Abstract
減少脊髄血流（SCBF）（ すなわち、虚血）が外傷性脊髄損傷（SCI）病態生理学において重要な役割を果たし、それに応じて神経保護治療のための重要な標的です。いくつかの技術がSCBFを評価するために説明してきたが、それらはすべて重要な限界があります。後者を克服するために、我々は、リアルタイムの造影超音波イメージング（CEU）の使用を提案します。ここでは、SCIのラット挫傷モデルでは、この技術の応用について説明します。頸静脈カテーテルは第1のコントラスト剤、六フッ化硫黄カプセル化されたマイクロバブルの塩化ナトリウム溶液の反復注射のために注入されます。背骨は、カスタムメイド3Dフレームで安定化され、脊髄硬膜はThIX-ThXIIで椎弓切除術により露出されています。超音波プローブは、その後、（超音波ゲルで被覆された）、硬膜の後面に位置しています。コントラのベースラインSCBF、単回静脈内注射（400μl）を評価するために、STエージェントは、無傷の脊髄微小血管系を介してその通過を記録するために適用されます。重量落下装置は、その後、SCIの再現可能な実験的な挫傷モデルを生成するために使用されます。造影剤は、SCI後SCBFの変化を評価するための傷害後の再注入15分です。 CEUは、実時間及び生体内 SCI次SCBF変化を評価できます。無傷の動物では、超音波イメージングは、無傷の脊髄に沿って不均一な血流を示しました。 SCBFが複数のリモート無傷の領域に保存されたままながらさらに、15分後にSCIは、重要な虚血は、震源のレベルでした。震源地（吻側および尾側の両方）に隣接する領域では、SCBFが有意に減少しました。これは、前述の「虚血性ペナンブラ領域」に相当します。このツールは、虚血およびSCIの後に得られた組織の壊死を制限することを目的とした治療法の効果を評価するための主要な関心事です。
Introduction
外傷性脊髄損傷（SCI）は、感覚運動の著しい障害、自律機能をもたらす壊滅的な条件です。現在まで、治療は患者においてその効率を示さありませんでした。このような理由から、潜在的な治療法の評価を向上させる、さらなる傷害pathiophysiology 1を解明することができる新たな技術を特定することが重要です。
SCIは、一次および二次傷害と呼ばれる、2つの連続相に分割されます。主な損傷は初期の機械的損傷に対応しています。さらに初期病変、組織損傷、したがって、神経学的欠損の2,3の進行拡大に貢献二次的損傷群（例えば、炎症、酸化ストレスおよび低酸素など）様々な生物学的事象のカスケード一方。
SCIの急性期では、神経保護療法は二次的損傷の病理およびSHを減少させることを目的としていますそれに応じて神経学的転帰を改善ウルド。多くの二次的損傷のイベントの中では、虚血は重要な役割を果たしている4,5。 SCIの震源地のレベルでは、損傷した実質微小血管は、効果的な脊髄血流（SCBF）を妨げます。また、SCBFも著しく損傷震源、特に「虚血性ペナンブラゾーン」として知られている領域を囲む領域において減少します。 SCBFはすぐにこれらの領域内に復元することができない場合、虚血は、補助実質壊死、さらに神経組織の損傷につながることができます。少しでも組織保存機能の実質的な効果を持つことができるように、それは虚血後SCIを減らすことができる薬物と治療法を開発するための主要な関心事です。この現象を強調表示するには、以前の研究は、有髄軸索の10％のみの保存が猫のポストSCI 6で歩行を可能にするのに十分であったことを示しています。
いくつかの技術がSCBFを評価するために説明してきたが、Yはすべての重要な制限があります。例えば、放射性ミクロスフェアの使用7,8及びC14-iodopyrineオートラジオグラフィー9は、その後、動物の犠牲を必要とし、それ以降の時点で繰り返すことはできません。水素クリアランス法10は、脊髄に損傷を与える可能性髄腔内電極の挿入に依存します。レーザードップラー画像化は、14,15フォトプレチスモグラフィおよびインビボ光学顕微鏡16は、測定11-13の非常に限られた深さ/面積を有します。
我々のチームは、以前に造影超音波（CEU）イメージングは、ラット脊髄実質17内SCBF変化をリアルタイムに評価し、 生体内に使用することができることを示しています。これは、同様の技術が黄らにより適用されたことに留意することが重要である。SCI 18のブタモデルにおいて。 CEUは、グレースケール形態学的IMを関連付けることができる超音波イメージングの特定のモードを適用します血流19の空間分布と年齢（従来のBモードによって得られました）。 SCBFイメージングおよび定量化は、エコー造影剤の血管内注射に依存します。造影剤は、リン脂質によって安定化（約2.5ミクロンの平均直径と90％が6ミクロン未満の直径を有する）、六フッ化硫黄の微小気泡から構成されています。マイクロバブルは、このように血液エコー源性を高め、彼らの血流に応じて、組織のコントラストを大きくするプローブによって放出される超音波ビームを反射します。これは、反射された信号の強度に応じて関心のある領域内の血流を評価することができます。マイクロバブルはまた、安全であり、彼らは、臨床的にヒトで適用されています。六フッ化硫黄を迅速にクリアされ（半減期は12分であることを意味する）と投与六フッ化硫黄の80％以上は、注射後2分以内に呼気中に回収されます。このプロトコルは、CEU、IMを使用するための簡単な方法を提供しますラットにおけるSCBFの変化を評価するために高齢化。
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Protocol
注：この原稿に記載された方法は、医学、パリ、フランス（CEEALV / 2011-08-01）のLariboisière学校の生命倫理委員会によって承認されました。
1.機器の準備
- マイクロ鉗子、マイクロはさみ、マイクロ血管クランプ、大きなはさみ、外科用糸（黒編み絹4-0）と14 Gカテーテル：カテーテル挿入のために、以下の機器を準備し、清掃してください。ヘパリン溶液（5,000 U / ml）でカテーテルをヘパリンで治療します。
- 大きなはさみ、メスと骨カッター：椎弓切除のため、以下の機器を準備し、清掃してください。椎弓切除術（ 図1）の間に、脊髄を傷つけるのリスクを軽減するように設計されたカスタムメイドの骨カッターで椎弓切除術を行います。
- セットアップ動物の位置決めおよび安定化のために使用される3D-フレームを。カスタムメイドフレームは、鉗子に関連して創外固定器ホフマン3の要素で構築され、whichは、動物の腰椎を適合させるために湾曲されています。
- 脊髄損傷生体力学的に使用される重量ドロップデバイス（インパクター）を準備します。
注：カスタムメイドインパクション装置は、3Dソフトウェアで設計し、3Dで印刷しました。 - 超音波装置の電源をオンにします。
- 造影剤の再構成するためのキットを準備します。
注：このキットは、凍結乾燥粉末25mgを5mlの塩化ナトリウムと一つのミニスパイク転送システム（ 図2）を含む1プレフィルドシリンジを含む1バイアルを含みます。造影剤の再構成のための手順は、（第5節で）以下に詳述されています。
2.頚静脈カテーテル（図3）
- 4％のイソフルランで動物を麻酔 。仰臥位で動物を置きます。足をピンセットでつまみされたときに動物が応答しないことを保証することにより、適切な麻酔を確認してください。ウントしながら乾燥を防ぐために、目に獣医軟膏を適用しますER麻酔。
- 首を剃るし、肌をきれいにします。首の正中線に切開を行います。内頸静脈を見つけるためにsternocleidomastoidian筋肉を撤回。静脈の吻側部に結紮糸を締めます。
- 静脈、合字より1cm下の微小血管クランプを適用します。ちょうどクランプが解除されたとき締めする準備ができて結び目とクランプの下、静脈の周囲に別のスレッドを渡します。
- クランプと吻側合字間静脈（静脈切開）の壁を開きます。静脈の内腔に14 Gカテーテルを導入し、心臓に向かって押し込みます。
- それは、クランプに対して起動すると、後者を解放し、さらに、カテーテルを押してください。しっかりと内側カテーテルを用いて静脈に結び目を締めて、静脈にカテーテルを固定します。
- カテーテルに静脈血の少量を回収し、続いて、その後ヘパリン化生理食塩水でそれをフラッシュすることによって、カテーテルの開存性を評価します。これは、Cの閉塞を防止します潜在的な血液凝固によってatheter。
- 造影剤（マイクロバブル）のさらなる注入のためのカテーテルにフレキシブルチューブを接続します。使用するための準備ができるまで（封入）することが閉じておいてください。
3.脊椎へのアクセス、椎弓切除およびラットポジショニング（3D-フレーム内）
- フラット傾向が水平位置に動物を配置します。剃ると動物の背中（胸部）を清掃してください。
- 触診（ 図4）によって、最後の肋骨（ラットでXIIIth）を特定します。これは、1つはXIIIth胸椎（ThXIII）の位置を推定することができます。
- ThXIIIを中心に正中線では4センチ皮膚切開を作ります。皮膚切開だけでなく、基礎となる嚢を開きます。背中の筋肉の腱膜ならびに椎骨棘プロセスのヒントを確認します。
- 慎重XIIIthリブを触診することによりThXIIIの背骨プロセスをローカライズ。
注：XIIIthリブがThXIIIに接続され、したがって、LOCAに簡単にを表しますThXIIIの同定のための解剖学的ランドマークをTE。このステップは、ThIX棘突起ならびにL1およびL2（第1、第2腰椎の椎骨）にThXIIの局在化を可能にします。 - 筋肉の腱膜をカットし、L2にThIXから棘突起、ラミナや椎間関節を露出させるためにいずれかの側に筋肉を切り離します。横突起から筋肉を取り外すことにより、L1、L2の横方向の側面を露出させます。
- 位置（ 図5）を確保するために、3Dフレームに動物の切歯を引っ掛けます。修正された鉗子でL1とL2椎骨を固定します。動物を安定させるために3D-フレームに変更された鉗子を接続します。
- ゆっくり脊椎全体を強化するとベンチから胸部を上昇させるために、尾側に腰椎を保持鉗子を引きます。
注：記載の構成では、動物が呼吸することができる必要があります。また、胸郭、背骨や脊髄の呼吸運動にもかかわらず、コードはまた、不動のままであるべきです。 - ThIXからThXIIに棘processessを削除します。ゆっくりThXIIの左ラミナ下に骨カッターの劣るブレードを挿入した後、薄層（ 図6）を切断するために骨のカッターを閉じます。
- 右ラミナに同じ操縦を繰り返し、順次後方アーチを削除します。 4レベルの椎弓切除を達成するためにThIXに椎骨のThXI、前の手順を繰り返します。各椎骨のための両方の椎間関節を外します。
注：手順では、地元の出血から術野を清掃してください。そのためには、ぬるい食塩水で綿棒や灌漑を使用しています。止血は系統的に数分以内に起こります。
4. CEUプローブポジショニング
- 超音波ゲルと硬膜をカバーしています。これは、プローブと脊髄（ 図7）との間の超音波の効果的な伝達を可能にします。
- 超音波プローブのウィットを安定させますその後、多関節アームによって、3Dフレームに接続することができヘクタールクランプ。手動でプローブを配置します。プローブを斜め縦矢状スライスを取得するように配向されていることを確認します。正しい位置に、脊髄は、画像に厳密に水平であり、脊髄の中心管は、脊髄の完全なセグメントに沿って表示されます。
注：位置決めは、超音波装置の画面に表示されるリアルタイムのBモード画像によって案内されるべきです。超音波プローブの焦点距離は、脊髄の中心管と整列されるべきです。このとき、脊髄の後面は、最終的にインパクターの位置決めを可能にするどのアクセス可能です。 - ときに最適な、位置を安定させるために多関節アームをロックします。
造影剤の5準備 - マイクロバブルの再構成
- 商用再構築キットの内容を使用し、TIG、それを固定することにより、プランジャーロッドを接続htlyシリンジ（時計回り）に。転送システムのブリスターを開き、シリンジ先端キャップを取り外します。転送方式キャップを開き、（しっかり固定）転送システムに注射器を接続します。
- バイアルから保護ディスクを取り出します。の透明スリーブにバイアルをスライドさせ
- しっかりと所定の位置にバイアルをロックする搬送システム、を押します。
- プランジャーロッドに押して、バイアルにシリンジの内容物を空にします。乳白色均質な液体を得るために、バイアル内のすべての内容物を混合するために20秒間激しく振ります。
- システムを反転し、慎重にシリンジに造影剤を撤回。移送システムから注射器を外します。 （指示されたように）再構成した後、得られた分散液1 mlをマイクロバブルで8μlの六フッ化硫黄が含まれています。 100ミリリットルの注射器にマイクロバブルの懸濁液を描画します。電動ポンプに100ミリリットル注射器を挿入します。ふたを閉じます。
- 再の一定の攪拌を開始しますマイクロバブルを構成しました。マイクロバブル懸濁液を維持し、シリンジの低速回転により一定の攪拌を得ました。フレキシブルチューブを介して頸静脈カテーテルにポンプを接続します。 「ハーモニックモード」に超音波装置を設定します。
注：後者はマイクロバブルを特異的に検出し、可視化することができるモードに対応します。このモードは、Bモードとは対照的に、マイクロバブルを破壊しない低メカニカルインデックスを持っています。 - 造影剤の最初の投与量（400μl）を注入することにより、カテーテルをパージします。この最初の注入時には、マイクロバブルは、超音波画面に表示されないことを確認してください。これは、（ラットの血流への注射器から）回路全体が無傷で開いていることを確認します。
- 脊髄実質および血流中に残っているいくつかのマイクロバブルの破壊を可視化する「Bモード」に超音波装置を設定します。 「Bモード」の高周波トラン破壊にそれらを可能にするマイクロバブルにスミッツ高エネルギー、。
- 動物は約30分間、まだ横たわってみましょう。この期間は、血行動態パラメータの安定化を可能にします。
無傷の脊髄におけるSCBFの6評価
- 「ハーモニックモード」に超音波装置を設定します。同時に造影剤の（1）注入（400μL）および（2）クロノメーターを起動します。
注：点滴中に、血流中のマイクロバブルの濃度は、脊髄（ 図8）のコントラスト想像を可能にする、増やす必要があります。マイクロバブルを迅速に破壊されるので、マイクロバブルの血中濃度は、注射は、脊髄のコントラスト視覚化の漸進的な減少を生成する完了すると減少し始めます。 - 1分後、超音波マシン上（プレス）「クリップストア」ボタンを選択します。これは、Rの1分を保存することを可能にしますAW超音波データと撮像動画記録（それは、以前に超音波画面上に表示されました）。
- 「Bモード」に超音波装置を設定します。これは、残りの微小気泡を除去することができます。
7.実験SCI
- 3Dフレームに接続されたマイクロマニピュレーターを用いてインパクタの先端が硬膜に接触するように、（脊髄正中線上に）重量落下衝撃装置を配置、THXとThXI（ 図9）との間の接合部で。
注：このレベルでは、超音波装置を用いて観察脊髄のセグメントの中央に対応する必要があります。ストライカーとインパクターの本体は直径8mmです。損傷が発生しますインパクターの先端には、直径3mmです。 - を10cm高い位置に衝撃装置のストライカーを置きます。衝撃装置のストライカーを放出することによって、実験SCIを誘導します。ストライカーが低下し、目をリリースEインパクター、脊髄を負傷しました。カスタムメイドの衝突は、10グラムの重量への影響当量が10cmの高さから落下提供しています。
SCBF 5分後のSCIの8評価
- セクション6（SCBFの評価）に記載の手順を繰り返します。マイクロバブルは、損傷した微小血管系を通過することができなくなり、けがの震源地は（ 図10）暗いままになります。
9.動物の犠牲
- ペントバルビタールの腹腔内致死注射（100 mg）を用いて動物を安楽死させます。
10オフライン分析によるSCBFの定量
- （超音波マシン上の）定量化のために使用される超拡張ソフトウェアを起動します。 「 ファイル 」 を選択し、以前に保存された生データを選択して、関連ファイルを開きます。 「 カイQ」ボタン（選択）を押して「 定量モード 」 を有効にします。セレCT」 セットROI」（ボタン）と円形の形状を選択します。
- 「ROIを描画 」を選択（ボタン）および脊髄（ 図11）に興味のある7、隣接する円形の領域（ROI）を描画します。 「 フィッティング 」メニューを開き、「 曲線値 "機能を選択します。各ROI内のマイクロバブル濃度の変化に対応し、いくつかの曲線を表示するソフトウェアを確認します。
注：各曲線は、「灌流deperfusion」プロファイルを有します。曲線の最初のフェーズでは、平坦であり、マイクロバブルの到着までの期間に相当します。第二段階では、マイクロバブルの濃度が急速に注入の結果として増加します。彼らは血流中disintegratseとして注入が完了したときに始まる第三段階では、マイクロバブルの濃度が次第に低下します。 - Cの第二フェーズの開始時に第1の垂直線を配置urveと「SET」を選択します。これは、分析を開始するためのソフトウェアに通知します。
- 記録の終了時に、第2の垂直線を配置し、再び「SET」を選択します。これは、分析を停止するためのソフトウェアに通知します。
- 「Cv値 」メニューを見て、分析し、「 曲線下面積 」に相当する「AUC」の値を、記録します。この値は、対応するROI内部SCBFに比例しています。
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Representative Results
プロトコルは、上記によれば、長手脊椎矢状セグメントに沿っSCBFをマッピングすることが可能です。
無傷の脊髄では、実質（ 図12）内のSCBFむらがあるように思われます。これは、1つの動物から別のradiculo、髄質動脈（RMA）の可変分布によって説明することができます。 RMAは、前脊髄動脈（ASA）に達する動脈分節ので、脊髄実質への血液供給を提供することを指します。これとは対照的に、根動脈は、ASAに到達しないため、脊髄の血液供給を提供していない動脈を、分節に対応します。したがって、RMAはASAと吻合脊髄セグメントにおいて、より多くの血流が（我々の結果に示されるように）があります。
SCI後、リアルタイムのCEUイメージングは、傷害の震源地での循環の不足を示しています。震源は、暗（非造影剤の信号）残っていませんアクティブな血流が存在しないように。いくつかの関心領域を用いて血流のより詳細な分析は、3つのユニークな血流地域を示しています。まず、震源のレベルで、血流が約90％の平均減少と最も低いです。第二に、震源地に隣接する地域（吻側および尾側の両方）で、SCBFも大幅（-50％から-80％の範囲）減少しました。第三に、無傷の組織に対応するほとんどの遠隔地に、SCBFは保持されます。第2の領域は、潜在的な神経保護治療の目標であるべき「虚血性ペナンブラ領域」に対応します。容易にSCBFを可視化し、定量化することができることは、ポストSCIは組織の虚血を低減することを目的とした治療法の有効性を評価するのに有用であるため、この技術（ 図13）の重要性を強調して変更します。
図2.マイクロバブルの再構成のためのキットおよびマイクロバブルの注入のために使用さVueject°ポンプの概略図。搬送システムは、バイアルと注射器との間のマイクロバブルと生理食塩水の送達を可能にする。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
3. 頚カテーテル図 。カテーテルが頸静脈に挿入されると、心臓に向かって押され、最後に結び目で固定します。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
椎骨レベルを正しく識別するための4の方法を図 。ラットでは、最後のリブがXIIIthの椎骨に取り付けられています。後者は最後の胸椎、XIIIthためのランドマークとして、皮膚を通して触診することができます。筋肉は、棘突起の両側に切り離されている。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
3Dフレーム内の動物の図5.安定化。第一および第二腰椎脊椎（L1＆L2）はカスタムメイドの鉗子でクランプされながら（1）切歯がフレームに夢中にされています。 （2）腰椎を少し動物を安定化し、ベンチから胸部を上昇する締め付けられ、それによって脊椎の動きなしで無料で呼吸運動を可能にする。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
椎弓切除術の図6.技術的な詳細は。まず、カスタムメイドの骨カッターの薄い刃は、脊髄を損傷することなく、薄層の下に渡されます。そして、骨カッターは、閉じているCUTSとラミナの部分を削除します。手順は、4つのレベルの椎弓切除を達成するために、両側とTxIXにThXIIから繰り返します。最後に、椎間関節も削除されます。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
超音波プローブと、衝撃装置の図7の配置。重量ドロップインパクタは硬膜の後面に接して配置することができるように、プローブは、（20〜30°）、脊髄と平行やや斜めです。脊髄は、超音波イメージング「Bモード」の中間セグメント全体で中央運河存在と表示される必要があります。 ご覧になるにはこちらをクリックしてくださいこの図の拡大版。
無傷の脊髄の図8.コントラストイメージングは。コントラストモードでの連続した数字（オレンジカラー画像）は、造影剤（マイクロバブル）が次第にそれによって脊髄のコントラストを向上させる、注入後の表示方法を示しています。ボーラス注入が約10秒を持続し、コントラストデータを1分間記録した。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図9.実験SCI後のBモードの変更。高エコー病変は、初期実質hに対応する、実質内部に表示されます emorrhageポストSCI。組織学（H＆E染色）：実質における血液溢出（黄色のスケールバー= 2,000マイクロメートル）に通じる小血管の大規模な外傷性崩壊からの出血をもたらします。衝撃デバイスが右側に表示されます。ストライカーは、10cmの高さから解放され、その後、脊髄損傷を生成するインパクターに衝突されている。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図10.造影15分後-SCI 8を図のように、彼らは脊髄微小血管系を通過するように、マイクロバブルが表示されます。震源（アスタリスク）で、血流が微小破壊によって遮られます。10large.jpg「ターゲット= "_空白">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
SCBFの定量化のため、図11のプロトコル。超拡張ソフトウェアで、利息（ROI）の7円形と隣接する領域は、長手方向脊髄画像上に描画されます。最初のROIは、傷害の震源地に配置されています。各ROIは、ソフトウェアは、灌流deperfusion曲線を生成し、この曲線下の面積を計算します。この値は、このエリア内の血流と相関している。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
血流の図12に沿って不均一性脊髄。これらのグラフは、脊髄の血流の不均一性などの動物間の変動を表示します。これは主に、脊髄の血管の解剖学的構造によって説明することができます。しかし、不均一性と可変血管構造に起因し、1はベースラインとして損傷前に（各ROI）からの血流測定値を使用する必要があります。次の時点（ポストSCI）で行われた測定は、ベースラインのパーセンテージ変化として表されている。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図13.実験的脊髄損傷によって誘発される脊髄血流（SCBF）の推移（SCI）。SCBFがまま震源のレベルで重要な虚血は、pがあり、SCI後15分複数のリモート無傷の分野で予約。震源（吻側および尾側の両方）に隣接する領域では、SCBFが大幅に低減されます。これは、前述の「虚血性ペナンブラ領域」に相当する。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
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Discussion
我々はラットSCI挫傷モデルでCEUを使用する方法を記載しているが、このプロトコルは、他の実験の目的またはSCIモデルに適合するように修正することができます。我々は、2つの時点（損傷前と15分後SCI）、時間点の数がでSCBFを測定することを選択したとSCBF測定値との間の遅延は、他の研究の必要性を満たすように構成することができます。たとえば、私たちの以前の研究17で、我々は最初の一時間後SCIを通して5回連続の時点でSCBFを測定しました。これは、偽群（無SCI）で、我々はSCBFの漸進的な減少を観察して驚いたことに留意することが重要です。私たちが最初に繰り返さマイクロバブル注入は、脊髄血管系、更なる実験（未発表データ）を傷つける可能性があることを恐れているが、これらの変更は、進行性の椎弓切除術により誘発される局所的な組織の生理学的状態の変化（温度、水分補給）、ならびに長期化によって引き起こされていることを確認しましたTの博覧会彼は硬膜と周囲の空気と超音波ゲルに周囲の組織。循環がvascoconstrictionまたは血管拡張を起こしやすい多くのパラメータ、したがってに極めて敏感であるように、これらの問題は、微小循環を扱うすべての実験において共通しています。したがって、我々は手術創が開いたままである期間をできるだけ短くすることをお勧めします。複数SCBF測定が長期間必要とされる場合には、脊髄の周りと内部の生理学的状態を回復するために、取得の間、動物の切開を閉鎖することが好ましいです。
これは、形状、大きさ、位置及びSCBF分析のためのROIの数を変更することも可能です。 CEUの主要な利点の一つは、測定値が記録されたデータをオフラインで処理することにより、実験終了後にいつでも行うことができることです。これは、測定を繰り返すか、必要であれば、測定設定/規格を変更することも可能です。
超音波画像の空間分解能は、超音波の周波数に比例します。空間分解能、より良い、超音波周波数が高いです。我々は、高を使用しています-frequency約100μmのピクセル解像度を有する画像を提供する（12〜14 MHz）のプローブ。超高解像度のシステムでは、周波数が55 MHzまで増加し、各ピクセルは、約20〜20μmです。このようなデバイスはまた、正確にはるかに実質におけるSCBFの分布を示しているCEUに使用することができます。しかし、超高解像度のシステムでは、はるかに高価です。
いくつかの他の技術は、SCIにSCBFを測定するために提案されているが、それらはすべて固有の限界があります。このような放射性ミクロスフェア7,8-またはC14ヨード-アンチピリンオートラジオグラフィー9、などのいくつかは、動物の犠牲を必要とします。これらのケースでは、脊髄は、分析のために採取されなければなりません。一方、水素クリアランス法10は 、実際にSCBFを修正することができる脊髄電極挿入が必要です。また、測定は、脊髄実質の非常に制限された領域で行うことができます。光学顕微鏡検査脊椎窓からも微小循環を評価する方法を提供するが、この方法は、観察の非常に制限された深さを有します。それだけで実質16内に表面的なPIAの問題ではなく、循環を観察することができます。
文献で は、SCBFのリアルタイムの生体内評価は、通常、レーザードップラー画像11〜13によって実行されます。しかし、この手法にはいくつかの制限を有します。レーザは、直径1mm未満であるのでまず、SCBFのみ直径約1mmの半球体に相当する非常に制限された領域で評価することができます。ラットの脊髄の直径は約3mmであるので、分析の限られた面積は、主要な制約です。我々は、無傷の脊髄におけるSCBFが均一でないことが示されているようにまた、それは、組織微小循環を適切に表現するための大きな領域にSCBFを測定することが重要です。第二に、レーザは、侵入の制限された深さを有するので、DETE表面的SCBFをCTS。その結果、実質SCBFを測定するだけでなく、軟膜（すなわち実質を取り囲む）の。軟膜は、ユニークな血管系を有しており、実質容器と同じ自己調節機構が施されていないので、この情報は誤解を招くかもしれません。最後に、レーザードップラーは、いかなる形態学的情報を提供していません。 CEU一意はっきり実質内で識別することができ、造影剤を提示しながら、コード（Bモード）の形態学的画像を表示することによって、そのような制限を克服します。
他のアプローチにその多くの利点にもかかわらず、CEUはまた、いくつかの明確な制限があります。測定は、二次元の矢状スライス（通常は中心管に平行）で行われるので、実質の他の地域からSCBFにはアクセスできません。また、単一の二次元サジタル脊髄セグメントによって生成された情報は、全体のコードの代表ではないかもしれません。 Neverthelessは、これは、いくつかの予防措置によって制御することができます。まず、同一の場所で測定を繰り返すことにより、最初の測定は、（無傷脊髄）をベースライン値として使用することができました。第二に、脊髄正中線（二国間の損傷）で負傷により、SCBFの変更は、左と右の（未発表データ）との間に対称的であるべきです。これらの予防措置は、単一の矢状スライスの解析がSCBFのグローバル縦分布を反映するのに十分であることを確実にするのに役立ちます。
超音波マシンの高コストは、他の制限です。しかし、いくつかのソリューションは、この問題を対象とするために存在します。まず、いくつかの研究室では、それらの実験のために、製造業者によって、一時的な融資を交渉することができます。超音波マシンは可搬型であるため、一時的な融資が可能です。これは、私たちの研究室で使用されるアプローチとなっています。あるいは、ラボのグループは、マシンを購入するリソースをプールし、コストを分割することができます。それ以外の場合は、多くの大学機関は、撮像設備、超音波機械を持っていますSは不可欠なツールとして推奨することができます。したがって、動物は、評価のためのCEUイメージング機能を輸送することができるし、他の実験のために戻さ。
血管の変化、造影剤（マイクロバブル）を評価するために静脈内注射しなければなりません。頸静脈または大腿静脈のカテーテル法は、侵襲性と危険であるが、静脈が簡単にアクセスできると明確に識別されています。対照的に、尾静脈注射は、はるかに低侵襲性であるが、容器は、適切なカテーテル挿入のために目に見える/不十分に区別されます。したがって、針先が正しく静脈の内部に配置されないことや、それが全体の実験を損なう、注入中に移動するおそれがあります。このような理由から、私たちは、頸静脈を使用し、一貫性のマイクロバブル注入のためにカテーテルを導入することを好みます。
椎骨の骨、脊髄を囲みます。超音波は骨によって反射され、脊髄のラミナを通過できないように、イメージングが必要音響窓を開くために、骨の除去（椎弓切除術）。脊柱管をオープンする最も簡単な方法は、椎弓切除を介して椎骨の後弓を除去することです。このプロトコルでは、我々は震源地、半影領域と無傷の脊髄の遠隔地を含む脊髄の長いセグメントを、可視化するために4つのレベルの椎弓切除術を必要とします。実験SCIモデルの大部分は（クリップアプリケーションやインパク挫傷のための）椎弓切除術を必要とするが、これらは通常、1〜2薄層を除去することで構成されています。豊富な4レベルの椎弓切除術は、我々の研究のもう一つの制限です。 1のみを震源とペナンブラゾーンを研究する必要がある場合は、より少ない大規模な椎弓切除術を行うことができ、お勧めします。
結論として、上記のいくつかの制限にもかかわらず、CEUはSCBF変化や様々な治療（研究目的）の効果を評価するための便利なツールです。この信頼性の高い、リアルタイム、 イン·ビボアプローチ減らすために治療を見に最適です虚血とその後の組織壊死ポストSCI。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| External Fixator Hoffman 3 | Stryker, Kalamazoo, USA | Modular system used to build the custom made 3D frame and the jointed arm holding the ultrasound probe | |
| Toshiba Applio | Toshiba, Tokyo, Japan | Ultrasound machine | |
| Sonovue | Bracco, Milan, Italy | Contrast agent : microbubbles | |
| Vueject pump | Bracco, Milan, Italy | Electric pump for infusion of microbubbles bolus | |
| Aquasonic Ultrasound Gel | Parker Laboratories, Fairfield, NJ, USA | Ultrasound gel used to transmit the ultrasound waves | |
| Isovet | Piramal Healthcare, Mumbai, India | Isoflurane used for anesthesia | |
| Ultra Extend | Toshiba, Tokyo, Japan | Software used for quantification of spinal cord blood flow | |
| Mastercraft Five-piece Mini-pliers Set, Product #58-4788-6 | Canadian Tire, Toronto, Canada | Set of pliers for Do-it-yourself job |
References
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