Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Genoom-brede Snapshot van chromatine regelgevers en staten in Published: February 26, 2015 doi: 10.3791/52535
Automatic Translation
1, 1, 1
1Division of Systems Biology, MRC National Institute for Medical Research

Summary

De vraag hoe chromatine toezichthouders en chromatine staten van invloed op het genoom in vivo is de sleutel tot ons begrip van hoe vroeg lot van de cel beslissingen worden genomen in het zich ontwikkelende embryo. ChIP-Seq-de meest populaire benadering van chromatine functies onderzoeken op mondiaal niveau wordt hier geschetst voor Xenopus embryo.

Protocol

OPMERKING: Alle Xenopus werk voldoet volledig aan de Britse Dieren (Scientific Procedures) Act 1986 zoals uitgevoerd door de MRC National Institute for Medical Research.

1. Voorbereidingen

  1. Schatting van het aantal embryo's die nodig zijn voor de chip-experiment (zie bespreking).
  2. Bereid de volgende oplossingen worden bewaard bij kamertemperatuur 500 ml 10x Marc gemodificeerd Ringers (MMR) zonder EDTA, pH 7,5 en in de autoclaaf (1 M NaCl, 20 mM KCI, 20 mM CaCl2, 10 mM MgSO4, 50 mM HEPES pH 7,5) 10 1 ml SDS elutiebuffer (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA, 1% SDS) en 1 ml 5x DNA laadbuffer (0,2% Orange G, 30% glycerol, 60 mM EDTA pH 8,0).
  3. Bereid de volgende oplossingen worden bewaard bij 4 ° C 50 ml HEG buffer (50 mM HEPES-KOH pH 7,5, 1 mM EDTA pH 8,0, 20% glycerol), 500 ml extractiebuffers E1 (50 mM HEPES-KOH pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA. 10% glycerol, 0,5% Igepal CA-630, 0,25% Triton X-100), E2 (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5 mM EGTA) en E3 (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Igepal CA-630, 0,25% Na-deoxycholaat, 0,1% SDS), 500 ml RIPA-buffer (50 mM HEPES-KOH pH 7,5, 500 mM LiCl, 1 mM EDTA , 1% Igepal CA-630, 0,7% Na-deoxycholaat) en 50 ml TEN buffer (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl).
  4. Score en clip een 15 ml conische polystyreen buis aan de 7 ml markering. Gebruik deze tube naar kernextracten ondergaan soniceren bevatten.
  5. Voor post-sequencing analyse, gebruik dan een multicore Unix-achtig computer met minstens 8 GB RAM en 500 GB vrije schijfruimte. Installeer de volgende software lokaal waarvan de meeste worden gebruikt op de opdrachtregel: FastQC, Illumina Casava-1.8 kwaliteit filter, Bowtie 11, SAMtools 12, Homerus 13, MACS2 14, IGV 15,16, Cluster3 17, Java TreeView, BLAST + 18, en b2g4pipe
  6. Bouw een Bowtie index voor het uitlijnen van korte NGS leest de Xenopus genoom. Een voorbeeld is hier te zien voor de X. tropicalis genoom v7.1 (november 2011), die kan worden gedownload als een FASTA bestand (genome.fa) uit de Xenbase ftp server (/ pub / Genomics / JGI). Verplaats de FASTA bestand naar de index subdirectory van Bowtie.
    1. Gebruik de volgende opdrachtregel (hier na de prompt teken>) om xenTro7 index bestanden te genereren:
      > /path/to/bowtie/index/genome.fa Bowtie-build xenTro7
      > Export BOWTIE_INDEXES = / pad / naar / bowtie / index /
  7. Download het gen annotatie bestand (GTF) van de UCSC Genome Browser of de mirror site op het NIMR server voor de meest recente genoom versies (genomes.nimr.mrc.ac.uk) via Extra / Table Browser. Gebruik het genoom FASTA bestand en de GTF bestand naar H aanpassenOMER voor Xenopus (bv X. tropicalis genoom v7.1, - noem xenTro7).
    1. U kunt ook vooraf gebouwde HOMER pakketten voor sommige oudere versies van de Xenopus genoom.
      > LoadGenome.pl -name xenTro7 -org null -fasta /path/to/genome.fa -gtf pad / naar / genes.gtf
  8. Maak een genoom track (.genome-bestand) voor het genoom browser IGV door het uploaden van een geïndexeerde FASTA bestand (genome.fa met genome.fa.fai bestand in dezelfde map) en de annotatie bestand (genes.gtf). Maak een genoom steiger index (genome.fa.fai) voor de Xenopus genoom als volgt:
    > Samtools faidx /path/to/genome.fa
  9. Gebruik BLAST + naar Gene Ontology (GO) termen als volgt overgaan van verschillende model soorten (mens, muis, zebravis, fruitvlieg en gist) op Xenopus genen:
    1. Download alle coderende sequenties (CDS) als een enkele FASTA bestand (cds.fa) van de UCSC Genome Browser via Extra/ Table Browser en updaten BLAST + met de pre-geformatteerde BLAST databank van niet-redundante eiwitten (nr):
      > Update_blastdb.pl nr
    2. Zoeken naar mens (txid9606), muis (txid10090), zebravis (txid7955), fruitvlieg (txid7227) en gist (txid4932) eiwitten uit de NCBI site via de geavanceerde zoekfunctie (http: //www.ncbi.nlm.nih. gov / eiwit / geavanceerd) en stuur de resulterende GI (sequence identifier) ​​lijst (sequence.gi.txt) op de computer.
    3. Toewijzen Xenopus genen om de meest gelijkaardige proteïnen uit de GI lijst door het uitvoeren van BLASTX met een zekere verwachten (E) waarde cutoff (hier 10 -20). Zorg ervoor dat de output formaat is xml (-outfmt 5 uitchecken blastx_results.xml). Maak gebruik van tijdbesparende draden (-num_threads), die correleren met het aantal beschikbare computer kernen.
      > BLASTX -db / pad / naar / nr -gilist /path/to/sequence.gi.txt -query / pad / to / cds.fa -evalue 1e-20
      -outfmt 5 uitchecken /path/to/blastx_results.xml -num_threads [# discussies]
    4. Open het b2gPipe.properties bestand van de map b2g4pipe met een tekstverwerker en bijwerken van de database-eigenschappen te Dbacces.dbname = b2go_sep13 en Dbacces.dbhost = publicdb.blast2go.com. Ren b2g4pipe uit de installatiemap.
      > Java Xmx1000m -cp *: ext / *: es.blast2go.prog.B2GAnnotPipe -in /path/to/blastx_results.xml
      uitchecken resultaten / xenTro7 -prop b2gPipe.properties -v -annot
      NB: Dit programma extracten GO termen voor elke BLAST geraakt en wijst ze toe aan overeenkomstige Xenopus genen (xenTro7.annot). De meest actuele database-instellingen kunt u vinden onder Extra / Algemene instellingen / DataAccess instellingen van de applicatie Blast2GO Java Web Start (zie 9.11.1).

2. Chromatin Cross-linking

  1. Bevruchten Xenopus eieren, de-gelei en cultuur embryos volgens standaardprotocollen 20.
  2. Breng de dejellied embryo's (maximaal 2.500 X. laevis of 10.000 X. tropicalis) bij het ​​ontwikkelingsstadium van belang zijn voor een 8 ml glazen monster flesje met dop en was ze een keer kort met 0.01x MMR.
  3. Bevestig het embryo met 1% formaldehyde in 0.01x MMR (bijv voeg 225 ul van 36,5-38% formaldehyde tot 8 ml 0.01x MMR) gedurende 15 tot 40 min bij kamertemperatuur (zie bespreking voor de fixatie en het aantal embryo vereist per chip experiment).
    OPMERKING: Formaldehyde is corrosief en zeer giftig. Het is gevaarlijk in geval van contact met ogen en huid, indigestie, en inhalatie. Gebruik de zuurkast bij het toevoegen van formaldehyde aan de flacon.
  4. Stop de fixatie door kort wassen van de embryo's drie keer met koude 0.01x MMR. Laat je niet embry os maken contact met de vloeistof oppervlak, omdat de oppervlaktespanning zorgt ervoor dat ze scheuren.
  5. Aliquot de embryo's in 2 ml microcentrifugebuisjes op ijsmet een maximum van 250 embryo's per buis, die een volume van ongeveer 250 ul (X. tropicalis) of 600 pl (X. laevis) voor het uitkomen bezetten.
  6. Pipet weg zoveel 0.01x MMR mogelijk. Sla de volgende stap over als u onmiddellijk verder met deel 3.
  7. Equilibreer embryo in 250 ui koude HEG buffer. Nadat de embryo's hebben zich op de bodem van de buis te verwijderen zoveel vloeistof mogelijk en snap-vries in vloeibare stikstof. Bewaren bij -80 ° C.

3. Chromatin Extraction

Opmerking: De volgende extractie verknoopt chromatine van Xenopus embryo meest efficiënt met fixatietijden aangegeven in stap 2.3 en 50 tot 80 X. tropicalis of 25-40 X. laevis embryo's per ml extractiebuffer E1, E2 en E3. Elke extractiestap wordt herhaald, zodat dubbele berekende hoeveelheid buffer nodig. Voor opschaling, gebruik van meerdere 2 ml microcentrifuge buizen of 50 ml centrifugebuizen. Houd monsters en buffers op het ijs tijdens de chromatine extractie.

  1. Supplement voldoende hoeveelheden buffers E1, E2 en E3 met 1 mM DTT en proteaseremmers tabletten. Als uitvoeren ChIP met een fosfo-specifiek antilichaam, verdere toeslag buffers met 5 mM NaF en 2 mM Na 3 VO 4.
  2. Homogeniseren vaste embryo's met E1 op en neer te pipetteren. Centrifuge homogenaten in een gekoelde centrifuge (4 ° C) bij 1000 xg gedurende 2 minuten (of 5 min bij toepassing van 50 ml buizen). Zuig het supernatant en eventuele lipiden aan de muur.
  3. Resuspendeer pellets E1. Houd monsters op ijs gedurende 10 minuten. Centrifuge en gooi bovenstaande vloeistoffen zoals in stap 3.2.
  4. Resuspendeer pellets E2. Centrifuge en gooi bovenstaande vloeistoffen zoals in stap 3.2.
  5. Herhaal stap 3.4, maar houd monsters op ijs gedurende 10 minuten vóór het centrifugeren.
  6. Resuspendeer pellets in E3. Houd monsters op ijs gedurende ten minste 10 minuten. Centrifuge en gooi supernatants zoals in stap 3.2.
    Opmerking: In dit stadium moet de resuspensions vrij transparant worden. De anionische detergentia E3 extract verknoopt kernen door rendering meeste resterende dooier bloedplaatjes oplosbaar.
  7. Resuspendeer en pool pellets verknoopt kernen (gewoonlijk gekleurde bruin uit het onoplosbaar pigmentkorrels) in een totaal volume van 1 ml E3. Verdun het monster met E3 2 of 3 ml indien blijkt zeer viskeus en moeilijk te pipetteren. Houd op ijs of bij 4 ° C om met stap 4 op dezelfde of volgende dag. Snap-bevriezen in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 ° C voor later gebruik.

4. Chromatin Fragmentatie

OPMERKING: Sonicatie wordt zowel gebruikt om oplosbaar te maken en om cross-linked chromatine scheren. Hier zijn parameters om de Misonix Sonicator 3000 uitgerust met een 1/16 inch taps microtip en geluiddempende kap draaien. Bij gebruik van andere sonicators, volgt de aanbevelingen van de fabrikant voor afschuivingverknoopt chromatine of gebruik 6-12 W 4 tot 8 minuten in totaal.

  1. Breng de nucleaire monster uit stap 3.7 in een op maat gemaakte buis sonificatie (stap 1.4). Houd het gekoeld tijdens ultrasoonapparaat monster door het hebben van de buis bevestigd aan een 800 ml plastic beker gevuld met ijs water via een korte thermometer klem.
  2. Plaats het bekerglas op een laboratorium aansluiting. Stel de krik zodat de ultrasoonapparaat micropunt wordt ondergedompeld in het monster ongeveer tweederde van het volume diepte en gecentreerd zonder de buiswand raken.
  3. Ultrasone trillingen het monster gedurende 7 minuten in totaal, onderbroken elke 30 sec met 1 min pauzes. Stel kracht tot 1,0. Start de geluidsgolven en onmiddellijk verhogen van de energie-instelling (normaal 2-4) om een ​​lezing van 9 tot 12 W. als het monster begint te schuimen onmiddellijk Pauze bereiken. Herpositioneren buis en opnieuw opstarten wanneer het schuim volledig is verdwenen.
  4. Breng de geschoren chromatine in de pre-gekoelde 1,5 ml microcentrifugebuizen en draaien op volle snelheid (> 15,000 x g) gedurende 5 min bij 4 ° C.
  5. Breng de bovenstaande pre-gekoelde 1,5 ml microcentrifugebuisjes. Verzamel 50 pl van het supernatant (idealiter met de chromatine van ongeveer 400.000 of meer kernen) de mate van chromatine fragmentatie (punt 5) zichtbaar. Gebruik voor chip (hoofdstuk 6) de rest van de bovenstaande vloeistof.
  6. WINKEL monsters bij 4 ° C gedurende maximaal één dag. Snap-vries monsters aliquots (één per ChIP experiment) in vloeibare stikstof voor langdurige opslag bij -80 ° C.

5. Imaging Chromatin Fragmentatie

  1. Voeg 50 ui SDS elutiebuffer, 4 pl 5 M NaCl en 1 pl proteinase K (20 ug / ul) 50 pl van het supernatant van stap 4.6.
  2. Incubeer gedurende 6 tot 15 uur (O / N) in een hybridisatie oven op 65 ° C.
  3. Zuiver DNA met een commercieel PCR zuivering kit. Indien nodig 3 M natriumacetaat (pH 5,2) om de pH zoals aanbevolen door de fabrikant. Elueren deDNA tweemaal met 11 ui elutiebuffer (10 mM Tris-HCl pH 8,5).
  4. Voeg 0,4 gl RNase A (20 ug / ul) en 5 pl 5x DNA laadbuffer voordat u het gehele monster naast een 100 bp en een 1 kb DNA ladder op een 1,4% agarosegel door elektroforese. Voor een optimaal resultaat, vlek gel met een veilige nucleïnezuur kleuroplossing na elektroforese.

6. Chromatine Immunoprecipitatie

OPMERKING: In dit gedeelte gebruiken low-retentie 1,5 ml microcentrifugebuizen en ten minste 1 ml aangegeven buffer per buis aan magnetische beads wassen gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Alvorens de buffer van de bolletjes, laat de buizen in de magnetische rek voor 20 tot 30 seconden per tijd of totdat de oplossing helder is.

  1. Transfer 10 tot 30 pi van het supernatant (afgeschoven chromatine) vanaf stap 4.6 een nieuwe buis later als input sample, wat overeenkomt met ongeveer 1% van de totale chromatine gebruikt voor ChIP. Bewaren bij 4° C tot chip monsters zijn klaar voor het omkeren van cross-links.
  2. Breng de rest chromatine naar een nieuwe buis. Voor ChIP-qPCR experimenten vereisen een antilichaam controle, te distribueren gelijke volumes van chromatine tot twee buizen.
  3. Voeg de ChIP-grade antilichaam (of het overeenkomstige antilichaam controle) naar chromatine. Als een indicatie, gebruik maken van ongeveer 1 ug van antilichaam per een miljoen cellen die het epitoop van belang.
    1. Nauwkeuriger schatting van de hoeveelheid antilichaam nodig per chip experiment, rijden op de zelfde chip met verschillende hoeveelheden antilichaam (bv 0,25 ug, 1 pg en 2,5 pg) en vergelijk het rendement op de negatieve en positieve controle loci van Chip-qPCR (zie paragraaf 10). Als een antilichaam controle gebruikt normaal serum van hetzelfde isotype en gastheerdier soorten als het antilichaam.
  4. Incubeer op een rotator (10 rpm) O / N bij 4 ° C.
  5. Was voldoende hoeveelheid antilichaam-compatibele magnetische korrels eenmaal met E3 gedurende 5 min eent 4 ° C. Check specificatie van de fabrikant voor het antilichaam bindingscapaciteit van de korrels (meestal 5 tot 20 ui korrels binden 1 ug IgG-antilichaam).
  6. Voeg gewassen bolletjes aan het antilichaam gepreïncubeerd chromatine. Verder incuberen op een rotator (10 opm) gedurende 4 uur.
  7. Was kralen vier keer (CHIP-qPCR) of tien keer (ChIP-Seq) met pre-gekoelde RIPA buffer, en dan een keer met pre-gekoelde TEN buffer.
  8. Alleen het uitvoeren van deze stap als het uitvoeren van een chip-Seq experiment.
    1. Resuspendeer gewassen kralen in 50 ul van TEN buffer per buis. Pool alle kralen uit een enkele chip experiment door ze op een nieuwe buis. Met de magnetische rek en gekoelde (4 ° C) centrifugeren bij 1000 xg tot korrels te verzamelen op de bodem van de buis. Gooi zoveel vloeistof mogelijk zonder verstoring van de pellet van kralen.
  9. Strip ChIP materiaal van de korrels door resuspenderen van de korrels in 50 tot 100 ul SDS elutiebuffer en vortexing ze continu met een thermomixer (1000 rpm) gedurende 15 minuten bij 65 ° C. Daarna centrifuge op volle snelheid (> 15.000 xg) gedurende 30 sec. Breng de bovenstaande (CHIP eluaat) naar een nieuwe buis.
  10. Herhaal de laatste stap en combineer de chip eluaten.

7. Chromatin Reverse Cross-linking en DNA Purification

  1. Voeg genoeg SDS elutiebuffer het ingangsmonster (stap 6.1) om het volume van de chip monster, die 100 tot 200 gl (stap 6.10) te bereiken. Supplement zowel chip en inbreng monsters met 1/20 volume van 5 M NaCl. Incubeer de monsters gedurende 6 tot 15 uur (O / N) bij 65 ° C in een hybridisatie oven.
  2. Voeg 1 volume TE buffer en RNase A bij 200 ug / ml. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C.
  3. Voeg proteïnase K bij 200 ug / ml. Incubeer gedurende 2-4 uur bij 55 ° C.
  4. Zuiver DNA met fenol: chloroform: isoamylalcohol extractie gevolgd door ethanol precipitatie zoals eerder geschetst 9. Voor ChIP-Seq, voeg 32ui elutiebuffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,5) om de DNA pellet opgelost. Laat monsters op ijs gedurende 30 minuten zodat het DNA volledig is opgelost.
    OPMERKING: Commercieel PCR zuivering kit lagere DNA herstel, maar zijn handiger, en kan worden gebruikt voor ChIP-qPCR monsters.
  5. Voor ChIP-Seq, bepalen de concentratie van 1 pl van de chip en input DNA met behulp van-fluorometrie gebaseerde methoden. Volg de instructies van de fabrikant en controleer of de concentratie van DNA in betrouwbare detectiebereik van de fluorometer valt.

8. ChIP-Seq Bibliotheek Construction and Validation

OPMERKING: Huidige werkwijzen voor DNA- bereiding bibliotheek laten constructie van hoge complexiteit bibliotheken NGS 1-2 ng. Ten koste nogal ingewikkeld kunnen bibliotheken worden gemaakt van slechts 50 pg DNA (zie Tabel van specifieke materialen / Apparatuur). Gebruik dezelfde hoeveelheid DNA voor zowel chip en input-bibliotheek. Kort make geïndexeerd (gepaarde-end) ChIP-Seq bibliotheken, chip en inbreng DNA moeten-end hersteld zijn, geligeerd aan speciale adapters (zie Tabel van specifieke materialen / apparatuur), op grootte geselecteerd en PCR versterkt.

  1. Volg de richtlijnen van de fabrikant om ChIP-Seq bibliotheken te maken. Zie de bespreking voor verdere aanbevelingen.
  2. Elueer elke bibliotheek in 12 ui elutiebuffer en het gehalte aan 1 ui van elke chip en input-bibliotheek met behulp van een fluorometer. Verwacht concentraties van 5 tot 25 ng / ul. Denk aan het verminderen van het aantal PCR-cycli (minder dan 18 cycli) als concentraties hoger dan 25 ng / ul.
    OPMERKING: Nauwkeurige kwantificering is essentieel voor de optimale NGS resultaten te bereiken. Bibliotheken met concentraties van slechts 1 ng / gl na 18 PCR cycli kunnen worden gesequenced, maar vaak zijn minder complex.
  3. Gebruik 1 ui van de bibliotheek naar het fragment grootteverdeling te bepalen en te controleren op eventuele adapter dimeer vervuiling (band rond 120 bp) door c-hip gebaseerde capillaire elektroforese. Herhaal de vaste fase omkeerbare immobilisatie zuivering met parels tot sample verhouding van 1: 1 (in plaats van 1,6: 1) indien de bibliotheek bevat adapter dimeren.
  4. Voeren qPCR op gevalideerde positieve en negatieve controle loci (zie paragraaf 10) om te controleren of gelijkaardige DNA verrijking trends voor en na de bibliotheek voorbereiding worden waargenomen. Submit kwaliteitscontrole goedgekeurd bibliotheken voor sequencing.

9. Post-sequencing Analyse en Data Visualization

OPMERKING: Tegenwoordig NGS wordt vaak uitgevoerd door in-house of commerciële sequencing faciliteiten (zie bespreking voor sommige NGS richtlijnen) uitgevoerd. De standaard uitvoer zijn enkelvoudige of meervoudige gzip gecomprimeerde FASTQ bestanden (* .fastq.gz) het opslaan van miljoenen sequencing leest. Normaal gesproken, multiplex leest zijn al gescheiden op basis van hun index en elke lees- bevat een sequentie identifier en een kwaliteitscontrole score (Phred + 33 voor Illumina 1.8+) voor elke base oproep. Deze aanpak is hier slechts een van de vele manieren om NGS gegevens te analyseren. De lezer wordt aangemoedigd om te controleren of een van de volgende opdracht regels vereisen veranderingen als dit veld is snel voortschrijdende en updates worden regelmatig voorkomende.

  1. Aaneenschakelen-gzip gecomprimeerde FASTQ bestanden en controleren de kwaliteit van de sequencing data met behulp van de FastQC script. Voer deze en de meeste van de volgende opdrachten voor zowel de chip en inbreng sequencing data (Voorbeelden getoond ChIP) vanaf de terminal:
    > Cat /path/to/*.fastq.gz> ChIP.fastq.gz
    > Fastqc ChIP.fastq.gz
    OPMERKING: Ruwe data uit de succesvolle sequencing van een hoge complexiteit ChIP-Seq bibliotheek zouden de meeste tests moeten doorstaan. Mislukkingen zijn voornamelijk afkomstig uit arme sequencing runs en experimentele artefacten zoals bevooroordeeld PCR-amplificatie of besmetting adapter. Een zekere mate van duplicatie (redundantie) wordt verwacht als overbodig leest kan bonafide DNA verrijking vertegenwoordigen 21.
  2. Pre-proces sequencing data om de verontreiniging adapter te verwijderen (homerTools trimmen -3 <adaptorsequentie>) waardoor een mismatch (-mis 1). Gebruik de eerste 20 basen van het (geïndexeerd) adapter (5 'naar 3') proximaal aan het DNA-fragment van belang bij ligatie (getoond adapter in de tabel van specifieke materialen / Apparatuur vermeld).
    > Gzip -cd ChIP.fastq.gz | fastq_illumina_filter -vN> ChIP.fastq
    > HomerTools trimmen -3 GATCGGAAGAGCACACGTCT -mis 1 -min 36 ChIP.fastq
    LET OP: Het verwijderen van gefilterde leest (N) is alleen nodig standaard in FASTQ bestanden gegenereerd door Illumina 1.8. Laat de fastq_illumina_filter commando (dwz. '| Fastq_illumina_filter -vN')Als een oudere versie dan 1,8 gegenereerd de volgorde identifier.
  3. Lijn voorbewerkte leest met de referentie genoom (xenTro7) met behulp van Bowtie. Alleen blijf unieke kaart gebracht leest (-m 1) met de standaardinstellingen, dwz maximaal twee mismatches in de eerste 28 bases en een totaal Phred + 33 kwaliteit score van alle mismatches per lezen van de maximale 70. Rapport uitlijning in SAM-formaat (-S) . Toename van het aantal megabytes per thread (--chunkmbs) als de brok geheugen is uitgeput:
    > Bowtie -m 1 -S -p [# discussies] --chunkmbs [bijvoorbeeld 200] xenTro7 ChIP.fastq.trimmed> ChIP.sam
    OPMERKING: Bowtie verwacht Phred + 33 kwaliteitsscores standaard. Onder meer de optie - phred64-quals als het FASTQ bestand is gegenereerd met Phred + 64 kwaliteitsscores door Illumina ouder dan 1.8.
  4. Gebruik twee HOMER commando's om de uitlijning (SAM) bestand om te zetten in een bobo-bestand (.bw):
    > MakeTagDirectory chip / -Single -tbp 1 ChIP.sam
    > MakeUCSCfile chip /    -bigWig / pad / naar / genome.fa.fai -fsize 1e20 -norm 1E7 -o ChIP.bw
    OPMERKING: De transformatie vereist het schavot index (genome.fa.fai) van de referentie-genoom (stap 1.8). Hier het profiel is beperkt tot één tag per basenpaar (-tbp 1) en genormaliseerd naar 10 miljoen leest (-norm 1E7). bobo is een van de favoriete formaat om dynamisch te visualiseren chromatine-profielen met een genoom browser zoals IGV (stap 9.12).
  5. Bepaal de verdeling tags (-d ChIP /) en genomisch oriëntatiepunten (bijvoorbeeld +/- 10 kb met 25 bp bakken, -SI Ze 20000 -hist 25), zoals de transcriptie start (tss, hier getoonde voorbeeld) en terminatie ( tts) sites. Voer het HOMER perl-script annotatePeaks.pl met Xenopus annotaties xenTro7 (stap 1.7):
    > AnnotatePeaks.pl tss xenTro7 -grootte 20000 -hist 25 -d chip /> ChIP_tagDensity.tss
  6. Vind significante pieken van DNA verrijking tussen chip(-t ChIP.sam) en Input (-c Input.sam) in de X. tropicalis genoom behulp MACS2 met een 1% FDR cutoff (-q 0,01) en DNA-fragmenten (na sonicatie) van 200 bp (--bw = 200) voor de modelbouw. Voeg de vlag --broad om dit command line als verwacht een brede spreiding van het chromatine kenmerk van belang, zoals histon merken of RNA-polymerase.
    > Macs2 callpeak -t ChIP.sam -c Input.sam -f SAM -n chip -g 1.4376e9 -q 0,01 --bw = 200
    OPMERKING: Het effectieve grootte van de X. tropicalis genoom assemblage v7.1 is ongeveer 1437600000 bp (-g 1.4376e9). MACS2 genereert een BED-bestand (ChIP_peaks.bed) beroep doet pieken met hun genomische locaties.
  7. Vergelijk verschillende chromatine-profielen in de vorm van een geclusterde heatmap:
    1. Maak een tag distributie matrix van tag dichtheid directories van belang (-d chip / other_ChIP /) op MACS2 pieken (bv +/- 1 kb met 25 bp bakken, -grootte 2000 -hist 25 -ghist):
      > AnnotatePeaks.pl ChIP_peaks.bed xenTro7 -grootte 2000 -hist 25 -ghist -d chip / other_ChIP /> ChIP.matrix
    2. Gebruik de grafische gebruikersinterface van Cluster3 om ChIP.matrix bestand te uploaden en hiërarchisch clusteren deze tag dichtheden op basis van de minimale Euclidische afstand tot het dichtstbijzijnde zwaartepunt. Open het gegenereerde CTD bestand in Java TreeView aan de clustering te visualiseren.
  8. Vind nieuwe en voorheen bekend bindingsmotieven, die zijn verrijkt op de piek toppen +/- 100 bp (-grootte 200). Gebruik annotatePeaks.pl naar motief gebeurtenissen kaart te brengen en motief dichtheden plotten:
    > FindMotifsGenome.pl ChIP_peaks.bed xenTro7 ChIP_motifs / -formaat 200 -p [# discussies]
    > AnnotatePeaks.pl ChIP_peaks.bed xenTro7 -m motif1.motif> ChIP_peaks.motif1
    > AnnotatePeaks.pl ChIP_peaks.bed xenTro7 -m motif1.motif -grootte 800 -hist 25> motif1.density
    OPMERKING: De findMotifsGenome.pl script Infers de verrijking van de vergelijking met willekeurig geselecteerde gen-centric achtergrond sequenties. De meest verrijkte roman motief wordt opgeslagen onder motif1.motif in het formaat van een positie gewicht matrix. De lezer wordt aangemoedigd om deze resultaten met andere de novo motief ontdekking methoden zoals cisFinder 22 en MEME 23 onderbouwen.
  9. Annoteren pieken door het berekenen van hun afstand tot de dichtstbijzijnde gen en door het bepalen van hun genormaliseerde read telling binnen 400 bp ramen (-grootte 400):
    > AnnotatePeaks.pl ChIP_peaks.bed xenTro7 -grootte 400 -d chip / Input /> ChIP_peaks.genes
  10. Vat de uitgang met behulp van de volgende awk commando naar de lijst van het aantal (N), de locatie en de genormaliseerde gelezen telling van individuele (R) en alle (LR) pieken per dichtstbijzijnde (doel) gen.
    > Awk 'BEGIN {FS =' t '} $ 7> = -5000 && $ 7 <= 1000
    {N- [$ 8] + = 1; R [$ 8] + = $ 9; LR [$ 8] = LR [$ 8] ', &    # 39; $ 7 '(' $ 9 ')'} END {voor (i in N)
    {Afdrukken i ' t' N [i] ' t' r [i] ' t' substr (LR [i], 2)}} 'ChIP_peaks.genes> ChIP_peaks.summary
    OPMERKING: Het aantal na $ verwijst naar het nummer van de kolom, die dienen modificeren om de ChIP_peaks.genes bestand gemaakt in de vorige stap past. Dit script voorbeeld filtert pieken dan 5 kb upstream en 1 kb stroomafwaarts van de TSS. $ 7, $ 8 en $ 9 hebben betrekking op de afstand tot de TSS, het gen-identificatie en de genormaliseerde gelezen telling per piek, respectievelijk.
  11. Voer de analyse van verrijkte GO termen verantwoordelijk doelgenen als volgt:
    1. Start de grafische gebruikersinterface van Blast2GO vanaf de commandoregel via Java Web Start (javaws) 19.
      > Javaws http://blast2go.com/webstart/blast2go1000.jnlp
    2. Volg de instructies van de ontwikkelaars om de annotatie te uploadenbestand voor Xenopus genen (xenTro7.annot) zoals gegenereerd in 1.9.4 en een plat bestand van geïdentificeerde target genen. Zorg ervoor dat hetzelfde gen identifiers worden gebruikt in beide bestanden.
  12. Visualiseer chromatine profielen door het toevoegen van bobo (ChIP.bw, Input.bw) en BED-bestanden (ChIP_peaks.bed) in IGV als tracks. Aanvulling van gegevens met RNA-Seq tracks indien beschikbaar voor hetzelfde stadium van ontwikkeling. Resultaten als een sessie op te slaan.
  13. Gebruik het programmeren platforms R (www.r-project.org) of MATLAB verder te manipuleren en visualiseren van gegevens zoals hierboven gegenereerd. Als alternatief plot kleine datasets met Excel.

10. ChIP-qPCR for Testing chip en bevestigen ChIP-Seq

  1. Gebruik de on-line platform Primer3 om primers omliggende ongeveer 100 bp DNA-ontwerpen bij 60 ° C (T m) voor zowel positief (piek-specifiek) en negatieve controle loci. Bevestig primer specificiteit met behulp van de in silico
  2. Een 8-punts standaardcurve drie-voudige verdunningen beginnend vanaf ongeveer 1% input of gebruik de 2 - ΔΔC (T) 8,24 methode voor de kwantificering van DNA verrijking.
  3. Voeren real-time PCR in technische drievoud voor alle monsters, dat wil zeggen, spaander, controle en, indien nodig, standaard curve monsters.
  4. Plot DNA verrijking als percentage van de input DNA of als een verhouding van ChIP versus controle monster bij zowel positieve als negatieve controle loci.

Representative Results

Gelijkwaardige resultaten die hier gepresenteerd worden verwacht als het protocol goed wordt uitgevoerd en het antilichaam in gebruik is van de chip-grade kwaliteit (zie bespreking). Dit protocol maakt de extractie van kernen van formaldehyde vaste Xenopus embryo's en het efficiënt scheren van chromatine door sonicatie (Figuur 1A-C). Gefragmenteerde chromatine toont een asymmetrische verdeling van DNA-fragmenten van doorgaans 100 tot 1000 bp en een piek tussen 300 en 500 bp (figuur 1C). Een minimale 50 pg immunologisch DNA moet een geïndexeerde gepaarde-end ChIP-Seq bibliotheek met even grote DNA inserts (Figuur 2A) succesvol maken. De bibliotheek zou grotendeels vrij van adapter dimeren, die kan worden gezien op het elektroferogram ongeveer 120 bp.

Bij sequentiebepaling-door-synthese, voorbewerkte leest zijn toegewezen aan het genoom (Figuur 2B, C). In een geslaagd experiment (figuur 2C) 25. Uitbreiding van de uitlijning in het lezen van richting om een ​​gemiddelde fragment grootte produceert nauwkeurige profielen voor enkele chromatine functies zoals transcriptiefactorbindingsplaatsen evenementen. Deze DNA bezettingsgraad verschijnen pieken bij gevisualiseerd IGV of andere compatibele genoom browser. Extra bellers zoals MACS worden gebruikt om de locatie van deze pieken (figuur 3A) te bepalen. Zo tienduizenden bindingsplaatsen zijn bepaald X. tropicalis genoom voor T-box transcriptiefactoren zoals Vegt 26. ChIP-qPCR ervamenten moeten de plaatselijke verrijking gevonden door ChIP-Seq (Figuur 3B) te bevestigen.

ChIP-Seq experimenten maken het mogelijk het verkennen van genoom-brede kenmerken van chromatine functies. Bijvoorbeeld, het berekenen van de lees verdeling over genomische elementen zoals de transcriptie start en beëindiging sites kunnen elke ruimtelijke Bindvoorkeuren rond genen (Figuur 3C) te markeren. Evenzo wordt een heatmap van gelezen distributies op de piek locaties gebruikt om verschillende chromatine eigenschappen te vergelijken op een genoom-brede schaal (Figuur 3D). Bepaalde transcriptiefactoren binden DNA-sequentie-specifiek. De novo motief analyse van genomisch DNA onderliggende pieken dergelijke informatie, waaronder co verrijkte motieven potentiële co-factoren (figuur 3E) halen. De grote meerderheid van de target genen tonen DNA bezetting op een lagere plaats van hoger niveau (Figuur 3F). Dit schaalvrije functie lijkt vrij gebruikelijk bij tr te zijnanscription factoren en suggereert dat slechts een kleine fractie van target genen die rechtstreeks worden gereguleerd met biologische relevantie 27,28. De analyse van verrijkte GO termen of andere kenmerken, zoals de differentiële expressie van doelgenen kan verder inzicht openbaren in de biologische functie van de functie chromatine in Xenopus embryo (Figuur 3G).

Figuur 1
Figuur 1. Chromatine immunoprecipitatie procedure Xenopus embryo. (A) Embryo's worden met formaldehyde gefixeerd op het ontwikkelingsstadium van belang covalent te binden (verknopen) alle eiwitten geassocieerd met genomisch DNA. Bij nucleaire extractie (B), wordt verknoopt chromatine gefragmenteerd om een beperking van genomische DNA-bindende of chromatine modificatie locaties door het minimaliseren van de flankerende DNA sequentie (C). Vervolgens worden de chromatine fragmenten immunologisch met ChIP-grade antilichaam aan die waarin het epitoop van belang (D) bieden. De co-immunogeprecipiteerde DNA wordt afgestroopt het eiwit en gezuiverd (E) voor het maken van de chip fragment bibliotheek voor NGS (figuur 2). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2. ChIP-Seq bibliotheek voorbereiding, sequencing-door-synthese, in kaart brengen en de piek roeping. (A) Het elektroferogram toont een goede ChIP-Seq bibliotheek met DNA templates van 250-450 bp. Deze sjablonen met zich meebrengen het DNA-insert van belang geflankeerd door de universele (58 bp) en de geïndexeerde (63 bp) adapter. (B) (C) alleen lezen die kaart uniek het Xenopus genoom gehouden. Aangezien alle fragmenten de sequentie van het 5'-uiteinde, het in kaart brengen van ChIP leest leidt strengs specifieke pieken die het chromatine eigenschap van belang flankeren. Daarbij piek bellers detecteren de verrijking die afkomstig is van immunoprecipitatie en verlengen de leest tot een gemiddelde fragment lengte aan chromatine functies nauwkeurig te lokaliseren. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

"Figuur Figuur 3. Een voorbeeld van post-sequentie analyse en visualisatie van gegevens via de zygote T-box transcriptiefactor Vegt (zVegT). Gelezen hier getoonde tellingen genormaliseerd tot 10 miljoen unieke mat en niet-redundante leest. (A) Fragment van het genoom-brede profiel van zVegT verbindend in X. tropicalis gastrulastadium embryo's (fase 11-12,5 na Nieuwkoop en Faber 29). Elke piek, een stapel-up van verlengd leest, vertegenwoordigt één bindingsplaats. Deze pieken worden genoemd MACS2 met een valse ontdekking rate (FDR) van minder dan 1%. Elke MESP gen toont zeer proximale en upstream zVegT bindend, maar slechts mespa en mespb worden uitgedrukt door die fase (RNA-Seq data 30). (B) DNA bezettingsgraad van zVegT zoals bepaald door ChIP-qPCR op verschillende loci (met inbegrip van een niet -gebonden regio 0,5 kb stroomopwaarts van β-actine) confirm de specifieke verrijking gevonden door ChIP-Seq. Vergelijk resultaten voor mespa met piek genoemd (rode balk) in (A). De DNA bezettingsgraad wordt gevisualiseerd als een percentage van input voor zowel de chip met de Vegt antilichaam (konijn polyklonaal IgG isotype) en de chip met het antilichaam controle (normaal konijnenserum IgG). Foutenbalken geven de standaardafwijking van twee biologische herhalingen. (C) Metagene analyse blijkt preferentiële zVegT binding (markeringen weggegooid dan 25 bp) aan de promotor ten opzichte van een andere genomische regio heen en in gen organen. (D) Temperatuurkaart toont k-gemiddelde geclusterd (k = 5) DNA bezettingsgraad (labels binned meer dan 25 bp) van zVegT en Smad2 / Smad3 (CHIP-Seq data 31) ten opzichte van alle zVegT-gebonden regio's op gastrulastadium. De heatmap is inloggen 2 gebaseerd en gecentreerd op 5 labels per bp. (E) De novo motief analyse ontdekt de canonieke T-doos transcriptiefactorbindingsplaatsen motief in 38% van zVegT-gebonden regio's als de onderliggende motief score is genormaliseerd naar een 5% ontdekking tarief op de achtergrond sequenties. De kaart toont de hoogste dichtheid verrijking voor de T-box-motief in het midden van zVegT bindingsplaatsen, terwijl de canonieke Smad2 / Smad3 bindende motief nauwelijks verrijkt. (F) histogram toont de DNA bezettingsgraad van zVegT die zijn berekend voor elk doelwitgen van alle pieken (+/- 200 bp) tussen 5 kb upstream [-]. en 1 kb stroomafwaarts [+] van overeenkomstige transcriptie startplaatsen (G) Top 300 genen met hoogste DNA bezettingsgraad binnen -5 kb en 1 kb zijn verrijkt biologische processen van de vroege embryonale ontwikkeling. Deze GO termen zijn in lijn met de vermeende functie van zVegT. De FDR is gebaseerd op een tweezijdige Fisher's exact test en gecorrigeerd voor meerdere testen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Discussion

Ons protocol beschrijft hoe te maken en genoom-brede chromatine profielen van Xenopus embryo's te analyseren. Het omvat elke stap van het verknopen van eiwitten aan endogene loci in vivo te verwerken miljoenen leest vertegenwoordigen verrijkte genomische locaties in silico. Aangezien steeds meer genoom tocht beschikbaar zijn, moet dit protocol van toepassing is op andere model en niet-model organismen zijn. De belangrijkste experimentele sectie, die dit protocol onderscheidt van eerdere werk 8,31,33,34, is het post-fixatie procedure om verknoopte kernen te halen. Het vergemakkelijkt efficiënte chromatine oplosbaar en het scheren en eenvoudig opschalen. Samen met een verbeterde efficiëntie van de bibliotheek voorbereiding dit protocol maakt de bouw van high-complexiteit ChIP-Seq bibliotheken van anderhalf tot twee miljoen cellen die de chromatine-geassocieerde epitoop van belang. Voor ChIP-qPCR experimenten, een paar tienduizend van deze cellen zijn normaal gesproken genoegom te controleren op DNA verrijking bij misschien wel zes verschillende genomische loci. Deze aantallen zijn conservatieve schattingen, maar kan variëren afhankelijk van eiwit expressie niveau, de kwaliteit antilichaam, verknoping efficiëntie en epitoop toegankelijkheid. Als een gids, een enkele Xenopus embryo bevat ongeveer 4.000 cellen in het midden van de blastula stadium (8.5 na Nieuwkoop en Faber 29), 40.000 cellen in de late gastrulastadium (12) en 100.000 cellen op de vroege tailbud stadium (20).

De precieze fixatie tijd voor een efficiënte immunoprecipitaties moet empirisch worden bepaald door ChIP-qPCR (paragraaf 10). In het algemeen langer fixatietijden vereist als het experiment omvat X. laevis embryo's, vroege ontwikkelingsstadia, en zwakke (of indirect) DNA-bindende eigenschappen. Het is echter niet aan te raden vaststelling Xenopus embryo's langer dan 40 minuten, of de verwerking van meer embryo's dan aangegeven (hoofdstuk 3), chromatine scheren minder efficiënt. Het is belangrijk nietaan een glycine gebruiken na fixatie als deze gemeenschappelijke stap voor het blussen van formaldehyde kan nucleaire extractie te maken uit dooier-rijke embryo's erg moeilijk. Momenteel is de reden hiervoor niet bekend. Het is denkbaar dat de formaldehyde-glycine adduct verder reageert met N-eindstandige aminogroepen of arginine residuen 35.

Het antilichaam sleutel tot een ChIP experiment en voldoende controles moeten worden uitgevoerd om de specificiteit tonen voor het epitoop van belang (zie richtsnoeren Landt et al. 36). Indien geen ChIP-grade antilichaam beschikbaar is, kan de invoering van overeenkomstige epitoop-gemerkte fusie-eiwitten een legitiem alternatief als deze eiwitten kunnen innemen endogene bindingsplaatsen 37. In dit geval, niet-geïnjecteerde embryo's best te gebruiken als een negatieve controle in plaats van een chip met niet-specifiek serum. Deze strategie kan ook worden toegepast indien het eiwit van interesse tot expressie wordt gebracht op lage niveaus waardoor het slechte terugwinning van enriChed DNA.

Voor het maken ChIP-Seq bibliotheken, vanwege de lage hoeveelheid DNA gebruikt wordt aanbevolen om te kiezen voor procedures die het aantal reinigingsstappen verminderen en reacties combineren om verlies van DNA bij beperken. De adapters en primers moeten verenigbaar zijn met multiplex sequencing en de NGS-platform te zijn (zie tabel van specifieke materialen / apparatuur). Bij gebruik van Y-adapters (met lange enkelstrengs armen), is het essentieel om vooraf versterken de bibliotheek met 3-5 ronden van PCR voor grootte-selectie DNA inserts (bijv. 100 tot 300 bp) van gelelektroforese. Enkelstrengs uiteinden veroorzaken DNA-fragmenten te heterogeen migreren. Proef uitgevoerd met verschillende hoeveelheden input DNA (bijvoorbeeld 0,1, 0,5, 1, 2, 5, 10 en 20 ng) aanbevolen om het aantal PCR-cycli te bepalen (minder dan of gelijk aan 18 cycli) nodig om een maat maken -Selected bibliotheek 100 tot 200 ng. Vermindering van het aantal PCR-cycli maakt de sequentiebepaling van redundant leest minder waarschijnlijk. Vaste fase omkeerbare immobilisatie kralen zijn goed opruimen reagentia om efficiënt te herstellen het DNA van belang en betrouwbaar verwijder gratis adapters en dimeren van ligatie en PCR-reacties.

In aantal, type en de lengte van leest, ongeveer 20-30000000 Eenzijdige bed van 36 bp is genoeg voor de meeste ChIP-Seq experimenten om de gehele Xenopus genoom met voldoende diepte bedekken. De meest voorkomende NGS machines zijn routinematig kunnen voldoen aan deze criteria. Het kan echter voordelig zijn om het aantal te verhogen van leest als een brede verdelingen van leest verwacht, zoals waargenomen met histon modificaties, dan scherpe pieken. Voor veel ChIP-Seq-experimenten, kan 4-5 anders geïndexeerde libraries worden samengevoegd en de sequentie in een stroomcel rijstrook met een krachtige NGS machine. Soms is ook raadzaam de gelezen lengte en sequentie beide uiteinden van de DNA matrijs (gepaarde-end) met mappability verhogen w verlengenduivin analyseren chromatine binnen repetitieve genomische regio's.

Dit protocol is met succes toegepast op een breed scala van chromatine functies zoals transcriptiefactoren, signalering mediatoren en post-translationele modificaties histon. Echter, embryo's te verwerven in toenemende mate van cellulaire heterogeniteit als ze zich ontwikkelen en chromatine profielen moeilijker te interpreteren. Veelbelovende stappen zijn gemaakt in Arabidopsis en Drosophila om weefsel-specifiek profiel chromatine landschappen door het extraheren van celtype-specifieke kernen 38,39. Ons protocol bevat een nucleaire extractie stap, die de weg voor weefsel-specifieke ChIP-Seq kon vrijmaken in andere embryo's.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1/16 inch tapered microtip Qsonica 4417 This microtip is compatible with Sonicator 3000 from Misonix and Q500/700 from Qsonica.
8 ml glass sample vial with cap Wheaton 224884 8 ml clear glass sample vials for aqueous samples with 15-425 size phenolic rubber-lined screw caps.
Adaptor e.g., IDT or Sigma NA TruSeq universal adaptor, AATGATACGGCGACCACCGAG
ATCTACACTCTTTCCCTACAC
GACGCTCTTCCGATC*T. TruSeq indexed adaptor, P-GATCGGAAGAGCACACGTC
TGAACTCCAGTCAC ‐NNNNNN‐
ATCTCGTATGCCGTCT
TCTGCTT*G. *, phosphorothioate bondphosphate group at 5' end. NNNNNN, index (see TruSeq ChIP Sample Preparation Guide for DNA sequence). Order adaptors HPLC purified. Adaptors can be prepared by combining equimolar amounts (each 100 µM) of the universal and the indexed adaptor and cooling them down slowly from 95 °C to room temperature. Use 1.5 pmol per ng of input DNA. Store at -20 °C.
b2g4pipe (software) Blast2GO non-commercial http://www.blast2go.com/data/blast2go/b2g4pipe_v2.5.zip
BLAST+ (software) Camacho et al. non-commercial http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastDocs&
DOC_TYPE=Download
Bowtie (software) Langmead et al. non-commercial http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml
cisFinder (software) Sharov et al. non-commercial http://lgsun.grc.nia.nih.gov/CisFinder/
Chip for capillary electrophoresis Agilent Technologies 5067-1504 Load this chip with 1 µl DNA for library quality control. Store at 4 °C.
Chip-based capillary electrophoresis system Agilent Technologies G2940CA The Agilent 2100 BioAnalyzer is used to check the quality of ChIP-Seq libraries. Keep reagents at 4 °C.
ChIP-Seq library preparation kit (KAPA Hyper Prep Kit) Kapa Biosystems KK8504 Kit contains KAPA end repair and A-tailing enzyme mix, end Repair and A-tailing buffer, DNA ligase, ligation buffer, KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X), and KAPA library amplification primer mix (10X) (see also PCR primers). Adaptors are not included. Store at -20 °C.
ChIP-Seq library preparation kit (alternative, ThruPLEX-FD Prep Kit) Rubicon Genomics R40048 Kit uses their own stem-loop adaptors and primers. This kit eliminates intermediate purification steps and is as sensitive as the KAPA Hyper Prep Kit. Store at -20 °C.
Cluster3 (software) de Hoon et al. non-commercial http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster
FastQC (software) Simon Andrews non-commercial http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc
Fluorometer life technologies Q32866 Qubit 2.0 Fluorometer
Fluorometer reagents life technologies Q32851 The kit provides concentrated assay reagent, dilution buffer, and pre-diluted DNA standards for the Qubit fluorometer. Store DNA standards at 4 °C, buffer and dye at room temperature.
Formaldehyde Sigma F8775-4X25ML Formaldehyde solution, for molecular biology, 36.5-38% in H2O, stabilised with 10-15% methanol. Store at room temperature. CAUTION: Formaldehyde is corrosive and highly toxic.
Gel (E-Gel EX agarose , 2%) life technologies G4010 Pre-cast gel with 11 wells, openable format. Leave one lane between ladder and library empty to avoid cross-contamination. Store gels at room temperature.
Gel electrophoresis system life technologies G6465 E-Gel iBase and E-Gel Safe Imager combo kit for size-selecting ChIP-Seq libraries.
Gel extraction kit Qiagen 28706 Store all reagents at room temperature. Use 500 µl of QG buffer per 100 mg of 2% agarose gel slice to extract DNA. Use MinElute columns (from MinElute PCR purification kit) to elute DNA twice.
HOMER (software) Chris Benner non-commercial http://homer.salk.edu/homer/index.html
Hybridization oven Techne FHB1D Hybridizer HB-1D
IGV (software) Robinson et al. non-commercial http://www.broadinstitute.org/igv/home
Illumina CASAVA-1.8 quality filter (software) Assaf Gordon non-commercial http://cancan.cshl.edu/labmembers/gordon/fastq_illumina_filter
Java TreeView (software) Alok Saldanha non-commercial http://jtreeview.sourceforge.net
Laboratory jack Edu-Lab CH0642 This jack is used to elevate sample in sound enclosure for sonication.
Ladder, 100 bp New England BioLabs N3231 Keep 1x solution at room temperature. Store stock at -20 °C.
Ladder, 1 kb New England BioLabs N3232 Keep 1x solution at room temperature. Store stock at -20 °C.
Low-retention 1.5-ml microcentrifuge tubes life technologies AM12450 nonstick, RNase-free microfuge tubes, 1.5 ml
MACS2 (software) Tao Liu non-commercial https://github.com/taoliu/MACS
Magnetic beads life technologies 11201D These Dynabeads are superparamagnetic beads with affinity purified polyclonal sheep anti-mouse IgG covalently bound to the bead surface. Store at 4 °C.
Magnetic beads life technologies 11203D These Dynabeads are superparamagnetic beads with affinity purified polyclonal sheep anti-rabbit IgG covalently bound to the bead surface. Store at 4 °C.
Magnetic beads life technologies 10001D These Dynabeads are superparamagnetic beads with recombinant protein A covalently bound to the bead surface. Store at 4 °C.
Magnetic beads life technologies 10003D These Dynabeads are superparamagnetic beads with recombinant protein G covalently bound to the bead surface. Store at 4 °C.
Magnetic rack life technologies 12321D DynaMag-2 magnet
MEME Bailey et al. non-commercial http://meme.nbcr.net/meme/
Na3VO4 New England BioLabs P0758 Sodium orthovanadate (100 mM) is a commonly used general inhibitor for protein phosphotyrosyl phosphatases. Store at -20 °C.
NaF New England BioLabs P0759 Sodium fluoride (500 mM) is commonly used as general inhibitor of phosphoseryl and phosphothreonyl phosphatases. Store at -20 °C.
NGS machine Illumina SY-301-1301 Genome Analyzer IIx
NGS machine (high performance) Illumina SY-401-2501 HiSeq
Normal serum (antibody control) Santa Cruz Biotechnology sc-2028 Use as control for goat polyclonal IgG antibodies in ChIP-qPCR experiments. Store at 4 °C.
Normal serum (antibody control) Santa Cruz Biotechnology sc-2025 Use as control for mouse polyclonal IgG antibodies in ChIP-qPCR experiments. Store at 4 °C.
Normal serum (antibody control) Santa Cruz Biotechnology sc-2027 Use as control for rabbit polyclonal IgG antibodies in ChIP-qPCR experiments. Store at 4 °C.
Nucleic acid staining solution iNtRON 21141 Use RedSafe nucleic acid staining solution at 1:50,000. Store at room temperature.
Orange G Sigma O3756-25G 1-Phenylazo-2-naphthol-6,8-disulfonic acid disodium salt. Store at 4 °C.
PCR primers e.g., IDT or Sigma Primers to enrich adaptor-ligated DNA fragments by PCR: AATGATACGGCGACCACCGA*G and CAAGCAGAAGACGGCATACGA*G, phosphorothioate bond. Primers designed by Ethan Ford. Combine primers at 5 µM each. Use 5 µl in a 50 µl PCR reaction. Store at -20 °C.
MinElute PCR purification kit  Qiagen 28006 for purification of ChIP-qPCR and shearing test samples. Store MinElute spin columns at 4 °C, all other buffers and collection tubes at room temperature.
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1, pH 7.9) life technologies AM9730 Phenol:Chloroform:IAA (25:24:1) is premixed and supplied at pH 6.6. Use provided Tris alkaline buffer to raise pH to 7.9. Store at 4 °C. CAUTION: phenol:chloroform:isoamyl alcohol is corrosive, highly toxic and combustible.
Primer3 (software) Steve Rozen & Helen Skaletsky non-commercial http://biotools.umassmed.edu/bioapps/primer3_www.cgi
Protease inhibitor tablets Roche 11836170001 cOmplete, Mini, EDTA-free. Use 1 tablet per 10 ml. Store at 4 °C.
Protease inhibitor tablets Roche 11873580001 cOmplete, EDTA-free. Use 1 tablet per 50 ml. Store at 4 °C.
Proteinase K life technologies AM2548 proteinase K solution (20 µg/µl). Store at -20 °C.
RNase A life technologies 12091-039 RNase A (20 µg/µl). Store at room temperature.
Rotator Stuart SB3 Rotator SB3
SAMtools (software) Li et al. non-commercial http://samtools.sourceforge.neta
Solid phase reversible immobilisation beads Beckman Coulter A63882 The Agencourt AMPure XP beads are used to minimise adaptor dimer contamination in ChIP-Seq libraries. Store at 4 °C.
Sonicator 3000 Misonix/Qsonica Newer models are now available. Q125, Q500 or Q700 are all suitable for shearing crosslinked chromatin.
Sound enclosure Misonix/Qsonica optional: follow the manufacturer's recommendation to obtain the correct sound enclosure.
Thermomixer eppendorf 22670000 Thermomixer for 24 x 1.5 mL tubes. Precise temperature control from 4 °C above room temperature to 99 °C.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gilmour, D. S., Lis, J. T. Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (14), 4275-4279 (1984).
  2. Gilmour, D. S., Lis, J. T. In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster. Mol Cell Biol. 5 (8), 2009-2018 (1985).
  3. Solomon, M. J., Larsen, P. L., Varshavsky, A. Mapping protein-DNA interactions in vivo with formaldehyde: evidence that histone H4 is retained on a highly transcribed gene. Cell. 53 (6), 937-947 (1988).
  4. Ren, B., et al. Genome-wide location and function of DNA binding proteins. Science. 290 (5500), 2306-2309 (2000).
  5. Johnson, D., Mortazavi, A., Myers, R., Wold, B. Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions. Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).
  6. Hellsten, U., et al. The genome of the Western clawed frog Xenopus tropicalis. Science. 328 (5978), 633-636 (2010).
  7. Lee, T. I., Johnstone, S. E., Young, R. A. Chromatin immunoprecipitation and microarray-based analysis of protein location. Nature Protocols. 1 (2), 729-748 (2006).
  8. Blythe, S. A., Reid, C. D., Kessler, D. S., Klein, P. S. Chromatin immunoprecipitation in early Xenopus laevis embryos. Dev Dyn. 238 (6), 1422-1432 (2009).
  9. Gentsch, G. E., Smith, J. C. Investigating physical chromatin associations across the Xenopus genome by chromatin immunoprecipitation. Cold Spring Harb Protoc. 2014 (5), (2014).
  10. Ubbels, G. A., Hara, K., Koster, C. H., Kirschner, M. W. Evidence for a functional role of the cytoskeleton in determination of the dorsoventral axis in Xenopus laevis eggs. J Embryol Exp Morphol. 77, 15-37 (1983).
  11. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10 (3), R25 (2009).
  12. Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  13. Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Mol Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
  14. Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
  15. Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nat Biotechnol. 29 (1), 24-26 (2011).
  16. Thorvaldsdottir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. Integrative Genomics Viewer (IGV): high-performance genomics data visualization and exploration. Brief Bioinform. 14 (2), 178-192 (2013).
  17. Imoto, S., Nolan, J., Bioinformatics Miyano, S. 20 (9), 1453-1454 (2004).
  18. Camacho, C., et al. BLAST+: architecture and applications. BMC Bioinformatics. 10, 421 (2009).
  19. Conesa, A., et al. Blast2GO: a universal tool for annotation, visualization and analysis in functional genomics research. Bioinformatics. 21 (18), 3674-3676 (2005).
  20. Sive, H., Grainger, R., Harland, R. Early development of Xenopus laevis: A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2000).
  21. Chen, Y., et al. Systematic evaluation of factors influencing ChIP-seq fidelity. Nat Methods. 9 (6), 609-614 (2012).
  22. Sharov, A. A., Ko, M. S. H. Exhaustive search for over-represented DNA sequence motifs with CisFinder. DNA Res. 16 (5), 261-273 (2009).
  23. Bailey, T. L., et al. MEME SUITE: tools for motif discovery and searching. Nucl Acids Res. 37 (2), W202-W208 (2009).
  24. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  25. Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nat Rev Genet. 10 (10), 669-680 (2009).
  26. Gentsch, G. E., et al. In vivo T-box transcription factor profiling reveals joint regulation of embryonic neuromesodermal bipotency. Cell Rep. 4 (6), 1185-1196 (2013).
  27. Barabasi, A. L., Oltvai, Z. N. Network biology: understanding the cell's functional organization. Nat Rev Genet. 5 (2), 101-113 (2004).
  28. Biggin, M. D. Animal transcription networks as highly connected, quantitative continua. Dev Cell. 21 (4), 611-626 (2011).
  29. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin): a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , Garland. New York & London. (1994).
  30. Akkers, R. C., et al. A hierarchy of H3K4me3 and H3K27me3 acquisition in spatial gene regulation in Xenopus embryos. Dev Cell. 17 (3), 425-434 (2009).
  31. Yoon, S. J., Wills, A. E., Chuong, E., Gupta, R., Baker, J. C. HEB and E2A function as SMAD/FOXH1 cofactors. Genes Dev. 25 (15), 1654-1661 (2011).
  32. Jallow, Z., Jacobi, U. G., Weeks, D. L., Dawid, I. B., Veenstra, G. J. Specialized and redundant roles of TBP and a vertebrate-specific TBP paralog in embryonic gene regulation in Xenopus. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (37), 13525 (2004).
  33. Buchholz, D. R., Paul, B. D., Shi, Y. -B. Gene-specific changes in promoter occupancy by thyroid hormone receptor during frog metamorphosis. Implications for developmental gene regulation. J Biol Chem. 280 (50), 41222-41228 (2005).
  34. Wills, A. E., Guptaa, R., Chuonga, E., Baker, J. C. Chromatin immunoprecipitation and deep sequencing in Xenopus tropicalis and Xenopus laevis. Methods. 66 (3), 410-421 (2014).
  35. Metz, B., et al. Identification of formaldehyde-induced modifications in proteins: reactions with model peptides. J Biol Chem. 279 (8), 6235-6243 (2004).
  36. Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).
  37. Mazzoni, E. O., et al. Embryonic stem cell-based mapping of developmental transcriptional programs. Nat Methods. 8 (12), 1056-1058 (2011).
  38. Deal, R. B., Henikoff, S. A simple method for gene expression and chromatin profiling of individual cell types within a tissue. Dev Cell. 18 (6), 1030-1040 (2010).
  39. Bonn, S., et al. Tissue-specific analysis of chromatin state identifies temporal signatures of enhancer activity during embryonic development. Nat Genet. 44 (2), 148-156 (2012).

Tags

Developmental Biology chromatine immunoprecipitatie next-generation sequencing ChIP-Seq ontwikkelingsbiologie, cross-linking transcriptiefactor post-sequencing analyse DNA-bezetting metagene bindingsmotief GO term
Genoom-brede Snapshot van chromatine regelgevers en staten in<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryo&#39;s van Chip-Seq
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gentsch, G. E., Patrushev, I.,… More

Gentsch, G. E., Patrushev, I., Smith, J. C. Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq. J. Vis. Exp. (96), e52535, doi:10.3791/52535 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter