Biology

Imagem local Ca Published: March 3, 2015 doi: 10.3791/52516

DOI

Automatic Translation

English (Original)
العربية (Arabic)
中文 (Chinese)
dansk (Danish)
Nederlands (Dutch)
français (French)
Deutsch (German)
עברית (Hebrew)
हिंदी (Hindi)
italiano (Italian)
日本語 (Japanese)
한국어 (Korean)
norsk (Norwegian)
português (Portugese)
русский (Russian)
español (Spanish)
svenska (Swedish)
Türkçe (Turkish)

Jeffrey T. Lock¹, Kyle L. Ellefsen¹, Bret Settle¹, Ian Parker^1,2, Ian F. Smith¹

¹Neurobiology and Behavior, University of California, Irvine, ²Physiology and Biophysics, University of California, Irvine

Abstract

Citossólica Ca ²⁺ regular vários aspectos da atividade celular em quase todos os tipos de células, processos tão diversos como a transcrição de genes, excitabilidade elétrica e proliferação celular controle. A diversidade e especificidade de Ca ²⁺ sinalização deriva de mecanismos pelos quais Ca ²⁺ sinais são gerados para atuar em diferentes escalas de tempo e espaciais, que vão desde oscilações e ondas em toda a célula que ocorrem durante os períodos de minutos locais transitórias Ca ²⁺ microdomínios (Ca ²⁺ puffs) milésimos duradoura. Os recentes avanços na eletrônica multiplicado CCD (EMCCD) câmeras permitem agora para a imagem latente de ²⁺ sinais locais de Ca com uma resolução espacial de 128 x 128 pixels em taxas de quadros> 500 ^s-1 (FPS). Esta abordagem é altamente paralelo e permite a monitorização simultânea das centenas de canais ou sítios sopro numa única experiência. No entanto, a grande quantidade de dados gerados (cerca de 1 Gb per min) tornar a identificação visual e análise de Ca ²⁺ eventos locais impraticável. Aqui nós descrevemos e demonstrar os procedimentos para a aquisição, detecção e análise de IP local ₃ mediada por Ca ²⁺ sinais em células de mamíferos intactos carregados com ^{Ca2 +} indicadores que utilizam tanto de campo amplo epi-fluorescência (WF) e de reflexão interna total fluorescência (TIRF) microscopia. Além disso, descrevemos um algoritmo desenvolvido dentro do open-source software ambiente Python que automatiza a identificação e análise desses Ca ²⁺ sinais locais. O algoritmo localiza locais de Ca ²⁺ liberação com resolução sub-pixel; permite a revisão dos dados do usuário; e produz sequências de tempo de sinais de relação de fluorescência em conjunto com amplitude e dados cinéticos em uma tabela do Excel-compatível.

Introduction

Os íons de cálcio (Ca ²⁺⁾ ubíqua regular uma gama diversificada de processos biológicos, incluindo a expressão do gene, secreção e mudanças de longa duração em plasticidade sináptica ^1. Uma maneira através da qual Ca ²⁺ pode agir de maneira tão diversa é através dos diferentes padrões espaciais e temporais de Ca ²⁺ sinaliza uma célula pode gerar. Por exemplo, as elevações globais em cytosolic [Ca ^2+] contração gatilho no tecido muscular liso ² Considerando menor, elevações transitórias localizadas (locais Ca ²⁺ Microdomínios) estimular a expressão essencial para a aprendizagem e memória ³ gene.

Citosólico livre [Ca ^2+] é mantida a ~ 100 nM em repouso, mas pode levantar-se rapidamente de várias micro-molar seguindo o influxo de Ca2 ⁺ no citosol através de canais de Ca2 ⁺ de iões -permeable localizados na membrana do plasma e pela a libertação de Ca2 ⁺ a partir de s intracelularestores. O nosso laboratório concentra-se o receptor de inositol 1,4,5-trifosfato (IP ₃ R), que forma um canal de Ca2 ⁺ de libertação localizado na membrana do retículo endoplasmático (ER). Após a ligação de ambos _IP3 e Ca ²⁺ para a activação citosólica sítios do receptor, o canal IP R ₃ se abre para libertar o Ca2 ⁺ sequestrado dentro do lúmen do ER. A libertação de Ca2 ⁺ pode permanecer limitada espacialmente, para um pequeno grupo de IP ₃ Rs para gerar um microdomínio citosólica locais de Ca2 ⁺ (Ca2 ⁺ sopro ^4), ou, dependendo da proximidade de aglomerados vizinhos de IP ₃ Rs, pode propagar ao longo de uma célula através do recrutamento de vários sites de sopro através de um processo de Ca2 ⁺ induzida por Ca2 ⁺ -release (CICR) ^5,6.

A introdução de pequenas molécula fluorescente de Ca ²⁺ corantes indicadores desenvolvido por Roger Tsien ^7, juntamente com o avançado imagi microscopiatécnicas Ng, facilitou muito a nossa compreensão do Ca ²⁺ sinalização. Recentes avanços em câmeras usadas para microscopia agora permitir transitórias de imagem locais Ca ²⁺ eventos como puffs com inédita resolução espacial e temporal. Atualmente câmeras EMCCD disponíveis permitem imagem com 128 x 128 pixels em> 500 quadros seg ^-1 (fps) e da nova geração de complementar semicondutor de óxido metálico (CMOS) câmeras proporcionar maior pixels de resolução e velocidade ainda mais rápido à custa de um pouco maior níveis de ruído. Em conjunto com a microscopia de reflexão interna total (TIRF) agora é possível imagem única Ca ²⁺ eventos canal ^8,9. Esta abordagem permite que a imagem de centenas de canais / eventos simultaneamente, ao gerar grandes conjuntos de dados (cerca de 1 GB por min) que tornam o processamento manual, identificação visual e análise impraticável e colocar um ônus sobre o desenvolvimento de algoritmos automáticos.

2+ sinais locais em células de mamíferos intactos usando fluorescentes Ca ²⁺ indicadores. Demonstramos ainda um algoritmo desenvolvido no ambiente Python open-source que automatiza a identificação e análise de ^{Ca2 +} eventos locais fotografados por ambos TIRF e microscopia de campo largo epi-fluorescência convencional (WF). Embora estas abordagens descrevemos no contexto da PI ₃ -generated Ca ²⁺ sinais, eles são facilmente recuperáveis para estudar alterações locais na citosólica [Ca ^2+] emanados a partir de uma variedade de canais de Ca2 ⁺ de iões -permeable localizados quer na superfície membrana ou organelas intracelulares ^8-10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Nós apresentamos os procedimentos detalhados de imagem Ca ²⁺ eventos locais em neuroblastoma humano células SH-SY5Y. Estes procedimentos podem ser adaptados para a imagem de Ca ²⁺ intracelular sinais em muitos tipos de células ^8-10.

1. Preparação de células

Cultura as células a ser trabalhada de acordo com as instruções constantes no site do seu fornecedor.
Alguns dias antes da imagiologia, colheita células cultivadas num frasco de cultura de tecidos com 1 ml de 0,25% de tripsina / EDTA (2-3 min). Após separação, adicionar um volume igual de meio de cultura para inactivar a tripsina.
Executar uma contagem de células utilizando um hemocitómetro e as células em pratos de semente de imagem de fundo de vidro, a uma densidade de 3-7 x 10 ⁴ culas por prato. Selecione as células para experimentos com imagens quando chegar a 60% de confluência (2-3 dias).

2. Preparação de Soluções e Reagentes

Prepare uma CA ²⁺ molecular contendo tampão HEPESsolução de sal de (Ca ²⁺ -HBSS) composto por (mM): 135 NaCl, 5,4 KCl, 2 _CaCl2, 1 _MgCl2, 10 HEPES, e 10 de glucose; pH = 7,4 à temperatura ambiente (TA) com NaOH. Prepare Ca ²⁺ -HBSS sem a adição de glicose e armazenar a 4 ° C; adicionar a solução de glicose imediatamente antes da utilização.
Solubiliza-se formas de membrana permeante do Ca ²⁺ indicador fluorescente Cal-520 (1 mM), ci-IP ₃ (200 uM), e EGTA (100 mM) em sulfóxido de dimetilo (DMSO) contendo 20% de Pluronic F-127. Alíquota estes reagentes em tubos Eppendorf e armazenamento, protegido da humidade e da luz, à temperatura de -20 ° C.

3. Carregando Cells com uma membrana de permeant Cal-520, ci-IP ₃ e EGTA

Preparar o "tampão de carga" diluindo soluções de reserva de permeante da membrana Cal-520 e ci-IP ₃ até uma concentração final de 5 uM e 1 uM, respectivamente, em Ca ²⁺ -HBSS.
Aspirar cumedia LTURE e lavar as células através da substituição de mídia com Ca ²⁺ -HBSS três vezes.
Remover Ca ²⁺ -HBSS e incubar as células em tampão de carga, durante 60 minutos à temperatura ambiente no escuro.
Remover tampão de carregamento e enxaguar células, substituindo mídia com Ca ²⁺ -HBSS três vezes.
1. Se desejado, nesta etapa, as células de carga com EGTA / AM por diluição da solução de reserva até uma concentração final de 5 uM em Ca ²⁺ -HBSS e, em seguida, as células incubar durante 30-60 minutos à temperatura ambiente no escuro. Após esta incubação, lavar as células três vezes com Ca ²⁺ -HBSS antes de prosseguir para o passo 3.5.
Incubar as células em Ca ²⁺ -HBSS durante 30 min para permitir a desesterificação de reagentes carregados.
Imediatamente antes de imagem, substitua Ca ²⁺ -HBSS com "fresco" Ca ²⁺ -HBSS, a fim de remover qualquer corante que pode ter vazado para o banho durante a incubação final.

4. Ca ²⁺

Coloque uma pequena gota de óleo de imersão para o objetivo 100X APO TIRF (NA 1,49).
Montar o prato de imagem na fase do microscópio invertido e trazer as células em foco utilizando luz transmitida. É importante proteger o prato de imagem para impedir o movimento durante a gravação.
Iluminar as células com um laser de 488 nm, a fim de excitar Cal-520 e recolher a fluorescência emitida (λ> 510 nm) usando uma câmara EMCCD alta velocidade.
NOTA: O pacote de software que opera o microscópio permite ao utilizador para traduzir uma lente de focagem, permitindo que o feixe de laser a ser introduzido quer no bordo extremo da abertura traseira objectivo (por excitação TIRF) ou mais centralmente (para a excitação "WF").
Usando o software EMCCD, reduzir o campo de imagem a partir da plena 512 x 512 pixels, a fim de coletar dados na resolução temporal necessário para capturar Ca ²⁺ eventos locais.
NOTA: Por exemplo, quad centeraquisição de 256 x 256 pixels acelera a taxa de aquisição de 66 fps. Também é possível aumentar ainda mais a taxa de quadros da câmera EMCCD para 500 fps usando uma função Modo de recorte isolado.
Configure o software para gravar automaticamente alguns segundos de atividade basal, entregar um flash UV para as células e continuar a gravação para outra 10-30 seg.
NOTA: Um lampejo de UV é entregue utilizando uma fonte de luz de arco de xénon introduzido através de um espelho dicróico UV reflectindo na porta traseira do microscópio. A duração e intensidade do lampejo de UV é ajustado empiricamente para evocar uma frequência desejada de Ca ²⁺ acontecimentos locais.
Salvar arquivos como imagem pilhas para análise off-line.

5. Automated Ca ²⁺ Análise Imagem

NOTA: É possível visualizar, processar e analisar dados capturados usando muitos pacotes de software comerciais. No entanto, temos desenvolvido um algoritmo para automatizar rapidamente uma identificaçãod análise de Ca ²⁺ sinais locais. Uma descrição detalhada dos filtros espaciais e temporais utilizados neste algoritmo, a geração dos Af / F ₀ e identificação / rotinas de análise pode ser encontrado em ^11. Este algoritmo foi desenvolvido para rodar na plataforma Python software open-source, e pode ser obtido, juntamente com a amostra de dados experimentais e instruções detalhadas de usuários, pelo autor correspondente e-mails (ismith@uci.edu).

Converta arquivos a serem importados para o algoritmo escrito sob medida para o formato de arquivo multi-plano .tiff.
Localize a pasta que contém o algoritmo de análise e dê um duplo clique no run.exe.
Selecione o arquivo .tiff a ser analisado.
Escolha os parâmetros de análise na caixa de diálogo aberta. Veja a Figura 2A para parâmetros padrão para os dados de exemplo.
Determinar o nível de preto para ser deslocada da pilha pela imagem seja movendo o cursor para uma parte do campo de visão que n fazot conter uma célula (ver Figura 2B) ou digitando manualmente um nível de preto usando o prompt de 'Black Nível Definir'.
Observe quatro janelas na tela seguinte análise pelo software (Figura 2C-F). C é uma imagem monocromática de descansar fluorescência a partir de células que está sendo analisado. Quadrados brancos sobrepostos na imagem são os locais de evento, determinados como as posições centróide funções de Gauss bidimensionais que equipam os eventos.
Clique em cada local do evento ou pressione as teclas do cursor para navegar entre os eventos. Ao fazê-lo a subtracção do fundo, Gaussian alisou mudanças de relação de fluorescência (Af / F ₀₎ em cada um desses sites de atualização na janela D.
NOTA: Red destacou os acontecimentos estão determinados a se originam de que determinado site e não de "sangrar-through 'de atividade localizada para locais adjacentes. O traço azul mais baixo indica que o sinal de fluorescência no local seleccionado excedeu a detecçãolimiar, enquanto que a linha preta identifica eventos provenientes desse local particular (que corresponde ao vermelho eventos realçado).
Clique sobre um evento vermelho destaque para actualizar a janela E que mostra a evolução temporal do evento, e a janela F, que mostra o perfil espacial do evento, calculados sobre o curso de tempo, em conjunto com o perfil espacial da função de Gauss ajustada.
Manualmente todos os eventos que foram identificados para que os artefatos podem ser rejeitada de análise. Excluir tais eventos clicando o botão direito no vermelho destacou os acontecimentos.
NOTA: Em nossas mãos, fluxo de Ca2 ⁺ através dos canais individuais IP ₃ R evoca sinais com Af / F ₀ cerca de 0,11, então é provável que sejam falsos positivos quaisquer 'eventos' detectados sensivelmente menores do que isso.
Exportar dados Ao selecionar 'Salvar em Excel "ou exportação de dados em uma base por célula desenhando em torno da célula de interesse e selecionando" Salvar CellR17 ;.
NOTA: Os dados são salvos na mesma pasta que a pilha de imagem original.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figura 1A mostra uma imagem WF de descansar Cal-520 fluorescência em células neuroblastoma SH-SY5Y humanos também carregados com ci-IP _3. A exposição destas células para um flash de 100 ms para UV foto-release i-IP ₃ suscitou transientes de Ca2 ⁺ puffs em locais discretos (apontadas pelos círculos brancos na Figura 1A). Vestígios de fluorescência medidos nesses locais mostraram uma fase crescente, devido à rápida aberturas transientes de IP ₃ Rs, seguida por uma fase de queda muito mais lento (Figura 1B e 1C) como Ca ²⁺ lentamente difunde para longe do local de libertação. Vermelho destaque eventos na Figura 1B são sinais de Ca ^2+, que foram determinadas pelo algoritmo de ter originado a partir do local seleccionado. Os eventos não-destacadas representam contaminando Ca ²⁺ sinais de difusão a partir de sites de perto adjacentes.

Para alcançar uma maior resolução de imagem de Ca locais + EGTA tampão. Este quelata Ca ²⁺ difundem entre os sites de sopro e, portanto, impede a geração de globais Ca ²⁺ ondas que iria ofuscar o estudo de ^{Ca2 +} puffs locais geradas por grupos individuais de IP ₃ Rs. Além disso, EGTA acelera o colapso do Ca ²⁺ microdomínio local, mas, devido à sua cinética de ligação lentos, minimamente perturba isento de Ca ²⁺ e de locais de ligação para o seu indicador de Ca2 ⁺ rápido dentro de um conjunto. O efeito líquido de EGTA é "afinar" os registros de fluorescência de puffs no espaço e no tempo, sem sensivelmente diminuindo sua amplitude. Uma outra melhoria na resolução surge usando TIRF para limitar excitação dos Cal-520 fluorophores ao estreito (<100 nm) onda evanescente criado por TIRF. A soma de ambas as abordagens é uma técnica que monitora eficazmente instantânea Ca ²⁺ 2+ atual) ao invés de um integrante com vazamento de Ca ²⁺ depois é liberado através dos IP ₃ Rs e, lentamente, espalha para longe do local de libertação e, em última análise seqüestrado ^9. Figura 1D mostra o TIRF "pegada" de uma célula SH-SY5Y quando Cal-520 fluoróforos foram apenas animado dentro de uma distância estreita para dentro da célula a partir da interface / solução aquosa lamela. Ligação de Ca2 ⁺ para o indicador rápido Cal-520 corante dentro dos volumes attoliter citossólicos criados pela iluminação TIRF, em conjunto com EGTA rápida para 'mop' up diffusive Ca ^2+, os sinais de rendimento da fluorescência que são afiadas no tempo e no espaço ( Figura 1E e 1F).

A análise das pilhas de imagens capturado desta maneira é muito facilitada através de um algoritmo personalizado escrito desenvolvido em nosso laboratório em execução no open-source software plataforma Python ¹¹. A Figura 2A mostra a janela de diálogo de abertura na qual o utilizador introduz os parâmetros a serem utilizados para a identificação e análise subsequente de pilhas de imagens. Em seguida, o usuário é solicitado a selecionar um nível de preto para ser subtraído toda a pilha de imagem depois que a identificação e análise algoritmo roda Figura 2C-F mostram, respectivamente, os sítios subcelulares de liberação local Ca ^2+.; atividade em locais seleccionados; eventos individuais em uma escala de tempo alargado; e perfis espaciais de eventos representativos (ver Figura 2 legenda para detalhes). Após a revisão do usuário de sítios identificados, analisados dados de todos os eventos (ver Tabela 1) podem ser exportados, selecionando a função "Salvar em Excel".

A Figura 3 apresenta dados que ilustram tanto a melhoria na resolução alcançada por TIRF de imagem em células EGTA-carregado em relação à geração de imagens WF em células descarregados, eo power do algoritmo em identificar e analisar Ca ²⁺ sinais locais. A Figura 3A mostra um evento representante local fotografada pela WF em uma célula carregada somente com Cal-520 e ci-IP _3. Para comparação, a Figura 3B mostra um evento análogo mas agora visualizados por microscopia TIRF numa célula carregado adicionalmente com EGTA. Traços sobrepostos na Figura 3C e 3D, ilustram correspondente perfis dos eventos registrados pelo WF fluorescência sem EGTA (preto) e por microscopia TIRF com carga EGTA (vermelho) temporal (C) e espacial (D). Figura 3E parcelas: uma medição de amplitudes de sopro , tempos de decadência e largura espacial sob estas duas condições, determinada utilizando o algoritmo para analisar cerca de 44 (WF) e 88 (TIRF) eventos.

Figura 1: IP -evoked Ca ²⁺ locais sinais em células SH-SY5Y carregados com imagem monocromática da Cal-520 e ci-IP ₃ fotografada por todo o campo (de A a C) e TIRF (D a F) microscopia. (A) descansando Cal-520 fluorescência em que locais de sites de sopro são indicados por círculos brancos; barra de escala = 10 mm. (B) ilustram Traços baforadas evocado em três locais diferentes, numeradas como em (A). Red destaque eventos são identificados puffs para ter originado a partir desse site particular. A seta indica o tempo de flash de UV. (C) vestígios sobrepostas de representativos de ^{Ca2 +} puffs como aqueles em (B), alinhados e mostrado em escala ampliada. (D) Imagem monocromática TIRF "pegada" de descansar Cal-520 fluorescência em SH células -SY5Y carregados com ci-IP ₃ e EGTA. Círculos brancos denotam origens do site puff. (E) (F) vestígios sobrepostas de representativos de ^{Ca2 +} puffs como as de (E), alinhados e mostrado em escala ampliada.

Figura 2: Interface com o usuário de código personalizado projetado para automaticamente identificar e analisar ²⁺ sinais locais de Ca em células SH-SY5Y fotografada por microscopia TIRF (A) caixa de diálogo, onde os parâmetros de identificação e análise são inseridos de abertura (B) O usuário seleciona a.. . região da imagem que não contém células para definir o nível de preto que é subtraído do todos os quadros na pilha de imagens (C - F). Screenshots das janelas de análise final / identificação (C) Imagem de descansar Cal-5 20 de fluorescência em que são locais onde sobreposta Ca ^{2 +} transientes foram identificados (quadrados brancos). O usuário pode alternar entre os sites, movendo o mouse sobre a imagem ou pressionando as teclas do cursor. (D) Janela mostrando taxa de fluorescência (Af / F ₀₎ traço no evento selecionado. Eventos Vermelho-destaque são identificados como tendo surgido no local selecionado. Quanto menor barra azul indica eventos que excedam o limite de detecção nesse local; eventos não destacado em vermelho foram localizados em um local adjacente. Clicando na barra azul leva o usuário para o site do evento. Ao clicar em um evento de vermelho com o mouse abre mais duas janelas que mostram a evolução temporal do evento em uma escala de tempo expandido (E) e perfis espaciais (F) do evento, calculados sobre a sua evolução no tempo (à esquerda) em conjunto com o perfil espacial da o Gaussian equipada (à direita)."target =" _ E.jpg blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Melhoria na fidelidade temporal e espacial da imagem sopro alcançado pelo uso de microscopia TIRF em conjunto com carga intracelular de EGTA (A) imagem instantâneo de um sopro capturado no momento da amplitude de pico, sobrepor uma imagem de fluorescência para descansar no fundo. mostram o contorno celular. A imagem foi obtida por microscopia WF de uma célula não carregado com EGTA. A imagem de sopro é pseudocolored, com maiores níveis de Ca ²⁺ indicados por cada vez mais cores "quente". (B) correspondente imagem de um sopro fotografada por microscopia TIRF em uma célula carregado com EGTA. (C) Traces, WF (preto) ou TIRF + EGTA (vermelho), mostram a correspondente alteração no Cal-520 fluorescence ao longo do tempo para as baforadas de ^{Ca2 +} indicadas em (A) e (B) acima. Traços são normalizadas para a mesma amplitude de pico e alinhadas com o seu tempo de pico para facilitar a comparação da sua cinética. Anotações ilustrar medições de Ca ²⁺ parâmetros de evento (amplitude e tempo de cair) quantificado em (E). (D) Traces, WF (preto) ou TIRF + EGTA (vermelho), mostram a intensidade de fluorescência de uma linha de varredura através da Ca ^{2 +} inalações mostrado em (A) e (B). Scans de linha são normalizados para as suas amplitudes de pico, e centrado. A anotação mostra a medição da largura total a meia amplitude máxima (FWHM), como quantificada em (E). Gráficos (E) de barras que mostra as amplitudes de pico médios (em cima), caem vezes a partir de 80% a 20% da amplitude de pico (meio), e a largura do espaço (FWHM) de baforadas fotografadas por microscopia WF em células sem EGTA (barras abertas) e pela microscopia TIRF em células carregadas com EGTA (barras cinzentas). Os dados são apresentados como média ± EPM com um n de pelo menos 37 baforadaspara WF e 79 para TIRF. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A.	Grupo #	Evento número de identidade do site
B.	Chamado GROUPx:	Sub-pixel x localização de todos os eventos média em um determinado site
C.	Groupy:	Sub-pixel local y de todos os eventos média em um determinado site
D.	Eventos: No.	Número de eventos que ocorrem num local ao longo do curso do experimento.
E.	Max Amp:	Amplitude máxima de um evento em que determinado site (Af / F ₀₎
F.	X:	Sub-pixel x localização do evento
G.	Y:	Sub-pixel ilocalization de evento
H.	T_peak:	Hora em que o evento atinge amplitude de pico (em número de quadros)
EU.	Amplitude:	Amplitude de todos os eventos provenientes de cada local (Af / F ₀₎
J.	Sigmax:	X DP de perfil gaussiano montado curso de tempo de evento (em pixels)
K.	Sigmay:	Y SD de perfil gaussiano montado curso de tempo de evento (em pixels)
L.	Angle:	Ângulo do eixo do comprimento da função de Gauss elíptico resultante montado curso de tempo de evento
M.	R20:	Tempo a subir para 20% do valor máximo da amplitude (em frames)
N.	R50:	Tempo a subir para 50% do valor máximo da amplitude (em frames)
O.	R80:	Hora de subira 80% do valor máximo da amplitude (em frames)
P.	R100:	Tempo para atingir 100% do valor máximo da amplitude (em frames)
Q.	F80:	Tempo para cair a 80% da amplitude máxima (em imagens)
R.	F50:	Tempo para cair a 50% da amplitude máxima (em imagens)
S.	F20:	Tempo para cair a 20% da amplitude máxima (em imagens)
T.	F0:	Hora de voltar para pré-evento da linha de base (em imagens)

Tabela 1: Dados de saída do algoritmo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Descrevemos aqui protocolos de imagem Ca ²⁺ eventos locais em células de mamíferos em cultura usando fluorescentes Ca ²⁺ indicadores. Além disso, descrevemos um algoritmo com uma interface de usuário intuitiva que automatiza a identificação e análise dos dados adquiridos. O procedimento aqui descrito utilizar o Ca ²⁺ indicador fluorescente Cal-520, mas muitos outros corantes de Ca2 ⁺ sensíveis, tais como Fluo-3, Fluo-4, Fluo-8 e Verde Oregon BAPTA-1 desempenho suficientemente bem para a imagem de Ca ²⁺ microdomínios. Cuidados que devem ser tomados para garantir que as versões de alta afinidade (K _d de ~ 200-400 nm) destes indicadores são utilizados para a imagem locais Ca ²⁺ microdomínios, e as condições de carga óptima desses indicadores precisam ser determinados empiricamente para cada tipo de célula sob investigação. Pela sua natureza Ca ²⁺ indicadores ligar Ca ²⁺ e, assim, atuar como Ca ²⁺ buffers; As concentrações mais elevadas de carregamento indicatores têm o potencial de interferir com os sinais de Ca2 ⁺ sendo gravado e / ou podem ser seqüestrado em organelas intracelulares, embora as condições de carga descritas aqui são um bom ponto de partida. Em geral, imagiologia da actividade de Ca2 ⁺ acontecimentos locais é minimamente invasivo, mantendo a arquitectura nativo de uma célula e os factores citosólicas que podem regular os canais de Ca2 ⁺ que estão subjacentes microdomínios.

O protocolo, descrevemos aqui para imagens de alta resolução de ^{2 +} sinais CA local usando microscopia TIRF tem a limitação óbvia na medida em que restringe as medições para eventos que surgem a partir de canais de Ca2 ⁺ que encontram-se dentro do campo evanescente. No entanto, ela não é restrita apenas a canais na membrana do plasma, e que demonstram a sua aplicabilidade a canais tais como o IP ₃ R em organelos intracelulares que foram encontrados para ser preferencialmente localizado perto da membrana plasmática, mas ¹²de outra forma seriam inacessíveis para a gravação da sua actividade electrofisiológica no ambiente celular nativo. Imagiologia confocal permitiria imagiologia de sinais gerados mais profundamente na pilha, mas tem desvantagens em comparação com a imagem TIRF, em que a espessura da secção óptica é mais larga (~ 800 nm vs 100-200 nm) e está limitada na resolução temporal pela necessidade para digitalizar o local confocal (s). Porque imagem é feito em um modo de epi-fluorescência usando um microscópio invertido, gravações ópticas de Ca ²⁺ sinais locais e de canal único pode ser facilmente combinado com simultânea eletrofisiológico gravação patch-clamp.

Ao expressar fluorescência de Ca2 ⁺ sinais como uma proporção de fluorescência de repouso (Af / F _0), é possível obter uma boa medida relativa de amplitudes do sinal. No entanto, alertamos que a calibração de fluorescência, mudanças transitórias locais em termos de concentrações absolutas de Ca2 ⁺ énão é apropriado. Os gradientes de livre indicador -bound [Ca ^2+] e Ca ²⁺ em torno de um canal de liberação de Ca2 ⁺ ou cluster de canais é mais estreita que pode ser resolvido por meio de microscopia óptica e por isso serão borradas pela função de dispersão do microscópio. Além disso, as estações de [Ca ^2+] nas imediações do poro do canal vai mudar em uma escala de tempo microssegundo como o canal abre e fecha. Assim, os sinais de fluorescência fornecer apenas um (no espaço e no tempo) representação turva do verdadeiro Ca ²⁺ nanodomain subjacente Ca ²⁺ sinais locais ^13.

O algoritmo descrito aqui facilita muito a análise dos sinais locais de Ca ²⁺ de imagens baseado em câmera. Ao automatizar a identificação e análise não só é viés usuário eliminado, mas gigabytes de pilhas de imagens pode ser processado dentro de minutos em uma forma altamente paralelos, produzindo tanto dados temporais e espaciais de vários eventos nauma única célula simultaneamente.

Embora os dados neste manuscrito são apresentados no contexto de IP ₃ mediada por Ca ²⁺ sinais, as abordagens descritas podem ser prontamente alargado para imagiologia alterações locais na citosólica [Ca ^2+] emanando de numerosos tipos de ligando-, segunda messenger- e Ca ²⁺ canais iônicos -permeable dependentes de voltagem. A natureza de alto rendimento do algoritmo para automatizar a identificação e análise de Ca ²⁺ eventos locais também devem revelar-se muito útil para a imagem Ca ²⁺ canalopatias em estados de doenças via modelos de uma única célula, como a doença e transtorno do espectro do autismo de Alzheimer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human Neuroblastoma SH-SY5Y cells	ATCC	CRL-2266
Cal-520/AM	AAT Bioquest Inc.	21130
ci-IP₃(D-23-O-Isopropylidene-6-O-(2-nitro-4,5-dimethoxy)benzyl-myo-Inositol 1,4,5-trisphosphate-Hexakis(propionoxymethyl) Ester	SiChem	cag-iso-2-145-10
DMSO/20% pluronic F127	Invitrogen	P-3000MP
EGTA/AM	Invitrogen	E-1219
35 mm glass-bottom imaging dishes	MatTek	P35G-1.5-14-C