Summary
Vi presenterar en diskret droppprov introduktion system för induktivt kopplad plasma masspektrometri (ICPMS). Den är baserad på en billig och av engångstyp mikrofluidisk chip som genererar starkt monodispersa droppar i ett storleksområde av 40-60 ^ m vid frekvenser från 90 till 7000 Hz.
Abstract
Detta protokoll diskuterar tillverkning och användning av en engångs låg kostnad mikroflödes chip som prov introduktion system för induktivt kopplad plasma masspektrometri (ICPMS). Chipet producerar monodispersa vattenhaltiga provdroppar i perfluorhexan (PFH). Kan varieras storleken och frekvensen av de vattenhaltiga dropparna i intervallet 40 till 60 pm och från 90 till 7000 Hz, respektive. De små dropparna stöts ut från chipet med ett andra flöde av PFH och förbli intakt under utstötningen. En specialbyggd desolvation systemet avlägsnar PFH och transporterar dropparna in i ICPMS. Här kan mycket stabila signaler med en smal intensitetsfördelning mätas, visar monodispersitet av dropparna. Vi visar att införandet systemet kan användas för att kvantitativt bestämma järn i enstaka bovina röda blodkroppar. I framtiden kan funktionerna i introduktionen enheten lätt förlängas genom att integrera ytterligare mikroflödesmoduler.
Introduction
Elementaranalys av vätskeprover genom induktivt kopplad plasma-masspektrometri (ICPMS) utförs vanligen med användning av nebulisatorer i kombination med sprutkammare som introduktion systemet 1. I detta prov introduktion systemet provet sprutas genom en nebulisator för att generera en polydispers aerosol. En nedströms sprutkammaren används för att filtrera ut stora droppar. Denna metod är förknippad med hög provförbrukning (> 0,3 ml min -1) 2 och en ofullständig provtransport. Således blir det opraktiskt för applikationer där endast mikroliter provvolymer finns, som i biologiska, kriminaltekniska, toxikologiska och kliniska studier 3. För att minska provkonsumtionen, var nebulisatorer med mindre munstycke mått utvecklat 3. Dock ökar reducerade munstycksstorleken risken för igensättning när prover av osmälta biologiska vätskor eller koncentrerade saltlösningar måste analyseras 3.
et al. 4. Författarna injicerade en vätska i ICPMS i form av monodispersa diskreta mikrodroppar, som produceras av ett piezo-elektriskt drivna mikro. Även om detta mycket systemet inte hittar en bred tillämpning, inledde den vidareutveckling av konceptet diskreta dropp introduktion i ICPMS. Idag, piezo-elektriskt drivna utmatningssystem, som kan generera droppar i storlek hos 30, 50, 70 och 100 ^ m och vid frekvenser på 100-2,000 Hz, kan köpas. Dropparna kan transporteras in i ICPMS med nära 100% effektivitet 5. Dessa mikrodroppe automater har tillämpats för att kvantitativt mäta enstaka nanopartiklar 5,6 samt karakterisera enskilda biologiska celler 7. Ett liknande system som bygger på termisk bläckstråleteknik 8 testades för analys av biologiska prover 9. Fastän Avallable enstaka droppintroduktionssystem är mycket effektiva, kan användas för små provvolymer och är lovande för analys av nanopartiklar och celler, de har flera begränsningar. För en fast dysstorlek, kan droppstorleken varieras endast något (om inte anpassade inställningar används 10). Förändringar av de fysikaliska egenskaperna hos vätskan (pH, saltinnehåll) kan förändra dropp egenskaper (storlek, injektionshastighet). Även dessa anordningar är ganska dyra, utsatta för igensättning och är svåra att rengöra.
En annan metod för att generera små droppar är känd inom området för dropp mikrofluidik 11. Under de senaste åren dropp mikrofluidik har fått intresse för (bio-) kemiska reaktioner 12-15 och för enstaka cellstudier 16,17. Dessutom var denna teknik tillämpas för att införa prov i elektrosprayjonisering masspektrometri 18,19 och för att förbereda prover i matrisassisterad laserdesorption / ionization masspektrometri 20,21.
Nyligen införde vi ett mikroflödesbaserat system för prov introduktion i ICPMS 22. Den nyckelkomponent i vår introduktion systemet är vätskan assisterad dropputstötningen (LADE) chip. Detta chip består helt av poly (dimetylsiloxan) (PDMS). I den första kanalen korsningen flöda fokusering används för att generera monodispersa droppar av en vattenhaltig provlösning (figur 1). För detta ändamål mycket rörligt (kokpunkt 58-60 ° C 23) och oblandbar bärvågsfas perfluorohexan (PFH) används (Figur 1). Dessa PFH egenskaper möjliggör en stabil droppgenerering och snabb borttagning av bärvågsfasen. Förändringar i egenskaperna för provvätskan inflytandet denna generation metoden mindre, jämfört med andra droppgeneratorer. Droppstorleken är justerbar över ett brett område genom att ändra flödeshastigheterna för den vattenhaltiga fasen och PFH. I en nedströms secondary korsningen, är mer PFH sättas för att öka flödeshastigheten till minst 1 m sek -1. Vid denna hastighet kan matas ut vätskan från chip i en stabil och rak stråle (figur 1) utan dropp förstöring (Figur 1 infälld). Denna dubbelkopplings design gör att styra strålen stabilitet oberoende av dropp generation. Dropparna transporteras till ICPMS med ett anpassat transportsystem. Detta system innefattar en fallande rör och en membran desolvator att avlägsna PFH. De torkade rester av vattendropparna därefter jonis i plasma av ICPMS och en massa detektor mäter jonerna. Den främre delen av chipet är tunnformade för att säkerställa en tät anslutning till dropp transportsystemet. Utstötningen av det vattenhaltiga provet som droppar i PFH är bra, eftersom kontakt med munstycket undviks. Detta minskar risken för tilltäppning av munstyckena, vilket kan vara ett problem när man arbetar med cellsuspensioner eller co avsevärtncentrated saltlösningar. De LADE chips, fabricerade av PDMS mjuk litografi, är billiga (materialkostnad ca $ 2 per chip), disponibel och lätt att ändra. I kombination med tillverkning som kräver endast en liten mängd av manuellt arbete kan utföras varje experiment med ett nytt chip. Därför behövs inte en mödosam rengöring och korskontaminering minimeras.
Här är tillverkningen av LADE chip med mjuk litografi och dess ansökan om ICPMS beskrivs. Exempel på mätningar med en vattenhaltig lösning och en cellsuspension presenteras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. SU-8 master Fabrication (Figur 2)
OBS: Utför tillverkning av SU-8 mästare formar i ett renrum för att förebygga brister som orsakas av dammpartiklar. Två skivor behövs för tillverkning, en wafer med mikroflödes funktioner och en utan.
- Förbered master formar för mikroflödeschip. Först tillämpa ett vidhäftningsskikt på kiselskivan.
- Torka en kiselskiva för 10 minuter vid 200 ° C. Kyl rånet ner till RT och ladda den på en spinnbeläggare och snurra päls den med SU-8 2002 med följande protokoll.
- Fördela ca 3 ml motstå på skivan.
- Snurra skivan vid 500 rpm under 10 sek för att sprida resisten över hela skivan.
- Snurra skivan vid 2000 rpm under 30 sek för att uppnå en resist höjd av ca 2 | im.
- Ta bort överflödigt motstå från kanten av skivan med en aceton indränkt kompress, för att förhindrastickning av skivan för att den varma plattan i nästa steg. Baka rånet för 60 sek vid 95 ° C på en het platta.
- Exponera hela underlags med ultraviolett ljus (80 mJ / cm 2 vid 365 nm). Post-baka skivan för 120 sek till 95 ° C.
- Kyl wafern ner och omedelbart snurra belägga skivan igen med hjälp av följande protokoll för SU-8 2050:
- Snurra skivan vid 100 rpm i 20 sek (dosera ca 3 ml SU-8 motstå under detta steg).
- Snurra skivan vid 500 rpm under 10 sek för att sprida resisten över hela skivan.
- Snurra skivan vid 3.250 rpm under 30 sek vilket ger en resist tjocklek på ungefär 40 pm.
- Återigen, ta bort överflödig motstå från kanten av skivan med en aceton indränkt kompress och mjuk baka rånet på en värmeplatta för 180 sek vid 65 ° C och 360 sek vid 95 ° C.
- Förbered fotomasken med sticking den till en soda-kalkglas. Se figur 3 för maskdesign. Använd en mask Aligner att exponera motstå med ultraviolett ljus (160 mJ / cm2, uppmätt vid 365 nm) genom förberedda masken. Baka den exponerade skivan igen på en varm platta för 60 sek vid 65 ° C och under 360 sek vid 95 ° C.
- Efter nedkylning rånet till RT, doppa den i en glaspetriskål fylld med utvecklare för 5 min för att utveckla resisten. Skaka försiktigt petriskål för att avlägsna oexponerade SU-8. Skölj skivan med isopropanol och blås den torr med en kväve pistol.
- Undersök skivan under ett mikroskop. Om outvecklad motstå kvar på funktioner, utveckla rånet igen i några minuter, som beskrivs i steg 1.7.
- Ta bort resterande lösningsmedel genom bakning rånen för 2 h vid 200 ° C. Kontrollera höjden av funktionerna med ett steg profile. Om den uppmätta höjden avviker från önskad höjd börjar med detta protocol igen och anpassa centrifugeringshastighet i steg 1.1.4.
- För att förhindra fastklibbning av PDMS till wafern silaniseras det genom att placera den i en torkapparat tillsammans med 50 ^ il 1 H, 1 H, 2 H, 2 H -perfluorodecyltrichlorosilane i en liten porslinsskål. Minska trycket i exsickator till 100 mbar och inkubera skivan i 12 h.
- För tomma PDMS delarna silaniseras annan kiselskiva med hjälp av metoden i steg 1.10. För att spara tid silaniseras båda rån samtidigt i en enda exsickator.
2. LADE Chip Fabrication
OBS: LADE chipet är gjord av två PDMS bitar som är sammanbundna genom limning 24. Den första delen innehåller mikroflödes funktioner. Den andra delen är platt och används för att täta kanalerna. Bundna tillsammans, bildar de runda formen som behövs för att koppla samman chip med dropp transportsystemet. Här, tillverkning avde två delarna och deras bindning beskrivs. Alla processsteg visas i figur 4.
- Bered 44 g av PDMS genom blandning 40 g av prepolymeren med 4 g av PDMS härdningsmedel (detta kommer att resultera i upp till 6 marker). Degas PDMS i exsickator tills det är bubbelfritt (det tar ca 20 min).
- Replica gjutning av de strukturerade halvorna.
- Placera gjutning formen ovanpå skivan och klickar på plats med hjälp av de vägledande strukturer runt designen (se figur 5). Hoppa över snapp på plats för den platta PDMS halvan.
- Häll ca 3 till 4 g av de avgasas PDMS i gjutform och placera den för 6 min på en varm platta vid 150 ° C. Svalka de härdade PDMS i gjutform och lyft försiktigt gjutning formuläret rånet med hjälp av en spatel.
- För att förhindra förorening av mikroflödessystem kanaler täcker sidan av chip som tidigare var i kontakt with rånet med tejp. Skär försiktigt tejpen längs kanten av PDMS delen för att avlägsna överskott PDMS.
- För att tillverka de platta PDMS halvorna upprepa ovannämnda stegen 2.2.1 till 2.2.3 med den tomma silaniserad rånet.
- Skala av bandet och punsch vätskeanslutnings hål i de strukturerade halvor med en biopsi hålslag. Skydda strukturer med tejp under lagring.
- Binda PDMS delarna samman genom limning hjälp av PDMS härdare 24.
- Ta en obehandlad kiselskiva och snurra päls det med PDMS härdare i 30 sekunder vid 6000 rpm. Ta rånet ur spinnbeläggare.
- Ta bort tejpen från de strukturerade halvor och placera dem med de strukturer nedåt på skivan. Tryck försiktigt på toppen av PDMS för att avlägsna luftbubblor.
- Ta bort tejpen från den tomma PDMS halvor. Ta en strukturerad halvan från skivan och manuellt justera den ovanpå den platta PDMS halvan. Tryck försiktigt ihopdel tillsammans för att avlägsna luftbubblor och låta den sammansatta spån botemedel för 24 h vid RT. Tryck inte ihop delarna med kraft eftersom detta kan orsaka kanalerna att kollapsa.
- Skär spetsen på chipet utmed indikatorlinje som är vinkelrät mot munstyckets kanal med en brukskniv för att öppna utloppsmunstycket. Använd en inriktningsanordning för att säkerställa ett rakt snitt, vilket är nödvändigt för en rak flytande utstötning. Inspektera chipet under ett mikroskop för fel i mikroflödeskanaler och dammpartiklar. Sätt en tejp över inloppshålen för att skydda markerna under lagring.
- Anslut en Wolff-flaskan med slang till en torr kvävekälla och till alla inlopp i LADE chipet. Deposition 50 pl 1H, 1H, 2H, 2H -perfluorodecyltrichlorosilane vid botten av Wolff-flaskan och stänga den.
- Silaniseras mikroflödeskanalerna genom att spola alla kanaler för 20 min med kväveflödet bär 1H, 1H H, 2 H -perfluorodecyltrichlorosilane vid en flödeshastighet av cirka 1 ml / sek. Flisen är redo för experiment och kan lagras under åtminstone flera veckor vid RT.
3. Förberedelser för Mätning / Droplet Transport System
OBS: Bygg hela dropp transportsystemet ovanpå ett optiskt bord, eftersom det är nödvändigt att konstruera en stabil stödstruktur för installationen. Ett system av hela dropp transportsystem visas i figur 6.
- Installera en anpassad cyklon poly (metylmetakrylat) (PMMA) adapter med en 50 cm bifogade rostfritt rör lodrätt. Fäst adaptern till en heliumkälla med en massflödesregulator. Bifoga en (gratis) kamera och en lampa till adaptern på motsatta platser för dropp visualisering.
- Placera en värmepatron i mitten av stålröret och använd poly (vinylklorid) (PVC) slang och en Legris tubekontakt för att ansluta änden av stålröret med inloppet av membran desolvator.
- Anslut utlopp desolvator med en annan PVC-slang till ett laminärt flödesadapter, som är direkt ansluten till ICPMS inlopp. Anslut laminärt flöde adaptern till en argon källa med en massflödesregulator och senare använda den för att blanda Argon för att uppnå en stabil drift skick.
- Rikta adaptern samt stålrör vertikalt med ett vattenpass. Om inriktningen inte är korrekt, kan det leda till betydande förluster av droppar. Sätt i en kontakt i adaptern för att förhindra gaser läcker ut under system uppvärmningstid.
- Börja alla ovan nämnda gasflöden och enheter som använder inställningarna från tabell 1. Låt systemet värmas upp i 15 minuter. Värmepatronen behöver 2 tim för att stabilisera temperaturen, slå på den i förväg.
- Placera sprutpumpar på ett rack på höjden av cyklon helium adapter. Håll avståndet mellansprutpumpar och adaptern så kort som möjligt.
4. Mätningar
OBSERVERA: Följande protokoll är skrivet i allmänna termer på grund av den mångfald av lösningar och suspensioner, som kan användas. Emellertid bör cellsuspensioner spädas till en koncentration av <1 x 10 7 celler / ml, vid enkelcellanalys utförs, för att säkerställa att majoriteten av de små dropparna bär endast en cell. För mätningar med celler placera sprutpumpar i en vinkel så att utloppet av sprutorna pekar nedåt och installera slangen på ett sådant sätt att de pekar nedåt.
- Fäst slangen till sprutorna. Belastning två 5 ml sprutor med perfluorhexan och en 1 ml spruta med en provlösning eller suspension. Ta bort alla bubblor fastnar i sprutorna och slangar.
- Installera sprutorna i en sprutpump och anslut dem till inloppen i chipet. Starta sprutpumpar använder startinställningar frånTabell 1 (eller högre flödeshastigheter). Ge flödena 3 till 5 minuter för att stabilisera.
- Avlägsna överskott vätska från spetsen av chipet med en vävnad. Vätskorna ska nu mata från chipet i en rak stråle. Om en rak utkast inte kan uppnås genom att torka med ett vävnads ersätta chippet och börja om med detta steg.
- Ta bort pluggen från adaptern och försiktigt in chipet i adaptern. Smörj chip med FC-40 vid behov. Ett chip kan användas under minst 2 h av experiment.
- Ändra flödeshastigheten att vara inom de inställningar som rekommenderas mätnings från tabell 1. Lägre flödeshastighet av PFH inte bara sparar PFH utan även minskar signal bakgrund, som orsakas av isobariska interferenser.
- Ge systemet 2-5 min för att stabilisera (beroende på de valda flödeshastigheter). Optimera ICPMS för den högsta signalstyrkan av analyter av intresse.
- Successivt justera flödena av alla gALL om massflödesregulator (se de rekommenderade intervallen i tabell 1) tills den maximala signalstyrkan av analyt av intresse uppnås. Tune plasma makt och fokuseringslinsspänningarna (enligt tillverkarens rekommenderade intervall) på ICPMS på samma sätt.
- Ställ ICPMS till en uppehållstid på 10 msek (tillämpas för de ICPMS används men kan justeras med andra instrument för att garantera en tidsupplöst förvärv). Börja spela in signalen från en viss m / z använder tillverkarens protokoll.
- Efter mätningen, överföra rådata till dataanalys program för utvärdering. Bin data, som ges i räkningar per 10 ms, med en inbyggd-funktionen, och tomten resulte bin center värden mot räknas. Montera varje topp i den plottade frekvensfördelningen histogram med en Gauss-funktion. Medelvärdet och sigma av passningen representerar medelvärdet signalintensiteten och dess standardavvikelse, respektive.
- Mät en enda eller flera element standardlösning som innehåller delen eller delarna av intresse vid samma flödeshastigheter som provet.
- Placera en LADE chip i en petriskål på ett mikroskop. För en bättre bildkvalitet använda en icke-rund chip. Tillverka detta chip som beskrivs i steg 2, men med användning av en enkel rektangulär gjutningsform istället för den partiellt runda formade en.
- Följ stegen 4.1 till 4.2.1 för att starta dropp generationen. Ställ in flödeshastigheter till flöden som används i steg 5.1.
- Rekord bilder av vattendroppar med en höghastighetskamera fäst ett mikroskop (20X objektiv). Använd en bildanalys programvara som droppen morfometri och Velocimetry programvara genom Basu 25 att få den genomsnittliga droppdiametern från inspelningarna.
- Använd medeldroppdiametern för att beräkna droppvolymen, förutsatt droppen är ett sfäriskt objekt.
- Från denna volym och knegen koncentration av en analyt i droppen beräkna antalet motsvarande atomer. Dividera antalet uppmätta joner per droppe med antalet atomer för att få effektivitet upptäckt. Använd denna effektivitet upptäckt att beräkna antalet atomer i ett okänt prov.
OBS: Eftersom variationerna mellan enskilda marker är små 22, är det inte nödvändigt att upprepa mätningen av droppstorleken för varje chip eller lösning om flödeshastigheter förblir desamma. En förteckning över de droppstorlekar och frekvenser i enlighet med de specifika flödeshastigheter är publicerad av Verboket et al. 22.
- Från denna volym och knegen koncentration av en analyt i droppen beräkna antalet motsvarande atomer. Dividera antalet uppmätta joner per droppe med antalet atomer för att få effektivitet upptäckt. Använd denna effektivitet upptäckt att beräkna antalet atomer i ett okänt prov.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den presenterade Systemet kan användas för att mäta små volymer av lösningar eller suspensioner innehållande celler eller nanopartiklar. Exempel på en mätning av en standardlösning och karakterisering av enskilda celler visas här. Fler exempel kan hittas i Verboket et al. 22.
Typiskt signalen av en enda droppe av en lösning är en mycket kort händelse. Det varar vanligtvis några hundra isek 26. Med de ICPMS som används här (fördröjningstid 10 ms) korta signaler som dessa inte kan temporärt lösas. Figur 7a och figur 7b visar signaler och frekvensfördelningen histogram av en Na standardlösning. Dropparna kommer till plasma med en tids jitter> 10 ms. Den upptäckt är osynkroniserad. Signaler om en (201 ± 24), två (381 ± 34) eller tre (560 ± 45) droppar upptäcks inom en uppehållstid. Låg variation i signalintensitet antyder hög droPlet monodispersitet. Den första svanstoppen troligen resultatet av dropp fragment; orsaken till denna splittring är fortfarande under utredning.
Kalibrerings strategi som beskrivs i 5 (med användning av Fe standardlösning) testades för bestämning av Fe-halt av enstaka bovint / kalv röda blodceller (6-7 pm i diameter) suspenderades i fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Upphävandet av en x 10 7 celler ml -1 användes för att säkerställa att majoriteten av droppar bär endast en cell. Figur 8 visar signalerna från celler som frekvensfördelning histogram. I genomsnitt innehöll varje cell 5.3 ± 1,2 x 10 8 Fe atomer (se Verboket et al. 22).
Figur 1. mikroskop av dropp generation, acceleration och utstötning. I ett flöde fokus junctjon, är monodispersa vattenhaltiga droppar alstras i strömmen av PFH. Ytterligare PFH tillsättes vid en andra föreningspunkt. Därefter är vätskeströmmen som sprutas ut från LADE chipet genom ett munstycke. Pilar indikerar riktningen för flödet. Skala bar är 500 nm. Infällt: Micrograph av en vattenhaltig droppe i en PFH höljet efter utstötning från LADE chipet. Scale bar 100 | im. Anpassad med tillstånd från 22. Copyright 2014 American Chemical Society. Denna siffra har modifierats med data från forskning som bedrivs sedan publiceringen i laboratorium PS Dittrich. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Schematisk ritning av SU-8 bearbetning. Först ett vidhäftningsskikt är belagt. En kiselskiva är spinbelagd med SU-8 2002, mjuk bakad, översvämning exponeras med ultraviolett ljus och post bakade. Ovanpå detta skikt de mikroflödes strukturer produceras. Skivan är spinn belagd med SU-8 2050 och mjuk bakat. Utformningen av mikroflödes strukturer överförs till skivan genom att exponera den med ultraviolett ljus genom en fotomask. Efter en efterexponering baka, är fotoresisten utvecklas och en MANDELKNÄCK utförs. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Design av fotomasker för LADE chip som innehåller följande funktioner: a) vägledande strukturer för gjutning formuläret, b) ett inlopp för PFH för dropp acceleration, c) ett inlopp för PFH för droppgenerering och d) ett inlopp för det vattenhaltiga provet.e) Indikator linje för att skära av spetsen av chipet. Kanalbredder f) = 40 pm, g) = 20 pm och h) = 25 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Process diagram av LADE chip tillverkning. Först den strukturerade och de platta PDMS delarna tillverkas av replika gjutning. De två delarna är sammanbundna genom limning. Slutligen, är spetsen av chipet avskurna och mikroflödeskanaler silaniseras. Anpassad med tillstånd från 22. Copyright 2014 American Chemical Society. Denna siffra har ändrats sedan publiceringen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Teknisk ritning av aluminiumgjutning formuläret för LADE chip. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. Schematisk bild av installationen (ej skalenlig). Systemet består av LADE chip, en cyklonadapter, en uppvärmd stålrör, en membran desolvator och en ICPMS. Klicka här för att se en större version av denna siffra .
pload / 52525 / 52525fig7highres.jpg "/>
Figur 7. (A) Signaler om droppar gjorda av en 1 mg kg -1 Na standardlösning. (B) Frekvensfördelning histogram av dessa signaler. I de 10 ms bo tidssignaler från en (gul), två (röd) eller tre (blå) droppar registrerades. Medelvärde och standardavvikelse av signalerna bestämdes genom montering Gaussfunktioner. De flöden som användes var 0,5, 50, och 60 pl min - 1 av vatten prov, PFH för dropp generation, och PFH för dropp acceleration, respektive. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8. Frekvensfördelning histogram över 56 Fe + signalerar GEnerated av röda blodkroppar. Medelvärde och standardavvikelse av signalerna bestämdes genom att anpassa en Gaussisk funktion. De flöden som användes var 2, 80, och 80 pl min - 1 av cellsuspension, PFH för dropp generation, och PFH för dropp acceleration, respektive.
| Han gasflödeshastighet | 0,6-0,8 L min -1 | |
| Patronvärmare | 30 W | |
| Desolvator membrantemperatur | 160 ° C | |
| Desolvator svepgas flödeshastighet | 3-4 L min -1 | |
| Flödeshastighet Ar-gas | 0.1 L min -1 | |
| ICP plasmaeffekt | 1300 W | |
| Gasflöde | uppstart | 1 pl min -1 |
| mätning | 0,3-15 l min -1 | |
| Flöde av PFH dropp generation | uppstart | 60 pl min -1 |
| mätning | 35-80 pl min -1 | |
| Flöde av PFH droppacceleration | uppstart | 60 pl min -1 |
| mätning | 35-80 pl min -1 |
Tabell 1. Start-inställningar och rekommenderade inställningar mätnings för ICPMS och sprutpumpar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Även tillverkning av markerna är mycket pålitlig finns det några kritiska punkter under tillverkning som kräver särskild uppmärksamhet. Först, är renlighet under monteringen mycket viktigt för att förhindra kontaminering av chipet genom damm. Dammet kan blockera kanalerna och förhindra en stabil dropp generation. För det andra, är det särskilt viktigt att spetsen skärs ortogonal munstyckskanalen. Vinkeln av snittet starkt påverkar utstötningsvinkeln. Om vätskan sprutas ut i en vinkel det kan orsaka en förlust av de utstötta dropparna.
När man bygger installations se till att den är stabil. Den vertikala inriktningen av metallrör och adaptern är viktiga. Även under mätningarna finns det några punkter som behöver särskild uppmärksamhet. Insättningen av chipet i adaptern måste utföras noggrant. Det kan hända att under inför strålen störs och stannar. För mätningar med celler positionen och orientation av sprutpumpar och slangar är viktiga. Deras korrekt placering kan minska sedimentering av cellerna i sprutan och slangen.
Den LADE chip som presenteras här har flera fördelar jämfört med existerande kommersiella droppgeneratorer. Systemet är mer robust, ger en bredare droppstorleksområde, som kan förlängas ytterligare genom modifiering av kanalgeometrin, och är av engångstyp. En engångsanordning är av särskilt intresse för analys av prover med ett högt innehåll av salter och fasta rester, som till exempel nanopartiklar eller cellsuspensioner, vilket kan täppa små kanaler och kan inte alltid vara lätt tvättas ut. Transporten av enstaka mikrodroppar genereras av LADE till MS är fortfarande en begränsande steg i vårt system och måste optimeras ytterligare. Den nuvarande dropptransportenhet, även avlägsnar PFH ångan, som annars skulle skapa ytterligare spektral och icke-spektrala interferenser och orsaka plasmainstabiliteter, men still resulterar i en hög tids jitter av dropp ankomst till MS och en ofullständig dropptransport. I jämförelse med de kommersiella tillgängliga droppintroduktionssystem för transportsystem för denna inställning kräver mer utrustning. Den nuvarande chip är endast avsedd för prov introduktion. Men med små ändringar i designen avancerade introduktion och provberedning stegen moln implementeras på-chip, t.ex. utspädning 27-29, ultrasnabba blanda 30, kemiska reaktioner 31, separering 32-34, eller cellsortering 35,36. Under avancerade introduktionsenheter förstår vi till exempel införandet av prov- och standard droppar sekventiellt eller parallellt med ett enda chip. Detta skulle öka genomströmningen och förbättra noggrannheten av kvantitativ analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicon wafer 100 mm | Si-Mat (Kaufering, Germany) | ||
| SU-8 2002 | Microchem Corp. (Massachusetts, U.S.A.) | ||
| SU-8 2050 | Microchem Corp. (Massachusetts, U.S.A.) | ||
| Acetone | Merk VWR (Darmstadt, Germany) | 100014 | |
| MR-developer 600 | Microresist Technology GmbH (Berlin, Germany) | ||
| Isopropanol | Merk VWR (Darmstadt, Germany) | 109634 | |
| 1H,1H,2H,2H-perfluorodecyltrichlorosilane | ABCR-Chemicals (Karlsruhe, Germany) | AB111155 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit (PDMS) | Dow Corning (Michigan, U.S.A.) | 39100000 | |
| Perfluorohexane 99% | Sigma-Aldrich (Missouri, U.S.A.) | 281042 | |
| FC-40 | ABCR-Chemicals (Karlsruhe, Germany) | AB103511 | |
| Phosphate-buffered saline | Life Technologies (Paisley, U.K.) | 10010-015 | |
| Red blood cells in phosphate-buffered saline | Rockland Immunochemicals Inc. (Pennsylvania, U.S.A.) | R400-0100 | |
| Single-element standard solutions Na, Fe | Inorganic Ventures (Virginia, U.S.A.) | ||
| Multielement standard solution | Merck Millipore (Massachusetts, U.S.A.) | IV | |
| Nitric acid | Sub-boiled | ||
| Ultrahigh-purity water | Merck Millipore (Massachusetts, U.S.A.) | ||
| Hot plate HP 160 III BM | Sawatec (Sax, Switzerland) | used for wafer preparation | |
| Spin modules SM 180 BM | Sawatec (Sax, Switzerland) | used for wafer preparation | |
| High resolution film photomask | Microlitho (Essex, U.K.) | ||
| Step profiler Dektak XT advanced | Bruker (Massachusetts, U.S.A.) | ||
| Hot plate MR 3002 | Heidolph (Schwabach, Germany) | used for replica molding | |
| 1.5 mm biopsy puncher | Miltex (Pennsylvania, U.S.A.) | 33-31AA/33-31A | |
| Spin coater WS-400 BZ-6NPP/LITE | Laurell (Pennsylvania, U.S.A.) | used for adhesive bonding | |
| Syringe pump neMESYS | Cetoni (Korbussen, Germany) | ||
| 1 ml syringe | Codan (Lensahn, Germany) | 62.1002 | |
| 5 ml syringe | B. Braun (Melsungen, Germany) | 4606051V | |
| PTFE tubing | PKM SA (Lyss, Switzerland) | PTFE-AWG-TFT20.N | |
| Quadrupole-based ICPMS ELAN6000 | PerkinElmer (Massachusetts, U.S.A.) | ||
| Membrane desolvator CETAC6000AT+ | CETAC Technologies (Nebraska, U.S.A.) | only the desolvator unit is used | |
| High speed camera Miro M110 | Vision Research (New Jersey, U.S.A.) | ||
| Data analysis program Origin pro | OriginLab Corp. (Massachusetts, U.S.A.) | version 8.6 | |
| Microscope | Olympus (Tokyo, Japan) | IX71 |
References
- Todoli, J. -L., Mermet, J. -M. Liquid sample introduction in ICP spectrometry: A Practical Guide. , Elsevier. Amsterdam. 10-1016 (2008).
- Sutton, K. L., B'Hymer, C., Caruso, J. A. Ultraviolet absorbance and inductively coupled plasma mass spectrometric detection for capillary electrophoresis - A comparison of detection modes and interface designs. J. Anal. At. Spectrom. 13 (9), 885-891 (1998).
- Todoli, J. -L., Mermet, J. -M. Sample introduction systems for the analysis of liquid microsamples by ICP-AES and ICP-MS. Spectrochim. Acta, Part B. 61 (3), 239-283 (2006).
- Olesik, J. W., Hobbs, S. E. Monodisperse dried microparticulate injector - A new tool for studying fundamental processes in inductively-coupled plasma. Anal. Chem. 66 (20), 3371-3378 (1994).
- Gschwind, S., Hagendorfer, H., Frick, D. A., Günther, D. Mass quantification of nanoparticles by single droplet calibration using inductively coupled plasma mass spectrometry. Anal. Chem. 85 (12), 5875-5883 (2013).
- Garcia, C. C., Murtazin, A., Groh, S., Horvatic, V., Niemax, K. Characterization of single Au and SiO2 nano- and microparticles by ICP-OES using monodisperse droplets of standard solutions for calibration. J. Anal. At. Spectrom. 25 (5), 645-653 (2010).
- Shigeta, K., et al. Sample introduction of single selenized yeast cells (Saccharomyces cerevisiae) by micro droplet generation into an ICP-sector field mass spectrometer for label-free detection of trace elements. J. Anal. At. Spectrom. 28 (5), 637-645 (2013).
- Orlandini v. Niessen, J. O., Schaper, J. N., Petersen, J. H., Bings, N. H. Development and characterization of a thermal inkjet-based aerosol generator for micro-volume sample introduction in analytical atomic spectrometry. J. Anal. At. Spectrom. 26 (9), 1781-1789 (2011).
- Orlandini v. Niessen, J. O., Petersen, J. H., Schaper, J. N., Bings, N. H. Comparison of novel and conventional calibration techniques for the analysis of urine samples using plasma source mass spectrometry combined with a new dual-drop-on-demand aerosol generator. J. Anal. At. Spectrom. 27 (8), 1234-1244 (2012).
- Shigeta, K., et al. Application of a micro-droplet generator for an ICP-sector field mass spectrometer - optimization and analytical characterization. J. Anal. At. Spectrom. 28 (5), 646-656 (2013).
- Teh, S. -Y., Lin, R., Hung, L. -H., Lee, A. P.
- Zheng, B., Tice, J. D., Ismagilov, R. F. Formation of arrayed droplets by soft lithography and two-phase fluid flow, and application in protein crystallization. Adv. Mater. 16 (15), 1365-1368 (2004).
- Theberge, A. B., et al. Microfluidic platform for combinatorial synthesis in picolitre droplets. Lab Chip. 12 (7), 1320-1326 (2012).
- Li, L., et al. Nanoliter microfluidic hybrid method for simultaneous screening and optimization validated with crystallization of membrane proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103 (51), 19243-19248 (2006).
- Zhang, Q., Liu, X., Liu, D., Gai, H. Ultra-small droplet generation via volatile component evaporation. Lab Chip. 14 (8), 1395-1400 (2014).
- Baret, J. C., Beck, Y., Billas-Massobrio, I., Moras, D., Griffiths, A. D. Quantitative cell-based reporter gene assays using droplet-based microfluidics. Chem. Biol. 17 (5), 528-536 (2010).
- Brouzes, E., et al. Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (34), 14195-14200 (2009).
- Pei, J., Li, Q., Lee, M. S., Valaskovic, G. A., Kennedy, R. T. Analysis of samples stored as individual plugs in a capillary by electrospray ionization mass spectrometry. Anal. Chem. 81 (15), 6558-6561 (2009).
- Kelly, R. T., Page, J. S., Marginean, I., Tang, K., Smith, R. D. Dilution-free analysis from picoliter droplets by nano-electrospray ionization mass spectrometry. Angew. Chem., Int. Ed. 48 (37), 6832-6835 (2009).
- Küster, S. K., et al. Interfacing droplet microfluidics with matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry: label-free content analysis of single droplets. Anal. Chem. 85 (3), 1285-1289 (2013).
- Pabst, M., Jefimovs, K., Zenobi, R., Dittrich, P. S. High-Resolution Droplet-Based Fractionation of Nano-LC Separations onto Microarrays for MALDI-MS Analysis. Analytical Chemistry. 86 (10), 4848-4855 (2014).
- Verboket, P. E., Borovinskaya, O., Meyer, N., Günther, D., Dittrich, P. S. A New Microfluidics-Based Droplet Dispenser for ICPMS. Analytical Chemistry. 86 (12), 6012-6018 (2014).
- Ammerman, C. N., You, S. M. Determination of the boiling enhancement mechanism caused by surfactant addition to water. J. Heat Transfer. 118 (2), 429-435 (1996).
- Samel, B., Chowdhury, M. K., Stemme, G. The fabrication of microfluidic structures by means of full-wafer adhesive bonding using a poly(dimethylsiloxane) catalyst. J Micromech Microeng. 17 (8), 1710-1714 (2007).
- Basu, A. S. Droplet morphometry and velocimetry (DMV): a video processing software for time-resolved, label-free tracking of droplet parameters. Lab Chip. 13 (10), 1892-1901 (2013).
- Dziewatkoski, M. P., Daniels, L. B., Olesik, J. W. Time-resolved inductively coupled plasma mass spectrometry measurements with individual, monodisperse drop sample introduction. Anal. Chem. 68 (7), 1101-1109 (1996).
- Abate, A. R., Hung, T., Mary, P., Agresti, J. J., Weitz, D. A. High-throughput injection with microfluidics using picoinjectors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107 (45), 19163-19166 (2010).
- Bremond, N., Thiam, A. R., Bibette, J. Decompressing emulsion droplets favors coalescence. Phys. Rev. Lett. 100 (2), 024501 (2008).
- Niu, X., Gulati, S., Edel, J. B., deMello, A. J. Pillar-induced droplet merging in microfluidic circuits. Lab Chip. 8 (11), 1837-1841 (2008).
- Song, H., Ismagilov, R. F. Millisecond kinetics on a microfluidic chip using nanoliters of reagents. J. Am. Chem. Soc. 125 (47), 14613-14619 (2003).
- Song, H., Chen, D. L., Ismagilov, R. F.
- Lombardi, D., Dittrich, P. S. Droplet microfluidics with magnetic beads: a new tool to investigate drug-protein interactions. Anal. Bioanal. Chem. 399 (1), 347-352 (2011).
- Edgar, J. S., et al. Compartmentalization of chemically separated components into droplets. Angew. Chem., Int. Ed. 48 (15), 2719-2722 (2009).
- Edgar, J. S., et al. Capillary electrophoresis separation in the presence of an immiscible boundary for droplet analysis. Anal. Chem. 78 (19), 6948-6954 (2006).
- Baret, J. C., et al. Fluorescence-activated droplet sorting (FADS): efficient microfluidic cell sorting based on enzymatic activity. Lab Chip. 9 (13), 1850-1858 (2009).
- Agresti, J. J., et al. Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107 (9), 4004-4009 (2010).
