीप्ति संकेत आम तौर पर अभिकर्मक निम्नलिखित 24-72 घंटा के भीतर एक अधिकतम तक पहुँचता है। प्रतिदीप्ति संकेत एक अधिकतम स्तर तक पहुँच जाता है जब कोशिकाओं का प्रयोग करें। ब्याज की प्रोटीन या GFP आधा भाग या तो के खिलाफ निर्देशित एंटीबॉडी का उपयोग immunoblot विश्लेषण द्वारा प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर की निगरानी।
  4. लेपित coverslips पर प्रयोगात्मक विश्लेषण थाली कोशिकाओं के लिए। एक जीवित सेल विन्यास या निम्न निर्धारण के तहत या तो देखिए और माइक्रोस्कोपी स्लाइड पर माउंट। प्लेट कोशिकाओं 24-48 घंटा के भीतर 60% -80% संगम को प्राप्त करने के लिए।
    1. पूरी सतह कवर किया जाता है तो यह है कि पाली lysine समाधान (0.1 मिलीग्राम / एमएल), के साथ कोट coverslips। 37 डिग्री सेल्सियस पर एक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में 60 मिनट के द्वारा पीछा कमरे के तापमान पर एक अल्ट्रा वायलेट प्रकाश के तहत 30 मिनट के लिए सेते हैं। अतिरिक्त पाली lysine निकालें और पीबीएस 3 बार में coverslips कुल्ला।
    2. वैकल्पिक रूप से, तेल-विसर्जन के उद्देश्यों के साथ प्रत्यक्ष इमेजिंग अनुमति देने के लिए एक ऑप्टिकल गिलास नीचे के साथ सेल संस्कृति प्लेटों से मिलकर संभाग कवर कांच पर कोशिकाओं थाली। वास्तविक माइक्रोस्कोपी सेटअप अन्वेषक के लिए उपलब्ध उपकरणों पर निर्भर करता है, लेकिन तेजी से समाधान परिवर्तन करने में सक्षम होना चाहिए। सेल के प्रकार और सेल के आकार पर निर्भर करता है, कोशिकाओं FPP परख के समय के आसपास 60-90% मिला हुआ होना चाहिए।

3. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी सेटअप

  1. इस तरह के एक 60X, 1.42 एनए तेल विसर्जन उद्देश्य के रूप में अधिक से अधिक संकेत संग्रह और स्थानिक संकल्प, के लिए एक उच्च संख्यात्मक एपर्चर (एनए) तेल-विसर्जन उद्देश्य का प्रयोग करें। इसका उपयोग करोई fluorophores को प्रोत्साहित करने के लिए लेज़रों निम्नलिखित हैं: आर्गन गैस 488 एनएम (GFP और YFP) और 561 डायोड (आरएफपी, mCherry)।
  2. प्रत्येक निर्माण के लिए छवियों का इष्टतम प्रदर्शन, लाभ और कब्जा दर निर्धारित करते हैं। (कदम 7.1.2 देखें) photobleaching को कम से कम करने के लिए लेजर तीव्रता और जोखिम समय समायोजित करें।
  3. (उदाहरण के लिए, एक झिल्ली प्रोटीन मार्कर के साथ संगीत कार्यक्रम में झिल्ली permeabilization के लिए एक घुलनशील मार्कर), उपयुक्त फिल्टर का चयन कई fluorophores का उपयोग अध्ययन के लिए सिग्नल पार बात कम से कम और संकेत करने वाली शोर अनुपात को अधिकतम करने के लिए सेट।

4. प्लाज्मा झिल्ली permeabilization के लिए इष्टतम स्थितियों की स्थापना

  1. (जैसे EGFP, DsRed) केवल घुलनशील फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त कोशिकाओं से सेल संस्कृति के माध्यम से निकालें। KHM बफर में कोशिकाओं को तीन बार (एक मिनट प्रत्येक) धोने (110 मिमी पोटेशियम एसीटेट, 3 मिमी 2 MgCl, 20 मिमी HEPES-NaOH के, पीएच 7.2)। कमरे के तापमान पर कोशिकाओं के साथ प्रयोगों और सभी अभिकर्मकों प्रदर्शन करते हैं।
  2. प्लेस कोशिकाओं ओएन coverslips के एक प्रतिदीप्ति खुर्दबीन मंच पर KHM बफर में (2.4 कदम देखें) और नियंत्रण 'गैर-permeabilized' चरण का प्रतिनिधित्व करता है जो पहली छवि, इकट्ठा।
  3. चुनिंदा प्लाज्मा झिल्ली permeabilize करने के लिए, कोशिकाओं को KHM बफर में digitonin (30 माइक्रोन) जोड़ें। 10-60 सेकंड के लिए 5 मिलीलीटर की दर / मिनट में बफर (बफर + digitonin) के साथ कोशिकाओं छिड़कना।
  4. धीरे-धीरे digitonin की एकाग्रता में वृद्धि से इष्टतम digitonin एकाग्रता का निर्धारण। digitonin आवेदन का 10-60 सेकंड के भीतर घुलनशील EGFP से प्रतिदीप्ति संकेत का पूरा नुकसान है जब वहाँ इष्टतम digitonin एकाग्रता हासिल की है। कई कोशिकाओं के लिए 10-50 माइक्रोन digitonin के आवेदन कोशिका झिल्ली permeabilize के लिए पर्याप्त है।
    1. के लिए सभी आवेदनों digitonin की सबसे कम संभव एकाग्रता का उपयोग करें। Permeabilized पृष्ठभूमि संकेत के लिए permeabilization के digitonin के बाद छवियों को ले लीजिए।
  5. ब्याज की GFP-प्रोटीन कल्पना झिल्ली में है की पुष्टिप्लाज्मा झिल्ली 16 की digitonin permeabilization के निम्नलिखित प्रतिदीप्ति संकेत के सेलुलर प्रतिधारण की पुष्टि द्वारा tegrated।
    1. एक organelle विशिष्ट फ्लोरोसेंट प्रोटीन 23 एक्सप्रेस। Mitochondrial प्रोटीन जैसे इस संबंध में 16, pDsRed2-Mito वेक्टर में अच्छी तरह से काम करते हैं। कदम 2.1 में वर्णित के रूप में इष्टतम अभिव्यक्ति शर्तों का निर्धारण करते हैं।
    2. Intracellular organelles के आकृति विज्ञान digitonin के लिए लंबे समय (60 मिनट) जोखिम पर लगातार बना रहता है कि digitonin एकाग्रता सुनिश्चित करने के द्वारा नियोजित सेल प्रकार के लिए उपयुक्त है कि पुष्टि करें।
      नोट: इस तरह के लाइसोसोम के रूप में विभिन्न सेलुलर डिब्बों के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग उपयोग मानक immunofluorescence माइक्रोस्कोपी प्रोटोकॉल, (उदाहरण के लिए, LAMP1), गोल्गी (जैसे, TGN38), endoplasmic जालिका (जैसे, calnexin), endosomes (जैसे, Rab5), माइटोकांड्रिया (जैसे, साइटोक्रोम सी)। Intracellular organelle आकृति विज्ञान / अखंडता परिवर्तन नाटकीय रूप से ove हैंआर 60 मिनट, यह digitonin एकाग्रता बहुत अधिक थी कि संभावना है, और digitonin एकाग्रता और / या जोखिम समय में कमी की आवश्यकता है।
      नोट: Digitonin साँस लेना और त्वचा के संपर्क से विषैला होता है। उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) पहनें।

फ्लोरोसेंट प्रोटीन की 5. Protease उपचार

  1. प्रोटीज जोड़ने तो (proteinase कश्मीर, KHM बफर में 50 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल) KHM बफर में कोशिकाओं को धो लें और सीधे कोशिकाओं पर। 5 मिलीलीटर करने के लिए लगातार तैयारी स्नान एक गुरुत्वाकर्षण तंग आ छिड़काव प्रणाली का उपयोग / मिनट की एक प्रवाह दर पर कोशिकाओं छिड़कना।
    1. 50 मिलीलीटर सीरिंज में स्टोर समाधान और पॉलीथीन ट्यूबिंग स्नान (5 मिलीग्राम / मिनट प्रवाह की दर) में एक भी दुकान के साथ एक कई गुना करने के लिए स्वतंत्र जलाशयों जुड़ा हुआ है। एक निरंतर (0.5 मिलीलीटर) स्नान मात्रा को बनाए रखने और मैन्युअल रूप से छिड़काव जलाशयों के बीच स्विच द्वारा समाधान विनिमय प्राप्त करने के लिए एक चूषण पिपेट स्थिति।
  2. स्त्राव निर्धारित करने के लिए छवियों को इकट्ठाescent संकेत बनी रहती है या degrades है। 30-60 सेकंड से अधिक प्रारंभिक संकेत तीव्रता के> 90% का नुकसान GFP-प्रोटीन कल्पना के proteolytic गिरावट के साथ संगत है (प्रतिनिधि परिणाम देखें)।
  3. कोई संकेत गिरावट proteinase कश्मीर के साथ मनाया जाता है, इस तरह के नुकसान अनुमान है, जब KHM बफर में ट्रिप्सिन (4-8 मिमी) के साथ proteinase कश्मीर के समाधान की जगह। यदि आवश्यक हो, proteinase कश्मीर और trypsin का एक मिश्रण का उपयोग। प्रोटीज गतिविधि बुझाने के लिए कोई जरूरत नहीं है।

बाह्य डोमेन के साथ प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन के लिए 6. वैकल्पिक दृष्टिकोण

  1. प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन के लिए, permeabilization के digitonin करने से पहले बाहरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन काइमेरा के लिए परख करते हैं। KHM बफर में coverslips पर कोशिकाओं (5 मिलीग्राम / मिनट एक्स 3 मिनट) धो लें, और पूर्व प्रोटीज के इलाज के लिए एक छवि ले और चरण 7 में के रूप में पूर्व प्रोटीज प्रतिदीप्ति संकेत यों।
  2. प्रोटीज को कोशिकाओं को बेनकाब (proteinase कश्मीर, 50 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / या मिमी KHM बफर में 4-8 trypsin) टी मेंKHM मीडिया वाले प्रोटीज (प्रवाह की दर 5 मिलीग्राम / मिनट) के साथ कोशिकाओं perfusing द्वारा digitonin का वह अभाव। संकेत गायब हो जाता है या कितनी देर तक संकेत बनी रहती है कि कैसे जल्दी से निर्धारित करने के लिए, फ्लोरोसेंट प्रोटीन की छवियों को ले लीजिए।
  3. Digitonin permeabilization के पहले, 10% सीरम (FBS) युक्त सेल संस्कृति मीडिया में कोशिकाओं को तीन बार (एक मिनट प्रत्येक) धोने से, सभी प्रोटीज गतिविधि बुझा लेते हैं।
  4. 2 मिनट के लिए KHM बफर (5 मिलीग्राम / मिनट के प्रवाह की दर) के साथ perfusing द्वारा कोशिकाओं को धो लें। एक पूर्व permeabilization छवि मोल। चरण 4 में वर्णित के रूप में कोशिका झिल्ली permeabilize।
  5. चरण 5 में वर्णित के रूप में प्रोटीज अलावा निम्नलिखित छवियों लीजिए।

7. छवि विश्लेषण

  1. प्रतिदीप्ति संकेत के नुकसान के वास्तविक समय में निगरानी रखी जा सकती है, जिसमें "लाइव सेल" रिकॉर्डिंग में सक्षम एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। सतत निगरानी के लिए, समान मानकों (जोखिम समय, लाभ, लेजर तीव्रता, आदि) को रोजगार।
    1. अनुभव का निर्धारण करते हैंनियंत्रण शर्तों (यानी, KBH अकेले बफर) के तहत ब्याज की GFP के प्रोटीन से प्रतिदीप्ति संकेत देख द्वारा imental मापदंडों। एक 10-20 मिनट की अवधि में संकेत तीव्रता का कोई प्रशंसनीय नुकसान होता है कि यह सुनिश्चित करने के लिए कंप्यूटर संचालित माइक्रोस्कोप पर लाभ, लेजर तीव्रता और जोखिम समय सेटिंग्स समायोजित करें।
      नोट: संकेत तीव्रता एक निरपेक्ष मूल्य नहीं है, लेकिन हर गड़बड़ी के लिए उपलब्ध माइक्रोस्कोप प्रणाली और सेटिंग्स पर आधारित है। रिश्तेदार प्रतिदीप्ति तीव्रता में परिवर्तन की निगरानी।
  2. वैकल्पिक रूप से, प्रोटीज द्वारा पीछा digitonin में निर्धारित समय-बिंदुओं पर कोशिकाओं का इलाज है, और पूर्व इमेजिंग के लिए coverslips पर बढ़ते कोशिकाओं को ठीक। समय अंक अनुभवतः चरणों में 4 और प्रारंभिक जांच के लिए 5 में प्रक्रियाओं का पालन का निर्धारण करते हैं, digitonin या प्रोटीज के 0, 30, 60, 120 और 300 सेकंड पोस्ट अलावा में शुरू करो।
    1. कोशिकाओं (कमरे के तापमान पर 20 मिनट) पूरी तरह वें डूब लगानेवाला की पर्याप्त मात्रा (पीबीएस में 3.7% paraformaldehyde) का उपयोग फिक्सई कोशिकाओं।
    2. पीबीएस 20 मिमी ग्लाइसिन (3 एक्स 5 मिनट) को रोकने के साथ कोशिकाओं rinsing द्वारा अवशिष्ट paraformaldehyde के बुझाना।
    3. Coverslip से अतिरिक्त तरल को हटाने और एक गिलास खुर्दबीन पर 50 μl बढ़ते मीडिया पर coverslip inverting द्वारा माउंट coverslips के इमेजिंग के लिए स्लाइड। स्लाइड इमेजिंग से पहले रात भर सूखे की अनुमति दें।
  3. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी छवियों को इकट्ठा एक कंप्यूटर नियंत्रित प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी पर वीडियो छवि पर कब्जा समारोह का उपयोग करके (उपयुक्त फिल्टर के तहत फ्लोरोफोरे इस्तेमाल किया जा रहा है के साथ संगत सेट)।
  4. ऊष्मायन हालत के एक समारोह के रूप में फ्लोरोसेंट संकेत तीव्रता यों। एक व्यक्ति के सेल encloses कि ब्याज (आरओआई) के एक क्षेत्र के भीतर मतलब पिक्सेल तीव्रता प्राप्त करते हैं।

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Representative Results

प्लाज्मा झिल्ली Permeabilization

कुशल प्लाज्मा झिल्ली permeabilization के घुलनशील फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जैसे, GFP, DsRed) (4.) के उपयोग के द्वारा निर्धारित किया जाता है। ये प्रोटीन, कोशिकाओं में व्यक्त करते हैं, cytosol में फैलाना करने के लिए स्वतंत्र हैं, और प्लाज्मा झिल्ली (चित्रा 2) digitonin का उपयोग कर permeabilized है जब खो रहे हैं। फ्लोरोसेंट संकेत के एक पूरी गायब digitonin आवेदन का 10-60 सेकंड के भीतर हो जाना चाहिए। ब्याज की प्रोटीन के intracellular organelles के साथ जुड़ा हुआ है कि पुष्टि digitonin permeabilization के निम्नलिखित फ्लोरोसेंट संकेत की अवधारण टिप्पण द्वारा हासिल की है।

प्रोटीज उपचार

कोशिकाओं में फ्लोरोसेंट प्रोटीन के हित के प्रोटीन और फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP, YFP, आदि) (चरण 1) और अभिव्यक्ति के बीच फ्लोरोसेंट काइमेरा के सफल पीढ़ी के बाद (चरण 2), उपचार प्रोटीज के साथ की permeabilized कोशिकाओं फ्लोरोफोरे (और इसके सटे प्रोटीन डोमेन) cytosol में हैं और पाचन प्रोटीज के लिए सुलभ है, या एक organelle लुमेन के भीतर स्थित है और इस तरह प्रोटीज पाचन (4.) से रक्षा कर रहे हैं कि क्या के बारे में जानकारी प्रदान करेगा। LMTK2 एक झिल्ली लंगर काइनेज 15 है, और प्रतिदीप्ति प्रोटीज संरक्षण assays के अपने झिल्ली टोपोलॉजी 16 निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। LMTK2 की कार्बाक्सिल पूंछ GFP के लिए जुड़े हुए हैं और क्षणिक व्यक्त की गई थी। फ्लोरोसेंट LMTK2-GFP संकेत LMTK2 साइटोसॉल (चित्रा 3) के भीतर स्थित होने के कार्बोक्सिल टर्मिनस के स्थान का संकेत, proteinase कश्मीर के अलावा के बाद तेजी से खो गया था। Caveolin-GFP (Cav1 GFP) 17 साइटोसोलिक डोमेन से जुड़ी एक GFP-आधा भाग के साथ एक प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन होता है। (चित्रा 3) LMTK2 साथ के रूप में, caveolin-YFP से संकेत असंवेदनशील digitonin है, लेकिन प्रोटीज के बाद इसके लिए संवेदनशील।

टी "> Luminal घुलनशील प्रोटीन भी FPP प्रोटोकॉल का उपयोग पहचाना जा सकता है। इस उदाहरण में, ईआर प्रतिधारण संकेत KDEL DsRed जोड़े जाते है। LMTK2 और caveolin से संकेतों के विपरीत, KDEL-DsRed से संकेत दोनों के प्रति असंवेदनशील है digitonin ईआर झिल्ली permeabilize करने में असमर्थ है और के रूप में digitonin और प्रोटीज, फ्लोरोसेंट संकेत प्रोटीज गिरावट से सुरक्षित है। माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन द्वारा दिया जाता है एक organelle के लुमेन के भीतर स्थित एक झिल्ली डोमेन का एक उदाहरण मानव साइटोक्रोम ग oxidase की सबयूनिट आठवीं है 18,19। pDsRed एमआईटी, Discosoma सपा से लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन। साइटोक्रोम ग ओक्सीडेस से अनुक्रम को लक्षित माइटोकॉन्ड्रियल के लिए जुड़े हुए encodes। pDsRed-Mito व्यक्त कोशिकाओं में, फ्लोरोसेंट संकेत सेल में देखा जाता है। digitonin permeabilization के बाद, फ्लोरोसेंट संकेत pDSRed-Mito के साथ जुड़े स्थिर बनी हुई है। इसके अलावा, proteinase कश्मीर, pDsRed-Mito बनी रहती है साथ जुड़े प्रतिदीप्ति, चुनाव के अलावा निम्नलिखितमाइटोकॉन्ड्रिया में फ्लोरोफोरे साथ sistent और (चित्रा 3) साइटोसॉल के संपर्क में है और इस तरह प्रोटीज गतिविधि से सुरक्षित नहीं है।

कोशिकी डोमेन

गैर permeabilized कोशिकाओं के प्रोटीज उपचार तेजी से एक झिल्ली प्रोटीन से जुड़ी फ्लोरोसेंट आधा भाग सेल बाहरी का सामना करना पड़ रहा है जब प्रतिदीप्ति संकेत बुझाना चाहिए। glycosylphosphatidylinositol (जीपीआई) लंगर प्रोटीन पीआरपी 20 एक उत्कृष्ट उदाहरण के रूप में कार्य करता है। पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन युक्त एक निर्माण (YFP) जेरूसलम के हिब्रू विश्वविद्यालय से, पीआरपी (YFP-पीआरपी) 21,22, डॉ एहुद कोहेन से एक उदार उपहार के अमीनो टर्मिनस से जुड़ी। उपचार प्रोटीज करने से पहले, कोशिकी YFP से फ्लोरोसेंट संकेत (चित्रा 4) उज्ज्वल था। प्रोटीज उपचार के बाद, बाह्य प्रतिदीप्ति संकेत तेजी से गायब हो गया।

टाइम बातें

चित्र 1
चित्रा 1: प्लाज्मा झिल्ली के चुनिंदा permeabilization के प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल के माध्यम से जा रहा एक एकल कोशिका दिखा FPP परख (क) कार्टून मॉडल।। लाल प्रतीक cytosol में लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (आरएफपी) का प्रतिनिधित्व करता है, हरे और नीले रंग के प्रतीकों organelle लुमेन (नीला) या साइटोसॉल (हरा) का सामना करना पड़ या तो फ्लोरोसेंट टैग के साथ ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीनों का प्रतिनिधित्व करते हैं। (ख) digitonin permeabilization के बाद मुक्त साइटोसोलिकप्रोटीन आरएफपी संकेत को कम करने, दूर फैलाना। नीले रंग के संकेत organelle लुमेन में अपनी उपस्थिति से गिरावट से सुरक्षित है, जबकि proteinase कश्मीर के आवेदन के बाद (ग), साइटोसोलिक हरी झंडी, अपमानित कर रहा है।

चित्र 2
चित्रा 2: Digitonin उपचार प्लाज्मा झिल्ली और विज्ञप्ति साइटोसोलिक GFP के permeabilizes एक एकल कोशिका (क) कार्टून से पहले और digitonin उपचार के बाद, घुलनशील GFP व्यक्त।। (ख) Digitonin उपचार प्लाज्मा झिल्ली और विज्ञप्ति साइटोसोलिक GFP के permeabilizes। ब्याज (आरओआई) के एक क्षेत्र में घुलनशील GFP व्यक्त चो कोशिकाओं के चारों ओर खींचा है। Digitonin (50 माइक्रोन) के साथ उपचार के बाद, छवियों से पहले और digitonin के अलावा के बाद, और संकेत समय बिंदुओं पर ले जाया गया। स्केल बार, 10 माइक्रोन। (ग) fluore की मात्रा का ठहरावपूर्ण समय श्रृंखला (वायुसेना) के scence तीव्रता दिखाया गया है।

चित्र तीन
चित्रा 3: FPP endosomal प्रोटीन LMTK2 के टोपोलॉजी का पता चलता है (एक) LMTK2-GFP (हरे रंग की गेंदों) के DsRed की हानि (लाल गेंदों), लेकिन प्रतिधारण दिखा FPP के कार्टून proteinase कश्मीर के आवेदन पर संकेत हानि के द्वारा पीछा किया, digitonin permeabilization के बाद। । (ख) DsRed और LMTK2-GFP व्यक्त चो प्रकोष्ठों के FPP परख। छवियों से पहले और संकेत के रूप में, उपचार digitonin, और proteinase कश्मीर पालन करने के बाद ले जाया गया। स्केल बार: 10 माइक्रोन।

चित्रा 4
चित्रा 4: (क) पहले और proteinase कश्मीर उपचार के बाद YFP-पीआरपी (हरा) के टोपोलॉजी और स्थान दिखा कार्टून मॉडल। व्यक्त चो कोशिकाओंYFP-पीआरपी 100 सेकंड के लिए कश्मीर Proteinase के अधीन थे। (ख) छवियों से पहले ले लिया है और प्रोटीज उपचार के बाद संकेत समय पर दिखाए जाते हैं। YFP-पीआरपी संकेत पूरी तरह से digitonin के अभाव में प्रोटीज निम्नलिखित खो गया था। (ग) में दिखाया गया है quantitation के लिए प्रयोग किया जाता है ब्याज (आरओआई) का पीला शो क्षेत्र।

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Discussion

झिल्ली प्रोटीन की सही ओरिएंटेशन और टोपोलॉजी उनकी समुचित कार्य के लिए आवश्यक है। झिल्ली प्रोटीन टोपोलॉजी समझने के महत्व के बावजूद, इस तरह के डेटा को पूरी तरह से कमी है, जिसके लिए कई प्रोटीन होते हैं। FPP एक आसान और कुशल झिल्ली प्रोटीन टोपोलॉजी का निर्धारण करने का तरीका है, और सबसे प्रयोगशालाओं द्वारा प्रदर्शन किया जा सकता है कि एक प्रदान करता है। FPP दृष्टिकोण प्रोटीन टोपोलॉजी का निर्धारण करने के लिए पिछले विधियों से अधिक महत्वपूर्ण लाभ देता है। उदाहरण के लिए, ब्याज 31 की प्रोटीन की फिर से विभिन्न डोमेन निर्देशित कई एंटीबॉडी के एक पैनल है की कोई जरूरत नहीं है। कई मामलों में एंटीबॉडी के इस तरह के एक पैनल उपलब्ध नहीं है; इस नव क्लोन प्रोटीन के लिए विशेष रूप से सच है। परख एक एकल कोशिका के स्तर पर प्रदर्शन किया जा सकता है, प्रोटीन की बड़ी जैव रासायनिक मात्रा बहाव के जैव रासायनिक के लिए आवश्यक नहीं कर रहे हैं इस तरह के प्रोटियोलिसिस या एसडीएस पृष्ठ के रूप में विश्लेषण करती है। दरअसल, अपेक्षाकृत कुछ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं असंदिग्ध रूप से आवंटित करने के लिए आवश्यक हैंब्याज की प्रोटीन के लिए एक टोपोलॉजी। अन्वेषक ऐसे उपकला कोशिकाओं या न्यूरॉन्स के रूप में transfect करने के लिए कड़ी मेहनत की कोशिकाओं में टोपोलॉजी मूल्यांकन कर रहा है, तो यह महत्वपूर्ण है। प्रोटीन की कार्बाक्सिल या अमीनो टर्मिनस के लिए या तो एक GFP आधा भाग का सरल इसके अलावा आसानी से प्लास्मिड युक्त कई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध GFP का प्रयोग कर प्राप्त किया जा सकता है, और ज्यादातर मामलों में, GFP के आधा भाग के अलावा उचित प्रोटीन तह या subcellular स्थानीयकरण बाधा नहीं है। ब्याज 23,24 के प्रोटीन को प्रभावित करने के लिए GFP के लिए क्षमता है के रूप में हालांकि, अन्वेषक, यह उनके प्रोटीन के लिए सच है कि पुष्टि करनी होगी। कई प्रोटीन इस प्रकार के topological पढ़ाई आरंभ करने के लिए कम से कम अतिरिक्त प्रयास की आवश्यकता होती है, जो पहले से ही GFP संलयन प्रोटीन के रूप में उपलब्ध हैं। प्रतिदीप्ति की सतत निगरानी लाइव सेल इमेजिंग उपकरण पहुँच नहीं है जो जांचकर्ताओं के लिए, प्रोटीन टोपोलॉजी का निर्धारण करने के लिए एक त्वरित और कारगर साधन प्रदान करता है, परख आसानी से एक formaldehyde के निर्धारण app करने के लिए अनुकूलित हैरोच confocal माइक्रोस्कोपी के मानक epifluorescence के प्रयोग से।

FPP परख की प्रयोज्यता में कुछ सीमाएं लेकिन वहाँ हैं। प्रसंस्करण proteolytic, या अन्य बाद translational संशोधनों के हित के प्रोटीन के लिए थोड़ा अलग झिल्ली टोपोलॉजी में परिणाम चाहिए, FPP परख केवल प्रमुख प्रोटीन फार्म का आकलन करेंगे। इसके अलावा, कुछ प्रोटीन के Termini के लिए एक GFP आधा भाग जोड़कर कार्बाक्सिल टर्मिनल PDZ डोमेन के साथ दखल दे उदाहरण के लिए, उनके कार्य को प्रभावित कर सकते हैं। फिर भी, FPP परख कई झिल्ली प्रोटीन के अभिविन्यास और टोपोलॉजी की स्थापना के लिए एक सरल तरीका देता है।

यह प्रारंभिक प्रयोगों इंट्रासेल्युलर घुलनशील GFP के जारी करने के लिए digitonin का सही एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए प्रदर्शन किया जाना है कि महत्वपूर्ण है। GFP के digitonin एप्लिकेशन के पास निम्न सेल से बाहर फैलाना नहीं करता है, digitonin की एकाग्रता कम से कम एकाग्रता फिर से निर्धारित करने के लिए, धीरे-धीरे वृद्धि की जानी चाहिएरिलीज की सुविधा के लिए करनी। हालांकि, बहुत ज्यादा digitonin जिसका अखंडता digitonin एप्लिकेशन के पास निम्न पुष्टि की जानी चाहिए इंट्रासेल्युलर पुटिकाओं, की आकृति विज्ञान को प्रभावित करेगा। कुछ कोशिकाओं में organelles बहुत संवेदनशील होते हैं और एक अधिक स्थिर बफर रचना 25 आवश्यकता हो सकती है। मूल्यांकन किया जा रहा कल्पना से प्रतिदीप्ति संकेत कम है, तो एक उच्च अभिव्यक्ति के स्तर के साथ एक एकल क्लोन का चयन करें, या एक क्षणिक अभिव्यक्ति प्रदर्शन, अक्सर एक स्वीकार्य स्तर तक सिग्नल की शक्ति में वृद्धि होगी। नए बाहर की मांग, उज्जवल प्लास्मिड भी कम संकेत तीव्रता के साथ विचार किया जाना चाहिए। अंत में, देखभाल देखा संकेत के नुकसान प्रोटीज गिरावट की वजह से नहीं है और fluorophores के photobleaching करने के लिए है कि यह सुनिश्चित करने के लिए लिया जाना चाहिए। प्रकाश की तीव्रता और / या अधिग्रहण की दर को कम करना photobleaching को कम करने में मदद करेगा।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Digitonin Calbiochem 300410
Proteinase K Sigma P2308
Trypsin Sigma T3924
Cav1-GFP Addgene 44433
pAcGFP-1 Golgi Clontech 632464
Polylysine Sigma P4707
Mounting Media Dako cS704

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References

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सेलुलर जीवविज्ञान अंक 98 झिल्ली प्रोटीन टोपोलॉजी GFP प्रतिदीप्ति परख प्रोटीज प्रोटियोलिसिस Digitonin
प्रतिदीप्ति Protease सुरक्षा का उपयोग झिल्ली प्रोटीन टोपोलॉजी निर्धारण (FPP)
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White, C., Nixon, A., Bradbury, N.… More

White, C., Nixon, A., Bradbury, N. A. Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection (FPP). J. Vis. Exp. (98), e52509, doi:10.3791/52509 (2015).

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