Biology

イメージングローカルCA Published: March 3, 2015 doi: 10.3791/52516

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Jeffrey T. Lock¹, Kyle L. Ellefsen¹, Bret Settle¹, Ian Parker^1,2, Ian F. Smith¹

¹Neurobiology and Behavior, University of California, Irvine, ²Physiology and Biophysics, University of California, Irvine

Abstract

細胞質ゾルのCa ²⁺イオンは、広範囲の遺伝子転写、電気的興奮性細胞増殖のようなプロセスを制御する、ほぼすべての細胞型における細胞活性の多くの側面を調節する。のCa ²⁺シグナル伝達の多様性と特異性は、地元の過渡のCa ²⁺マイクロドメイン分の期間にわたって発生する細胞全体の振動と波に至るまでのCa ²⁺シグナルは、異なる時間と空間スケールの上に行動するために生成されるメカニズムから派生（Ca ²⁺のパフ）持続的なミリ秒。電子の最近の進歩は、CCD（EMCCD）カメラは今> 500フレーム秒^-1（FPS）のレートで128×128ピクセル空間分解能で地元のCa ²⁺シグナルの画像化を可能に掛けた。このアプローチは、高度に並列であり、単一の実験でチャンネルやパフサイトの何百もの同時モニタリングを可能にします。しかし、膨大な量のデータが生成された（約 1 GBのPER分）実行不可能なローカルのCa ²⁺のイベントの視覚的な識別と分析をレンダリングします。ここでは説明し、取得、検出のための方法が示され、かつ広視野落射蛍光（WF）と全反射の両方を使用したCa ²⁺指標を搭載し、無傷の哺乳動物細胞内でのCa ²⁺シグナルを媒介₃ローカルIPの分析蛍光（TIRF）顕微鏡。さらに、我々は、これらのローカルのCa ²⁺シグナルの同定および分析を自動化するオープンソースのソフトウェア環境のPythonの中で開発したアルゴリズムを記述します。アルゴリズムは、サブピクセル解像度でのCa ²⁺放出の部位を局在化する。データのユーザーレビューを可能にする。エクセル互換テーブルの振幅および動力学的データと共に蛍光比信号の時間系列を出力する。

Introduction

カルシウムイオン（Ca ^2+が）普遍的に遺伝子発現、分泌およびシナプス可塑性¹における長期的な変化を含む、生物学的プロセスの多様な範囲を調節。 Ca ²⁺の^ような多様な方法で行動できるような一つの方法は、Ca ²⁺の異なる空間的·時間的パターンを介して行われ、細胞が生成することができます通知します。細胞質ゾルの例グローバル標高平滑筋組織²のに対し、小さい内の[Ca ^2+]トリガー収縮、ローカライズされた一過性の上昇（ローカルのCa ²⁺のミクロドメイン）の場合は学習と記憶³に不可欠な遺伝子発現を刺激する。

無料のサイトゾルは、の[Ca ^2+]静止時〜100 nmで維持されるが、急速に細胞膜内とすることにより位置のCa ²⁺透過性イオンチャネルを通じて細胞質ゾルへのCa ²⁺の流入、以下のいくつかのマイクロモル濃度に上昇することができます細胞内sからのCa ²⁺の遊離tores。私たちの研究室では、小胞体（ER）膜に存在するのCa ²⁺放出チャネルを形成する、イノシトール1,4,5-三リン酸受容体（IP ₃ R）に焦点を当てています。受容体のサイトを活性化、細胞質ゾルに両方のIP ₃およびCa ²⁺が結合すると、IP ₃ Rチャンネルは、Ca ^2+が ER内腔内に隔離遊離するために開きます。 Ca ²⁺の放出が空間的に（Ca ²⁺のパフ^4）のCa ²⁺のローカルサイトゾルのミクロドメインを生成するために、IP ₃ Rの小さなクラスタに制限されたままであってもよいか、IP ₃ Rの隣のクラスタの近接度に応じて、かもしれないのCa ²⁺誘導性のCa ²⁺ -放出^{（CICR）5,6}のプロセスを介して複数のパフサイトを補充することによって、細胞全体に伝播。

高度な顕微鏡imagiと相まってツィン⁷ロジャーによって開発された蛍光小分子のCa ²⁺指示色素の導入、技術ngを、大幅のCa ²⁺シグナル伝達の我々の理解を促進してきた。顕微鏡検査のために使用されるカメラの最近の進歩は今そのような前例のない空間および時間分解能でパフなどの一時ローカルのCa ²⁺イベントを撮像することができます。現在利用可能なEMCCDカメラは、> 500フレーム秒^-1数（fps）と相補型金属酸化物半導体の新世代で128×128画素の画像化を可能にする（CMOS）カメラは、わずかに高い犠牲にしてより高い画素解像度、さらに速い速度を提供ノイズレベル。全反射（TIRF）顕微鏡法と併せて、画像を参照する単一のCa ²⁺チャネルイベント^8,9可能である。実行不可能な手動処理、視覚的識別および分析をレンダリングし、自動化されたアルゴリズムの開発に責任を置く大規模なデータセット（毎分約 1Gビット）を発生しながら、このアプローチは、同時にチャネル/イベント数百の画像化を可能にする。

2+指標を用いて、無傷の哺乳動物細胞でのローカルのCa ²⁺シグナルを画像化するための手順およびプロトコルを提示する。今後は、TIRF、従来の広視野落射蛍光（WF）顕微鏡の両方によって画像化ローカルのCa ²⁺イベントの識別と分析を自動化し、オープンソース環境Pythonで開発したアルゴリズムを実証する。我々はIPのCa ²⁺シグナルをと生成さ₃のコンテキストでこれらのアプローチを説明したが、彼らはの[Ca ^2+]のCa様々ないずれかの表面に位置²⁺透過性イオンチャネルを発散する細胞質ゾルの局所的な変化を研究するために容易に適している膜または細胞内小器官^8-10。

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Protocol

私たちは、ヒト神経芽細胞腫SH-SY5Y細胞におけるローカルのCa ²⁺イベントを画像化するための詳細な手順を提示する。これらの手順は、多くの細胞型^8-10画像内Ca ²⁺シグナルに適合させることができる。

細胞の調製

培養細胞は、その供給者のウェブサイトに掲載されている指示に従って撮像される。
画像化の前の数日間は、収穫細胞を1mlの0.25％トリプシン/ EDTA（2-3分）を用いて組織培養フラスコ中で増殖させた。剥離後、トリプシンを不活性化するために培養培地の等量を加える。
皿あたり3-7×10 ⁴細胞の密度でガラスボトムイメージング皿に血球計および種子細胞を用いて細胞カウントを行う。彼らは60％コンフルエンス（2-3日）に達するときイメージング実験のためのセルを選択します。

ソリューションおよび試薬の調製

バッファリングされたCa ²⁺含有HEPESを準備（ミリモル）からなる塩溶液（Ca ²⁺の-HBSS）：135のNaCl、5.4のKCl、2のCaCl _2、1のMgCl _2、10 HEPES、および10グルコース。でpH = 7.4 NaOHで室温（RT）にて。 4℃でのグルコースや店舗の添加なしのCa ²⁺ -HBSSを準備します。使用直前に液にグルコースを追加します。
蛍光のCa ²⁺指示薬カル-520（1 mm）で膜透過性のフォームを可溶化、CI-IP _{3（200μM）、}およびEGTA 20％のプルロニックF-127を含むジメチルスルホキシド（100 mM）を（DMSO）。 -20℃で、湿気や遮光エッペンドルフチューブとストアにこれらの試薬を分注し。

3.読み込んで細胞膜透過性、カル- 520 CI-IP ₃およびEGTA

のCa ²⁺ -HBSSに、それぞれ、5および1μMの最終濃度になるように膜透過性カル-520及びCI-IP ₃のストック溶液を希釈することにより、「ローディングバッファー」を準備します。
吸引したCultureメディアとは、Ca ²⁺ -HBSS 3回メディアを交換することによって、細胞をリンス。
のCa ²⁺ -HBSSを取り外して、暗闇の中で、室温で60分間ローディングバッファーで細胞を培養する。
ローディングバッファーを除去し、Ca ²⁺の-HBSS 3回メディアを交換することによって、細胞をリンス。
1. 必要であれば、この段階で、その後負荷のCa ²⁺ -HBSSで5μMの最終濃度に原液を希釈することによってEGTA / AMを持つ細胞とは、暗闇の中で、室温で30〜60分間細胞をインキュベート。このインキュベーションの後、3.5のステップに進む前に、Ca ²⁺の-HBSSで細胞を3回すすいでください。
ロードされた試薬の脱エステル化を可能にするために30分間のCa ²⁺ -HBSSで細胞を培養する。
イメージングの直前に、最終インキュベーション中に風呂に漏れた可能性のある染料を除去するために、「新鮮な」のCa ²⁺ -HBSSでのCa ²⁺ -HBSSを交換してください。

4.のCa ²⁺

100X APO TIRF目標（NA 1.49）上に浸漬油の小滴を置きます。
倒立顕微鏡のステージ上での結像の皿をマウントし、透過光を用いて、焦点に細胞をもたらす。なお、記録時の移動を防止するために、撮像皿を確保することが重要である。
高速EMCCDカメラを使用して発せられる蛍光（λ> 510 nm）をカル-520を励起し、収集するために、488nmレーザーで細胞を照らす。
注：顕微鏡を操作するソフトウェアパッケージは、ユーザが、レーザビームのいずれか（「WF」励起用）より中央または（TIRF励起用）は、対物背面開口部の極端なエッジで導入されることを可能にする集束レンズを翻訳することができる。
EMCCDソフトウェアを使用して、ローカルのCa ²⁺のイベントをキャプチャするために必要な時間分解能でデータを収集するために、完全な512×512画素からの撮像視野を減らす。
注：たとえば、中央クワッド256×256ピクセルの買収は、66 fpsに取得率を高速化します。さらに、単離されたクロップ·モード機能を使用して500 fpsにEMCCDカメラのフレームレートを増加させることも可能である。
自動的に、ベースラインアクティビティの数秒を記録し、細胞に紫外線フラッシュを提供し、別の10〜30秒の記録を継続してソフトウェアを設定します。
NOTE：UVフラッシュ、顕微鏡の背面ポートにおける反射ダイクロイックミラーUVを通して導入キセノンアーク光源を用いて送達される。 UVフラッシュの持続時間と強度は、地元のCa ²⁺イベントの所望の周波数を呼び起こすために経験的に調整されている。
オフライン分析のための画像スタックなどのファイルに保存する。

5.自動化のCa ²⁺画像解析

注：これは、表示プロセスと多くの商用ソフトウェアパッケージを使用して、キャプチャしたデータを分析することが可能である。しかし、我々は急速に識別ANを自動化するためのアルゴリズムを開発した地元のCa ²⁺シグナルのd分析。このアルゴリズムで使用される空間的および時間的フィルタの詳細な説明は、ΔF/ F ₀と識別/分析ルーチンの発生が¹¹に見出すことができる。このアルゴリズムは、オープンソースソフトウェアプラットフォームのPythonで実行するために開発された、対応する著者（ismith@uci.edu）を電子メールで送信することにより、一緒にサンプル実験データと詳細な取扱説明書を得ることができる。

マルチプレーン.TIFFファイル形式にカスタム書かれたアルゴリズムにインポートするファイルを変換します。
解析アルゴリズムを含むフォルダを見つけてダブルRUN.EXEをクリックします。
分析されるべき.TIFFファイルを選択します。
[開く]ダイアログボックスの[解析パラメータを選択してください。サンプルデータのデフォルトのパラメータについて、図2Aを参照のこと。
nとし、視野の部分にカーソルを移動させるのいずれかによって画像スタックからオフセットされる黒レベルを決定する細胞が含まれている（ 図2Bを参照）、または手動で「セットブラックレベル」プロンプトを使用して黒レベルを入力することにより、OT。
ソフトウェアによる分析（ 図2C-F）以下の画面上に4つのウィンドウを観察します。 Cは、分析された細胞からの蛍光を安静時のモノクロ画像である。この画像に重畳白い四角はイベントに備えた2次元ガウス関数の重心位置として決定し、イベントの場所である。
各イベントの場所をクリックするか、イベント間のサイクルにカーソルキーを押してください。そのようにこれらの各サイトでのバックグラウンドを差し引い、ガウシアン平滑化蛍光比の変化（ΔF/ F _0）を実行するとウィンドウDに更新する
メモ：Redイベントが隣接する部位に局在活動から「ブリードスルー」からその特定のサイトから発信していないと判断された強調した。選択された部位での蛍光シグナルの検出を超えた場合に低い青のトレースを示ししきい値は、黒い線のに対し、（イベントを強調し赤に相当する）、その特定のサイトから発信するイベントを識別します。
赤をクリックしてイベントの時間発展を表示するウィンドウのE、およびイベントの空間プロファイルが一緒にフィットガウス関数の空間プロファイルで、その時間経過にわたって平均化され表示されたウィンドウFを更新するためにイベントを強調した。
手動での成果物は、分析から除外することができるように特定されたイベントを確認します。右の赤いをクリックして、このようなイベントを削除するには、イベントを強調した。
注：我々の手では、単一のIP ₃ Rチャネルを通じたCa ²⁺フラックスは約0.11ΔF/ F ₀で信号を連想させるので、これは偽陽性である可能性が高いよりも、任意の検出された「イベント」かなり小さい。
目的の細胞の周りに描画し、「保存CellRを選択することで、セルごとに、またはエクスポートデータ」をExcelに保存」を選択してデータをエクスポート17 ;.
注：データは元の画像スタックと同じフォルダに保存されます。

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Representative Results

図1Aはまた、ciは、IP ₃を装填したヒト神経芽細胞腫SH-SY5Y細胞におけるカル-520蛍光休止のWF画像を示す。フォト·リリースに100ミリ秒のUVフラッシュへのこれらの細胞の曝露は、I-IP _3は、（ 図1Aに白丸で示される）別個の部位での一過性のCa ²⁺パフを誘発した。これらの部位で測定された蛍光トレースはゆっくりとリリースサイトから拡散したCa ²⁺のような非常に遅い立相（ 図1Bおよび1C）が続くIP ₃ Rの一過性の開口部、のために急速な上昇相を示した。赤は、 図1Bのイベントが選択されたサイトから発信されたのは、アルゴリズムによって決定されたのCa ²⁺シグナルである強調した。非ハイライトのイベントが密接に隣接する部位から拡散するのCa ²⁺シグナルを汚染表す。

ローカルのCa高分解能イメージングを達成するために2+のバッファEGTAを装填できる。これは、Caのパフ部位間に拡散²⁺イオンをキレートため、IP ₃ Rの個々のクラスタによって生成されたローカルのCa ²⁺パフの研究を難読だろグローバルのCa ²⁺波の発生を防ぐことができます。さらに、EGTA、地元のCa ²⁺ミクロドメインの崩壊を加速ますが、その遅い結合反応速度のために、最小限のローカル遊離Ca ²⁺を摂動し、そのクラスタ内での高速のCa ²⁺指標への結合。 EGTAの正味の効果はかなり彼らの振幅を減少させることなく、空間と時間におけるパフの蛍光記録を「シャープに」することです。解像度の更なる向上は、TIRFによって作成された狭い（<100nm）をエバネッセント波カル-520フルオロフォアの励起を制限するためにTIRFを使用することによって生じる。これらのアプローチの両方の合計が効果的に瞬時のCaを監視する手法である²⁺ 2+の電流）のではなく、Ca ²⁺のリーク積分を、それがIP ₃ Rsにリリースされ、ゆっくりとリリースサイトから拡散し、最終的に^9を隔離された後。 図1DはのTIRF「フットプリント」を示していますカル-520蛍光団がカバーガラス/水溶液界面からの細胞内への狭い距離内だけ興奮していたSH-SY5Y細胞。 EGTAと併せて、全反射照明によって作成されたattoliterの細胞質のボリューム内での高速インジケータカル-520色素にのCa ²⁺の結合急速に「モップ」までのCa ²⁺拡散、時間と空間の両方で先鋭化された利回りの蛍光シグナル（ 図1Eおよび1F）。

このように、撮影した画像スタックの分析は非常にPythonの¹¹のオープンソース·ソフトウェア·プラットフォーム上で実行されている私たちの研究室で開発したカスタム書かれたアルゴリズムによって促進される。 図2Aは 、ユーザが識別および画像スタックのその後の分析のために使用するパラメータを入力する開口ダイアログウィンドウを示している。これに続いて、ユーザーは全体の画像スタックから減算される黒レベルを選択するよう求められるまでの同定と解析アルゴリズムの実行図2C-Fショー 、それぞれ、ローカルCA ²⁺放出の細胞内のサイト。選択された部位での活動。拡張したタイムスケール上の個々のイベント。代表イベントの空間的なプロファイルは、（詳細については、図2の凡例を参照）。同定された部位のユーザーレビュー時には、すべてのイベント（表1参照）のデータが関数'Excelに保存」を選択することでエクスポートすることができます分析した。

無負荷細胞内のWFイメージングと比較して、EGTA負荷細胞にTIRFイメージングによって達成解像性の向上、およびpの両方を示す。図3データを提示する地元のCa ²⁺シグナルを同定し、分析するのにアルゴリズムのower。 図3（a）は、カル-520及びCI-IP ₃でのみロードセルにWFで撮像された代表的なローカルイベントを示しています。比較のために、 図3Bは、類似したイベントを示しているが、現在はさらにEGTAでロードセル内の全反射顕微鏡で画像化。 図3Cおよび3D重畳トレースは、EGTA（黒）なしとEGTAローディング（赤）とTIRF顕微鏡によってWF蛍光によって記録されたイベントの時間（C）に対応し、空間（D）のプロファイルを示しています。 図3Eは、パフ振幅の平均測定値をプロットしますこれら2つの条件の下で減衰時間、および空間幅は、約44（WF）と88（TIRF）イベントを分析するためのアルゴリズムを用いて決定した。

図1：IP カル-520を搭載したSH-SY5Y細胞とCI-IP ₃広視野（Cを通じてA）で撮像されたとのTIRF（Fを通してD）顕微鏡。（A）モノクロ画像では地元のCa ²⁺シグナルを-evokedパフサイトの位置が白丸で示されたカル-520蛍光を休んで。スケールバー=10μmである。（B）トレースはパフは（A）のように番号3の異なるサイト、で誘発説明する。赤はイベントが、その特定のサイトから発信されたことが確認パフである強調した。 SHにカル-520蛍光休止の矢印は、UVフラッシュの時間を示している。（B）にあるような代表のCa ²⁺パフの（C）スーパーインポーズトレース、整列、拡大スケールで示す。（D）モノクロTIRF「フットプリント」の画像CI-IP ₃およびEGTAをロード-SY5Y細胞。白丸はパフサイトの起源を示す。（E） 2+パフの（F）スーパーインポーズトレース、整列、拡大スケールで示す。

図2：自動的に全反射顕微鏡で画像化SH-SY5Y細胞に地元のCa ²⁺シグナルを同定および分析するために設計、カスタムコードのユーザーインターフェイス（A）の同定および分析パラメーターが入力されたダイアログボックスを開く（B）は、ユーザーが選択した。。画像スタック内のすべてのフレームから減算する黒レベルを定義することなく、細胞を含まない画像の領域（C - F）。最終的な/識別解析ウィンドウのスクリーンショット（C）安静時のイメージカル-5のCa ²⁺トランジェントの位置を重畳された20の蛍光は（白四角）を同定した。ユーザは、画像の上にマウスを移動するか、カーソルキーを押すことで、サイト間のサイクルをすることができます。選択したイベントでの蛍光比（ΔF/ F _0）トレースを示す（D）ウインドウ。赤強調したイベントは、選択された部位で発生したものとして識別されます。下の青いバーは、そのサイトでの検出のためのしきい値を超えたイベントを示します。赤の強調表示されていないイベントは、隣接地に局在されています。青いバーをクリックすると、そのイベント会場にユーザーをとります。マウスで赤いイベントをクリックすると、イベントの拡張されたタイムスケール（E）上のイベントの時間発展と空間プロファイル（F）を示す2つの別のウィンドウがの空間プロファイルと一緒に（左）、その時間経過にわたって平均し開きます装着ガウス（右）。e.jpg「ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3：EGTAの細胞内ロードと一緒にTIRF顕微鏡法の使用によって達成パフ画像の時間的および空間的忠実度の向上に蛍光休止の背景画像に重畳ピーク振幅の時点でキャプチャパフの（A）スナップショットイメージ。セルのアウトラインを表示します。画像は、EGTAでロードされていない細胞のWF顕微鏡によって得た。パフイメージはますます「ウォーム」色で表さ高いのCa ²⁺レベルで、疑似カラーされている。EGTAでロードセルにTIRF顕微鏡によって撮像されたパフの（B）に対応する画像。（C）トレース、WF（黒）またはTIRF + EGTA（赤）、カル - 520 fluorescencの対応する変化を示し、（A）に示したCa ²⁺のパフの時間と上記（B）上の電子。トレースは、同じピーク振幅に正規化されて、反応速度の比較を容易にするために、それらのピーク時に整列される。注釈は、（E）で定量化のCa ²⁺イベントパラメータ（時間を振幅と秋）。（D）トレースの測定結果を示して、WF（黒）またはTIRF + EGTA（赤）は、ラインの蛍光強度は、Ca ²をスキャン表示する^+（A）に示されるパフ及び（B）。ラインスキャンは、それらのピーク振幅に正規化され、中央に配置されます。注釈は、（E）で定量し、半分の最大振幅（FWHM）での全幅の測定を示す。平均ピーク振幅（上）を示す（E）バーグラフは、ピーク振幅（中央）の20％の80％から立ち下がり時間、空間幅（FWHM）パフのEGTA（オープンバー）することなく、細胞内のWFの顕微鏡で画像化し、バイEGTA負荷細胞におけるTIRF顕微鏡（灰色の棒）。データは、少なくとも37パフのnは平均値±SEMとして提示されているWF用とTIRFための79。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

A.	グループ＃	イベントサイトの識別番号
B.	GroupX：	特定の部位ですべてのイベントのサブピクセルのx位置を意味する
C.	GroupY：	特定のサイトですべてのイベントのサブピクセルのy位置を意味する
D.	いいえイベント：	実験の過程にわたって現場で発生するイベントの第。
E.	マックスアンプ：	その特定の部位でのイベントの最大振幅（ΔF/ F _0）
F.	X：	イベントのサブピクセルxローカリゼーション
G.	Y：	サブピクセルイルイベントのocalization
H.	T_peak：	イベントが（フレーム数）のピーク振幅に達する時間
I.	振幅：	各サイトから発信するすべてのイベントの振幅（ΔF/ F _0）
J.	シグマックス：	ガウス分布のXのSD（ピクセル単位）イベントの時間経過に装着
K.	Sigmay：	ガウス分布のY SD（ピクセル単位）イベントの時間経過に装着
L.	角度：	イベントの時間経過に装着ガウスの結果として生じる楕円関数の長軸の角度
M.	R20：	（フレーム内の）最大振幅の20％に上昇するまでの時間
N.	R50：	（フレーム内の）最大振幅の50％に上昇するまでの時間
O.	R80：	上昇するための時間（フレーム内の）最大振幅の80％
P.	R100：	（フレーム内の）最大振幅の100％まで上昇する時間
Q.	F80：	（フレーム単位で）最大振幅の80％に落ちるまでの時間
R.	F50：	（フレーム単位で）最大振幅の50％に落ちるまでの時間
S.	F20：	（フレーム単位で）最大振幅の20％まで低下するまでの時間
T.	F0：	（フレーム内の）イベント前にベースラインに戻るまでの時間

表1：アルゴリズムからの出力データ。

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Discussion

私たちはここに記述し、蛍光Ca ²⁺の指標を用いて培養された哺乳動物細胞中で地元のCa ²⁺イベントを画像化するためのプロトコル。さらに、我々は、取得したデータの識別および分析を自動化する直感的なユーザーインターフェースでアルゴリズムを記述する。ここで説明する手順は、蛍光Ca ²⁺のインジケーターカル-520が、例えば、Fluo-3、Fluo-4のような他の多くのCa ²⁺感受性色素を利用して、のFluo-8およびオレゴングリーンBAPTA-1は、画像のCaに十分にうまく機能²⁺マイクロドメイン。注意は、これらの指標の高親和性バージョン（〜200〜400 nMでのK _d）は、画像に局所Ca ²⁺のミクロドメインを使用していることを保証するように注意する必要がなく、これらの指標の最適な負荷条件にするために経験的に決定される必要がある調査中の各細胞タイプ。その性質上²⁺指標は、Caと結合したCa ²⁺ため、Ca ²⁺のバッファとして機能する。インディカの高負荷濃度役は、Ca ²⁺シグナルが記録され、および/ またはここに記載の負荷条件が良好な出発点であるが、細胞内小器官に隔離することができると干渉する可能性がある。全体的に、地元のCa ²⁺イベントの活動を画像化することは、細胞のネイティブなアーキテクチャおよびCa ²⁺のミクロドメインの基礎となるチャンネルを調節することができる細胞質の要因を維持し、低侵襲性である。

我々はTIRF顕微鏡法を使用して、ローカルのCa ²⁺シグナルの高分解能イメージングのためにここで説明するプロトコルは、エバネッセントフィールド内にあるのCa ²⁺チャネルから生じるイベントに測定値を制限することは明らかで制限を有する。ただし、これは原形質膜内のチャネルに制限され、我々は、優先的に、原形質膜¹²の近くに位置することが見出されてきたこのような細胞内小器官内IP ₃ Rのようなチャネルへの適用性を実証されないが、そうでなければ、ネイティブ細胞環境におけるそれらの活性の電気生理学的記録にアクセスできなくなります。共焦点イメージングは、細胞内に深く生成されますが、光学部の厚さが広くなっている（100〜200nmのVS〜800 nm）であり、必要により時間分解能が制限されるという点で、TIRFイメージングに比べて不利な点がある信号のイメージングを可能にする共焦点スポットをスキャンした。イメージングは倒立顕微鏡を用いて落射蛍光モードで行われるため、ローカルおよびシングルチャネルのCa ²⁺シグナルの光学的記録は、容易に同時電気生理学的パッチクランプ記録と組み合わせることができる。

蛍光（ΔF/ F _0）の休止の比として蛍光のCa ²⁺シグナルを発現することによって、信号振幅の良好な相対的測定を得ることができる。しかし、絶対的なCa ²⁺の濃度の点で局所、一過性の蛍光変化の較正であることを警告する適切ではありません。のCa ²⁺放出チャネルまたはチャネルのクラスターの周りフリーの[Ca ^2+]およびCa ²⁺結合型インジケータの勾配は、光学顕微鏡によって解決することができ、したがって、顕微鏡の点広がり関数によってぼかされるよりも狭い。チャネルが開閉するように。また、ローカルの[Ca ^2+]チャネル孔の近傍にマイクロ秒のタイムスケールで変化します。このように、蛍光シグナルは、ローカルのCa ²⁺シグナル^13の基礎となる真のCa ²⁺ナノドメインの唯一のぼやけ（空間と時間的に）表現を提供する。

ここで説明されたアルゴリズムを大幅にカメラベースのイメージングからローカルのCa ²⁺シグナルの分析を容易にします。から複数のイベントからの時間的及び空間的データの両方を得、同定および分析だけでなく、自動化することによって、ユーザの偏りが解消されるが、画像スタックのギガバイトは、高度並列に分以内に処理することができる同時に単一細胞。

この原稿のデータはCa ²⁺のシグナルを媒介IP ₃の文脈で提示されていますが、記載されるアプローチは、容易に細胞質ゾルの局所的な変化を画像化するように拡張することができた[Ca ^2+]第二messenger-、リガンドの多数のタイプから発せられる電位依存性のCa ²⁺透過性イオンチャネル。ローカルのCa ²⁺事象の同定および分析を自動化するためのアルゴリズムの高スループットの性質はまた、アルツハイマー病および自閉症スペクトラム障害などの単一細胞モデルを介して、疾患状態におけるCa ²⁺ channelopathiesを画像化するために非常に有用であることを証明するべきである。

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Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human Neuroblastoma SH-SY5Y cells	ATCC	CRL-2266
Cal-520/AM	AAT Bioquest Inc.	21130
ci-IP₃(D-23-O-Isopropylidene-6-O-(2-nitro-4,5-dimethoxy)benzyl-myo-Inositol 1,4,5-trisphosphate-Hexakis(propionoxymethyl) Ester	SiChem	cag-iso-2-145-10
DMSO/20% pluronic F127	Invitrogen	P-3000MP
EGTA/AM	Invitrogen	E-1219
35 mm glass-bottom imaging dishes	MatTek	P35G-1.5-14-C