Abstract
Porque variantes de proteína desempenham papéis críticos em muitas doenças, incluindo TDP-43 em Esclerose Lateral Amiotrófica (ALS), alfa-sinucleína em doença e beta-amilóide e de tau na doença de Alzheimer, é criticamente importante desenvolver reagentes morfologia específicos que podem direccionar selectivamente Parkinson estes proteína específica da doença variantes para estudar o papel destas variantes na patologia da doença e para potenciais aplicações de diagnóstico e terapêuticas. Nós desenvolvemos novos microscopia de força atômica (AFM) técnicas de bioprospecção base que permitem o isolamento de reagentes que reconhecem seletivamente variantes de proteína de doenças específicas. Existem duas fases principais envolvidos no processo, as fases de panning negativos e positivos. Durante a fase de panning negativo, os fagos que são reativos a antígenos off-alvo são eliminados através de várias rodadas de panning subtrativo utilizando uma série de cuidadosamente selecionados antígenos fora do alvo. Uma característica fundamental no negativofase panning está utilizando imagens AFM para acompanhar o processo e confirmar que todas as partículas de fago indesejados são removidos. Para a fase de deslizamento positivo, o antigénio alvo de interesse é fixa sobre uma superfície de mica e fagos ligados são eluídos e pesquisados para identificar os fagos que se ligam selectivamente o antigénio alvo. A variante da proteína alvo não necessita de ser purificada para proporcionar os controlos negativos adequados panning foram utilizados. Mesmo variantes da proteína alvo que estão presentes apenas em concentrações muito baixas em material biológico complexo pode ser utilizado no passo de filtração positivo. Através da aplicação desta tecnologia, adquirimos anticorpos para proteínas variantes de TDP-43 que são encontrados seletivamente no tecido cerebral humano ALS. Espera-se que este protocolo deve ser aplicável para geração de reagentes que se ligam selectivamente variantes proteicas presentes numa grande variedade de diferentes processos biológicos e doenças.
Introduction
A presença de variantes de proteína tem sido implicada como um factor na progressão de muitas doenças, incluindo as doenças neurodegenerativas, tais como Alzheimer, Parkinson, ALS e demência fronto-temporal (FTD) 1,2,3,4,5,6,7,8,9 , 10,11. Formas oligoméricas de proteínas da beta-amilóide e alfa-sinucleína está pensado para ser as espécies tóxicas responsáveis pela doença de Alzheimer e de Parkinson, respectivamente 2,3,4,5. Agregados de TAR ADN da proteína de ligação 43 (TDP-43) têm sido associados a ALS e FTD 12,13,14. Portanto reagentes tais como anticorpos que podem atingir selectivamente as diferentes variantes de proteína podem ser ferramentas poderosas para servir como marcadores de diagnóstico e terapêuticas potenciais. Neste estudo, focado no desenvolvimento de reagentes que se ligam selectivamente variantes da proteína TDP-43 implicado em ELA, no entanto a técnica descrita no presente documento deve ser aplicável ao isolamento de reagentes contra uma ampla gama de protein variantes.
Agregação citoplasmática de TDP-43 foi identificado como uma característica patológica em ALS 15,16,17,18,19. Tipicamente TDP-43 encontra-se no núcleo de todas as células de um indivíduo normal, apesar de tender a mover-se entre o citoplasma e núcleo 15,17. Formas No entanto, em ALS agregados de TDP-43 são detectadas no citoplasma de neurónios e células da glia seleccione com concentrações mais baixos encontrados no núcleo, sugerindo o movimento de TDP-43 a partir do núcleo para o citoplasma durante a progressão da doença 16,20. Apesar da agregação de TDP-43 encontra-se na maioria dos casos de ALS, não leva em conta todos os casos, desde 1% a 2% do total de casos de ALS (ou 15% -20% dos casos de ALS familiar) estão ligados a mutações no superóxido dismutase 1 (SOD1) 15,17 gene. Devido ao importante papel da TDP-43, na grande maioria dos casos de ELA, aqui vamos focar no desenvolvimento de reagentes de anticorpos com base que pode se ligar seletivamente a TDP-43 variantes que sãopresentes no tecido cerebral humano ALS utilizando nossas técnicas de bioprospecção baseado romance AFM.
Inicialmente precisamos de um repertório diversificado de ligação do anticorpo domínios. Combinamos três (scFvs) bibliotecas diferente de apresentação de fagos de fragmentos de anticorpos de domínio variável de cadeia única, (Tomlinson I e J e folhas de bibliotecas 21). O processo de filtração é dividida em fases panning negativos e positivos. Os fagos das bibliotecas são primeiro submetido ao processo de panning negativo durante o qual os fagos reactivo para fora múltiplos antigénios-alvo são excluídos. Após a conclusão de cada ciclo de prospecção negativa contra cada antigénio fora do alvo, o processo é acompanhado por AFM imagiologia para assegurar que todos os fagos de ligação dos antigénios-alvo fora ter sido removido. Somente após a verificação pela AFM imagem que todos os fagos reativas são removidos podemos avançar para o próximo alvo. Para isolar reagentes contra TDP-43 variantes implicados em ALS utilizamos os seguintes antígenos panning negativos: 1) de BSA para remover fago que se ligam fracamente ou não-especificamente a proteínas; 2) alfa-sinucleína agregado para remover fagos que se ligam a elementos estruturais genéricas de proteínas agregadas; 3) homogenatos de tecido cerebral humano para remover fagos que se ligam a quaisquer proteínas ou outros componentes presentes em amostras pós-mortem de tecido de cérebro humano saudável; 4) imunoprecipitou TDP-43 do cérebro humano saudável para remover fago que se ligam a todos os TDP-43 formas associadas com o cérebro humano saudável; e 5) imunoprecipitada a TDP-43 isolada a partir de homogenatos de cérebro de FTD para remover fago que se ligam TDP-43 variantes associadas com a patologia não-ALS. Após remoção de todo o fago reactivo a todos os antigénios off-alvo, que, em seguida, procedeu-se à fase de filtração positivo durante o qual os fragmentos de anticorpos que se ligam ao antigénio de interesse são isolados, neste caso TDP-43 imunoprecipitada a partir de tecido cerebral humano ALS. Estes anticorpos isolados podem ser reativas a formas de TDP-43 agregados ou modificados.
"> Convencional bioprospecção fago centra-se principalmente na fase de filtração positiva 22,23. Normalmente, o alvo de interesse estiver imobilizado, a biblioteca de fago adicionado e fagos ligados eluídos. Os fagos são então amplificados e adicionado ao alvo novamente. Este processo de amplificação e a incubação geralmente é repetido várias vezes para aumentar a percentagem de fago de ligação positivo. Embora variações deste processo têm sido extensivamente usados para isolar os reagentes de anticorpos contra uma vasta gama de antigénios alvo, que geralmente requer grandes quantidades de antigénio alvo purificada 24,25,26, 27, enquanto que o nosso processo requer apenas pequenas quantidades do antigénio alvo. O protocolo aqui descrito pode ser utilizado para isolar os reagentes que se ligam selectivamente a antigénios alvo que estão presentes em concentrações muito baixas, sem a necessidade de purificação e a filtração pode ser efectuada directamente contra antígeno presente em amostras de tecidos complexos. O uso de protocolos panning negativas exaustivas como verificadopor AFM garante que clones isolados contra o antígeno positivo deve se ligar seletivamente o alvo, mesmo quando não purificado ou enriquecido.Kasturirangan e colegas (2003) levaram a cabo um processo de bioprospecção negativo e positivo semelhante para isolar anticorpos reativos ao oligom�ica beta-amilóide utilizando concentração nanograma do alvo 5. Aqui vamos expandir esse processo para permitir a geração de reagentes que se ligam seletivamente a proteína específica da doença variantes diretamente de amostras de tecidos humanos. Em estudos futuros, pretendemos investigar não só o valor diagnóstico dos reagentes isolados aqui, mas também avaliar a sua relevância terapêutica para o tratamento de ELA.
No geral, a nova tecnologia AFM bioprospecção com base deve ser aplicável ao isolamento de qualquer variante da proteína específica da doença em qualquer material biológico sem a necessidade de purificação da proteína ou modificação, mesmo quando o antigénio alvo Concentraçãns são extremamente baixos.
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Protocol
1. Produção Phage
- Execute todos os processos de produção de fagos e bioprospecção em uma cabine de segurança biológica. Produzir partículas de fagos das diferentes bibliotecas (bibliotecas Tomlinson I e J e folhas de bibliotecas 21) para o processo de bioprospecção usando as instruções do fabricante (http://www.lifesciences.sourcebioscience.com/media/143421/tomlinsonij.pdf).
NOTA: Nós usamos várias bibliotecas em nosso processo de panning para aumentar a diversidade dos anticorpos disponíveis. - Em resumo, as bactérias de cultura de existências das três bibliotecas em 200 ml de YT 2 × contendo glicose a 1% e 100 ug / ml de ampicilina, num agitador a 37 ° C até DO600 de 0,4.
- Adiciona-se 8 x 10 11 de fago auxiliar KM13 a 200 ml de bibliotecas Tomlinson I e J e 8 x 10 11 de fago auxiliar VCSM13 para 200 ml da biblioteca Sheets. Incubar as amostras da biblioteca com o fago auxiliar, durante 30 min a 37 ° C sem agitação.
- Centrifugar aculturas a 3000 xg durante 10 min e ressuspender o sedimento de células em 200 ml de YT 2 × com 0,1% de glucose, 100 ug / ml de ampicilina e 50 ug / ml de canamicina.
- Incubam-se as culturas de O / N a 30 ° C com agitação e, em seguida girar durante 30 min a 3300 xg o dia seguinte.
- Adicionam-se 50 ml de polietileno glicol (PEG) 8000 em 2,5 M de NaCl para 200 ml de sobrenadante a partir de cada uma das bibliotecas e incubar em gelo durante 1 hr. Após precipitação com PEG, girar as soluções de novo durante 30 min a 3.300 x g.
- Adicionar 1-2 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) para o sedimento de células (dependendo do tamanho do grânulo) e transferência para tubos de microcentrífuga.
- Incubar partículas de fago em gelo durante 1 hr a 37 ° C com mistura ocasional antes da centrifugação durante 10 min a 11.600 x g. Recolhe-se o sobrenadante e armazenar a -80 ° C.
- Antes da congelação, transferir um pequeno volume das partículas de fago a partir de três bibliotecas para um outro tubo de microcentrífuga e titular cada bibliotecaindividualmente usando células TG1 para determinar a concentração. Abaixo está uma descrição do processo de titulação para uma biblioteca.
- Cultivar células TG1 de OD 600 de 0,4. Adicionar 990 ul de PBS para 6 tubos de microcentrífuga.
- Para o primeiro tubo de adicionar 10 ul de partículas fágicas. Após a mistura, retire 10 ul de um tubo e adicionar ao tubo 2. Repita este passo para os restantes 4 tubos.
- Adicionar 200 ul de células TG1 de 6 tubos e adicionar 10 ul de cada uma das seis diluições de fagos para esses tubos. Permitir que as partículas de fago para infectar durante 30 min sem agitação a 37 ° C.
- Placa de 100 ul das células Unto Luria-Bertani de ágar placas com 100 ug / ml de ampicilina (LBA). Incubar O / N a 37 ° C e, em seguida, determinar a pfu / mL, utilizando o número de colónias visíveis.
2. Negative Processo bioprospecção
Nota: Evite muitos degelo congelamento dos fagos em todo o processo de bioprospecção. Identidadeeally, o melhor é realizar o maior número de etapas panning negativos quanto possível em um dia. Após a conclusão das rodadas de panning negativo ou positivo contra cada alvo é importante para salvar alguns dos fagos em caso de contaminação em qualquer etapa.
- 12 rodadas de Panning negativa contra albumina sérica bovina (BSA)
- Adicionar 4 ml de / ml de solução de BSA a 1 mg em PBS a 12 imunotubos e incubar O / N a 4 ° C.
- Combinar 1 x 10 12 partículas de fago a partir de cada uma das três bibliotecas (reservar uma pequena quantidade desta mistura de fagos para verificação futura do processo de panning negativo).
- Descartar a solução de BSA a partir do primeiro tubo e o tubo de lavar 2-3 vezes com PBS para remover toda a BSA não ligado.
- Adicionar as bibliotecas de fago combinados para este primeiro tubo, incubar durante 30 min à temperatura ambiente no rotor e recolher os fagos não ligados.
- Repita o passo 2.1.3 com o segundo imunotubo e adicione o fago coletadas a partir do passo 2.1.4 do presente immunotube. Repita o passo 2.1.4.
- Repetir passos 2.1.3-2.1.4 com os restantes 10 tubos de solução de BSA e o fago não ligado recolhidas após cada incubação.
- Para verificar a remoção de todos os ligantes BSA fagos usar AFM. Adicionar 10 ul de fago a partir do passo 2.1.2 e 10 ul de fago remanescente após o passo 2.1.7 separadamente a 10 ug / ml de BSA ligadas a mica clivada. Uma versão resumida do processo AFM é descrito na secção 8.
- É importante para salvar uma pequena quantidade de fago depois de terminar as inúmeras rodadas de panning negativa contra cada alvo para verificar o sucesso do processo de filtração.
- 10 rodadas de Panning negativo contra diversas formas de alfa-sinucleína
NOTA: Neste projeto, nós queremos remover fago que poderia ligar outras formas agregadas de proteínas como a alfa-sinucleína (monômero, dímero, trímero, etc.) e por isso vamos eliminar qualquer um destes fagos (o objetivo é eliminar o maior muitos fagos de reação cruzada possível). Permitir purificada alfa-sinucleína agregar por pelo menos 7 dias, para que ambas as formas monoméricas e oligoméricas estão presentes para panning negativo.- Prepare 4 imunotubos com 500 ug / ml de agregado de alfa-sinucleína em PBS e 4 imunotubos com 100 ug / ml de agregado de alfa-sinucleína e incubar O / N a 4 ° C.
- Descartar a solução de um dos tubos, com 500 ug / ml de agregado de alfa-sinucleína, lava-se com PBS e adicionar a biblioteca de fagos recolhida após 12 ciclos de panning negativo com BSA.
- Incubar o tubo durante 30 minutos à temperatura ambiente no rotor e recolher os fagos não ligados.
- Repita os passos 2.2.3 e 2.2.4 para os restantes tubos com 500 ug / ml de agregado de alfa-sinucleína e, em seguida, os tubos com 100 ug / ml de agregado de alfa-sinucleína usando o fago não ligado de cada vez recolhidos após o passo 2.2.4.
- Repetir o passo 2.1.8 utilizando o fago após a primeira de deslizamento negativo contra 500 ng / ml de alfa agregada-sinuclea e os fagos após a oitava rodada de panning negativa contra 100 mg / ml de alfa-sinucleína.
- Para eliminar todos os fichários negativas contra alfa-sinucleína preparar dois imunotubos extras com 500 ng / ml de agregado alfa-sinucleína e repita os passos 2.2.2-2.2.4.
- 10 rodadas de Panning negativa contra saudável Cérebro humano homogeneizado de tecido
- Adicionar tampão 1x Sten (50 mM de Tris (pH 7,6), NaCl 150 mM, EDTA 2 mM, 0,2% de NP-40, 0,2% de BSA, PMSF 20 mM e cocktail inibidor de protease) para o tecido cerebral humano 28. Homogeneíza-se a 24.000 rpm durante 1 min, as amostras de centrifugação a 3.000 rpm e recolher o sobrenadante.
- Preparar dois imunotubos com 2 ml de 50 ug / ml de tecido de cérebro humano em PBS e 8 imunotubos com 10 ug / ml de tecido de cérebro humano e incubar O / N a 4 ° C.
- Repetir passos 2.2.3-2.2.5 primeiro com os tubos contendo 50 ug / ml de tecido de cérebro humano e, em seguida, com os que contêm 10 ug / ml de b humanotecido chuva usando o fago não ligado recolhidas após a panning negativa contra alfa-sinucleína.
- Repetir o passo 2.1.8 utilizando o fago após a primeira de deslizamento negativo contra 50 ng / ml de tecido de cérebro humano e o fago após o décimo ciclo de prospecção negativa contra o tecido do cérebro humano.
- 8 rodadas de Panning negativa contra Saudável imunoprecipitou TDP-43
- Imunoprecipitam saudável proteína TDP-43 a partir de tecido do cérebro humano saudável utilizando o protocolo descrito na secção 9. Devido à menor quantidade de proteína imunoprecipitado, realizar estas rodadas de panning negativo usando mica.
- Cleave oito superfícies mica.
- Para o primeiro mica adicionar ~ 100 uL de 5 ug / ml de proteína imunoprecipitada e incubar durante 5-10 min à temperatura ambiente.
- Lava-se a mica 5 vezes com PBS com 0,1% de Tween 20 (PBST).
- Adicionar 100 l ~ do fago após a filtração negativa contra o tecido saudável do cérebro e incubar durante 5-10 min aRT.
- No meio do caminho de incubação da etapa 2.4.5, realizar o passo 2.4.3 usando o segundo mica.
- Recolhe-se o fago a partir do passo 2.4.5 e lava-se a mica 5 vezes com PBST 0,1%.
- Lave mica do passo 2.4.6 e adicione o fago de 2.4.7.
- Repita os passos 2.4.4 a 2.4.9 até o fago é criticado negativamente contra todos os oito mica com a proteína imunoprecipitou. Repita o passo 2.1.7 usando o fago após o primeiro e oito ciclo de prospecção negativo.
- 2 Rounds de Panning negativa contra FTD imunoprecipitou TDP-43
- Imunoprecipitam TDP-43 proteína do cérebro de indivíduos com FTD.
- Cleave 2 superfícies mica.
- Adicionar 50 ul de 10 ug / ml de FTD TDP-43 para uma de mica. Incubar durante 5 min à TA.
- Lava-se a mica 5 vezes com PBST 0,1%.
- Adicionar 50 ul do fago coletadas após panning negativa contra saudável TDP-43. Incubar durante 5 min.
- Recolha os fagos não ligados.
- Repeats passos 2.5.3 a 2.5.6 com o segundo mica e o fago não ligado coletadas em 2.5.6.
3. Positivo Panning contra imunoprecipitou TDP-43 a partir de indivíduos com ALS
- Imunoprecipitado proteína TDP-43 a partir de cérebros de indivíduos com ELA. Cleave 3 superfícies mica. Adicionar 50 ul de 10 ug / ml de ALS TDP-43 para uma de mica. Incubar durante 5 min à TA. Lava-se a mica 5 vezes com PBST 0,1%.
- Adicionar 50 ul do fago coletadas após panning negativa contra saudável TDP-43 para a mica. Incubar durante 5 min.
- Recolha os fagos não ligados. Também recolher os fagos ligados utilizando três métodos de eluição. É importante manter todos os fagos recolhidos nestes passos panning separadas.
- Em primeiro lugar, adicionar 50 ul de tripsina (1 mg / ml em PBS) a cada um de mica e incubar durante não mais do que 10 min. Recolhe a solução e salvar. Em seguida, adicionar 50 ul de trietilamina 100 mM (TEA) para cada mica e incubar durante não mais do que 10 min. Collect a solução, adicionar um volume igual de 1 M de Tris-HCl, pH 7,4, e guardar.
- Em terceiro lugar, adicionar 50 ul de TG1 em OD 600 de 0,4 directamente para o mica e incubar durante 30 min a 37 ° C. Também adicionar os fagos obtidos pelos dois métodos de eluição em 3.3.1 a 100 ul de TG1 em OD 600 de 0,4 e incubar durante 30 min a 37 ° C.
- Repita os passos 3.1 com um segundo mica.
- Leve o fago não ligado coletadas em 3.3.2. usando a primeira mica com ALS TDP-43 e adicioná-lo ao segundo mica com ALS TDP-43. Incubar durante 5 min.
- Repita todas as etapas em 3.3 para esses segundo conjuntos de mica.
- Combina-se as células TG1 infectadas com os fagos eluídos com tripsina a partir dos dois ALS TDP-43 mica e placa em placas de LBA. Repetir o mesmo processo para a TEA e TG1 fagos eluídos a partir dos dois ALS TDP-43 mica para um total de três placas.
NOTA: Devido ao envolvimento da TDP-43 em ambos ALS e FTD, alguns dos clones isolados naduas rodadas de panning positivo contra ALS TDP-43 pode ser específico para essa meta, mas alguns podem também ligar FTD. Para melhor isolar ALS clones específicos, tomar o fago não ligado coletadas após duas rodadas de panning negativa contra FTD TDP-43 (uma vez que estes dois ciclos de panning negativo deve ter removido qualquer alvo que é reactivo a FTD TDP-43) e utilizar estes fagos em mais um ciclo de prospecção positivo contra o antígeno ALS TDP-43 em mica (preparar o ALS TDP-43 mica, como descrito acima, em 3,3 e 3,4). - Repita todas as etapas em 3.3 com este terceiro mica ALS e placa das células TG1 infectados nas três placas LBA O / N a 37 ° C. No dia seguinte, contar o número de colônias nas 6 placas LBA com os potenciais clones ALS. Deveria haver menos colônias nas três placas LBA com os potenciais clones ALS após o terceiro ciclo de prospecção positiva em comparação com os três placas LBA após as duas rodadas de panning positivo.
4. A cultura e Phage Produtoion de potenciais clones positivos contra ALS Específico TDP-43
- Cresça cada colónia a partir das 6 placas em placas de 96 poços contendo 100 ul de 2xYT com glicose a 1% e 100 ug / ml de ampicilina, num agitador a 37 ° CO / N.
- A próxima transferência dia 10 ul dos poços contendo os clones das 3 placas de LBA depois da terceira ronda de separação positiva com a proteína ALS TDP-43 para tubos de microcentrífuga contendo 1 ml de YT 2 × com 1% de glucose e 100 ug / ml de ampicilina .
- Adicionar glicerol a todas as culturas em placas de 96 poços a uma concentração final de 15% e congelamento das placas a -80 ° C. Permitir que as culturas de 1 ml a crescer durante 2-3 horas com agitação a 37 ° C.
- Adicionar 10 9 de fago auxiliar KM13 e permitir que o fago auxiliar para infectar durante 1 hora a 37 ° C com agitação. Centrifugar as células durante 10 min a 3000 xg, descartar o sobrenadante e adicionar 1 ml de 2xYT com 0,1% de glucose, 100 ug / ml de ampicilina e 50 ug / ml de Kanamycin.
- Cultura das células O / N a 30 ° C com agitação. Centrifugar os tubos a 3300 x g durante 30 minutos, transferir o sobrenadante para novos tubos de microcentrifuga e adicionar 250 uL de PEG / NaCl para cada tubo.
- Incubar os tubos em gelo durante 1 h. Centrifugar os tubos novamente em 3300 xg durante 30 minutos, rejeitar o sobrenadante e adicionar 100 ul de PBS a cada tubo.
- Incubar os tubos em gelo durante 1 h. Girar os tubos durante 10 minutos a 11.600 xg, e transferir o sobrenadante para tubos novos. Armazenar os fagos a -80 ° C.
5. Seqüenciamento do potencial Clones ALS
- Repetir o passo 4.2 e permitir a culturas a crescer O / N a 37 ° C com agitação. No dia seguinte realizar preps de plasmídeo DNA dos clones de acordo com as instruções do fabricante. Sequenciar os clones usando o apropriado para a frente e primers reverter.
6. Triagem potenciais clones positivos contra ALS TDP-43 Usando ELISA indireta Specific
- Adicionar 100 ul de 2,5 ug / ml de ALS, FTD e o tecido cerebral humano saudável para os poços de uma placa de ELISA de alta ligação para cada potencial clone de ALS. Incubar as placas a 37 ° C durante 1 h, com agitação lenta.
- Lavar as placas 3 vezes com PBST 0,1%. Adicionar 200 ul de 2% de leite em pó em PBS para o poço e incubar as placas a 37 ° C durante 1 h, com agitação lenta.
- Repetir o passo de lavagem e, em seguida, adicionar 100 ul de cada fago diluído, pelo menos, 1/100 em PBS aos poços. Após a incubação e passos de lavagem, adicionar 100 ul de 1 / 1.000 de anti-M13 HRP a cada poço. Lavam-se as placas e visualizar usando o kit de quimioluminescência do substrato femto ELISA.
7. scFv Produção e rastreio utilizando ELISA Indireto
- Crescer HB 2151 células para DO600 de 0,4. Adiciona-se 5 ul dos diferentes fagos de 20 ul das células HB 2151. Permitir que os fagos para infectar 30 min a 37 ° C sem agitação. Divida placas LBA nas redes de modoque cerca de 20 clones podem ser semeadas em cada.
- Junte 5-10 ul de cada fago bactérias infectadas para a placa e incubar O / N a 37 ° C. No dia seguinte, adicionar colónias individuais de 1 ml de 2xYT com 0,1% de glucose e 100 ug / ml de ampicilina e agitar a 37 ° C durante 3-4 horas até DO600 é igual a 0,6.
- Adicionar 1 ml de 1 M de isopropiltiogalactósido (IPTG) a cada tubo e incubar O / N a 30 ° C com agitação. Girar os tubos a 11.600 xg durante 10 min e colher o sobrenadante para o ensaio de ELISA.
- Para o teste ELISA seguir os mesmos procedimentos no Capítulo 6, exceto em vez de fagos em 6,5 adicionar o scFv não diluída e para 6,6 adicione 100 ml de 1 / 1.000 9E10 HRP.
8. Processo AFM
- Adicionar 10-20 uL do antigénio alvo para a mica clivada e incubar durante 5-10 min. Lava-se a mica 5 vezes com água. Adicionar 10-20 uL dos fagos para o mica e incubar durante 5-10 min.
- Lava-se a mica 5 vezes wi novamenteth água e permitem que a mica para o ar seco. Visualize fago ligação usando AFM 1. Execute o processo de imagem AFM usando o modo tocando AFM com um controlador Nanoscope IIIa ao ar a RT 29. As sondas AFM silício tem uma freqüência de ressonância de 300 kHz e uma constante de 40 N / m primavera. Use uma velocidade de varredura de 3,05 Hz e uma resolução de digitalização de 512 amostras / linha.
- Processar as imagens por achatamento de base do fundo para assegurar que todos os tamanhos de partícula são comparáveis dentro de cada imagem. Width fagos (não comprimento) pode variar de imagem para imagem devido a outros tamanhos de partículas e área de digitalização, mas nunca irá comprometer a precisão da existência ou não de fago se liga ao antígeno.
- Se durante a verificação da AFM para cada conjunto de fagos panning negativos são visíveis na mica, realizar rodadas de adição até que não fagos são detectados antes de prosseguir para o próximo conjunto de panning negativo.
9. Immunoprecipitation do Target Antigen
- Ao isolae o antígeno alvo (TDP-43), adicione 250 g de tecido homogeneizar cérebro (do córtex motor), 100 l de 1/100 diluição do anti-TDP 43 anticorpo policlonal e 1x STEN buffer para volume total de 700 mL de uma Eppendorf tubo 28.
- Incubar O / N a 4 ° C num rotor. Lavagem A / G agarose com o tampão 1x Sten 2-3 vezes e adicionar 25 ml à mistura de tecido. Incubar a 4 ° C durante 1,5 horas num agitador rotativo e depois centrifugar a 2.000-4.000 rpm durante 1 min.
- Remover o sobrenadante e lavar o sedimento uma vez com tampão 1x Sten e 5 vezes com PBS. Adicionar 40-60 uL de tampão 1x Sten ao sedimento e ferver durante 5 min. Depois que as amostras são legais, centrífuga e recolher o sobrenadante. Use de SDS-PAGE e transferência de Western para verificar o sucesso do processo de imunoprecipitação 30.
10. Análise Dot Blot
- Cortar papel de nitrocelulose em pequenos retângulos para cada clone, que será testado. Dot 2 ul de ALS, FTD e amostras de tecido cerebral humano saudáveis até o papel de nitrocelulose e deixe secar completamente.
- Adicionar 1-2 ml de 5% de leite em pó em PBS e deixar agitar durante 1 hora à TA. Adicionar 1 ml de cada diluição 1/100 de fago e deixá-lo agitar O / N a 4 ° C. Lava-se a membrana 3 vezes durante 10 minutos cada com 0,5% de PBST.
- Adicionar 1 ml de 1 / 1.000 de diluição de anti-M13 HRP e deixar agitar durante 1 hora à TA. Repita o procedimento de lavagem e visualizada utilizando solução quimiluminescência ocidental.
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Representative Results
Na Figura 1, o esquema demonstra o processo de deslizamento negativo pelo qual removido fago de ligação antigénios fora do alvo da nossa biblioteca utilizando imunotubos. Inicialmente começou com BSA uma vez que este é um agente bloqueador comum e qualquer fago que iria reagir de forma não específica com esta meta seria problemático em imunoensaios futuras. Em seguida, removeu-ligantes para agregados alfa-sinucleína para eliminar fagos que são reactivos com estruturas genéricas de proteínas agregadas (isto é, um anticorpo que seria reactivo de forma cruzada para agregada alfa-sinucleína, TDP-43, Abeta, etc.). Resultados AFM mostraram obrigatório após 1 ciclo de prospecção negativo contra o agregado alfa-sinucleína (Figura 2A) e nenhuma ligação após 8 rodadas (Figura 2B) fago. Nós então moveu negativamente contra o tecido do cérebro humano saudável para remover fago ligação muitos antígenos presentes na saudável homogeneizado de cérebro humano. Figura 2C (Figura 2D). Uma vez que a quantidade de saudável e FTD imunoprecipitado proteína TDP-43 disponível para o deslizamento era baixo, em vez de mica utilizando imunotubos utilizadas com menor volume e, portanto, reduzido de proteína total consumido (Figura 3). Depois de oito rodadas de panning negativo contra saudável imunoprecipitou TDP-43, o fago foi dividido. Metade do fago foi gasto em duas rodadas de panning negativa contra FTD TDP-43. O objetivo era eliminar qualquer FTD TDP-43 clones reativos (devido ao envolvimento da TDP-43 em FTD), mantendo quaisquer potenciais ALS TDP-43 clones específicos.
Para a parte de deslizamento positivo (Figura 4), que também empregue mica como um substrato para minimizar o consumo de material. Utilizou-se o fago não ligado após o panning negativa contra ALS TDP-43 para adquirir qualquer FTD TDP-43ALS clones específicos. Nós também muito criticado positivamente contra ALS TDP-43 duas vezes, no caso de não obter clones depois de usar o fago desvinculado do panning negativa contra FTD TDP-43. Depois de todo o processo de filtração, os nossos três métodos de eluição rendeu 154 clones dos dois panning positivo contra o ALS TDP-43 (clones que podem ser reativas a ALS e FTD) e 45 potenciais ALS clones específicos (usando o fago não ligado da FTD TDP- 43 panning negativo).
Para reduzir ainda mais os 45 potenciais ALS clones específicos, os clones são seqüenciados e apenas os clones sem quaisquer códons de parada foram consideradas ainda mais, com exceção de um clone que mostrou-se duas vezes. Isso nos deixou com 23 potenciais ALS clones específicos. Após a preparação tanto em fagos e scFv solúvel com estes clones, eles são testados em ELISA indirecta para a especificidade tecidual do ALS. Quase todos os fagos demonstrou uma preferência para tecido ALS sobre tecido saudável (Figura 5). Resultados semelhantes são obtAined quando comparando a ligação a ALS em tecidos FTD fagos (Figura 6). Para estudos futuros, é essencial que estes clones expressam altos rendimentos de scFv funcionais, portanto, produzidos pequenos lotes de diferentes scFvs e realizado indirectas ELISA semelhantes. Comparação da ligação de scFv para o tecido saudável do ALS para ambos (Figura 7) e tecido FTD (Figura 8) mostrou novamente ligação selectiva ao tecido ALS em quase todos os clones.
Nós usamos um outro imunoensaio (manchas DOT) para comprovar a ligação ao tecido ALS e também para verificar quais clones são reativos em outras aplicações imunológicas. O clone de ligação ao tecido ALS 2A é mostrado (Figura 9). Todos estes clones mostraram resultados promissores em um ou ambos os fagos e scFv ELISAs. Estes resultados confirmam que o nosso processo de bioprospecção com base AFM é uma técnica muito potente que pode ser usada para gerar reagentes que se ligam selectivamente a proteína específica da doença variformigas diretamente de fontes complexas.
Figura 1. Processo de bioprospecção Negativa Utilizando imunotubos. Esquemático mostrando o processo de bioprospecção negativo. Os fagos que são reativos a proteínas como a BSA, agregada alfa-sinucleína e tecido saudável do cérebro são removidos usando imunotubos. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Confirmação de resultados negativos panning. Imagiologia AFM é utilizado para monitorizar os passos de panning negativas contra os vários alvos para garantir que todos os fagos reactivos são removidos. Aqui nós mostramos alguns dos resultados que demonstram a AFMnível de ligação antes e depois do panning negativo fago. ligação (A) Fago pode ser detectado a partículas alfa-sinucleína agregados após o primeiro ciclo de prospecção negativo, mas (B) não fagos são visíveis após 8 rodadas de panning negativo. (C ) Após o primeiro ciclo de prospecção negativa contra fago tecido saudável ligação é evidente, mas (D) nenhuma ligação for detectada após 10 rodadas de panning negativo. Todas as imagens são 5 um. As grandes estruturas brancas nas imagens de AFM são geralmente devido a sais presentes nos tampões ou PEG residual da etapa de precipitação PEG durante a produção de fagos. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Negativo Biopanning processo que utiliza Mica. demonstrando Schematic biopanning negativo adicional usando mica. Devido a amostra limitada superfície mica é empregado para eliminar primeiro ligantes para saudável e, em seguida, FTD imunoprecipitou TDP-43. Antes de prosseguir para as duas rodadas de panning negativa contra FTD TDP-43, o fago é dividida ao meio (no caso de isolamento sem êxito do ALS TDP-43 fagos exclusivos durante a fase positiva panning). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Processo de ALS positiva bioprospecção. Esquemático mostrando o processo de bioprospecção positivo ALS. Os fagos não ligados após o panning negativa contra FTD TDP-43 são usados em um ciclo de prospecção positiva contra ALS TDP-43 para eluir mais ALSTDP-43 clones específicos. Além disso, duas rodadas de panning positivo contra ALS TDP-43 são realizadas utilizando superfície mica e os fagos não ligados após panning negativa contra saudável imunoprecipitou TDP-43 (os fagos ligados são eluídos uma vez que estes fagos não deve vincular saudável TDP-43, porém alguns pode ser reactivo de forma cruzada com ambos ALS e FTD). Três métodos de eluição são utilizados (tripsina, TEA e células TG1) para garantir que todos os fagos ligados são removidos. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Triagem Fago ELISA de potenciais Clones ALS (ALS contra HT). Usando humano homogeneizada ALS, FTD e tecido saudável do cérebro (HT) amostras foram necessárias, ELISA indireto utilizando fago produzido a partir de diferentes clones. Os resultados estão representados como a razão para amostras de tecidos saudáveis. Os resultados mostraram que alguns clones distinguir entre TDP-43 encontrada em pacientes com ELA e aqueles em saudável. Os tecidos ALS, FTD e HT são uma mistura de amostras do cérebro (córtex motor) de três indivíduos. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6. Screening Fago ELISA de potenciais Clones ELA (ALS contra FTD). Aqui nós mostramos os resultados de ELISA de fagos de ALS versus pacientes FTD. A maioria dos clones têm uma preferência por ALS mais FTD. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura Triagem 7. scFv ELISA de potenciais Clones ALS (ALS contra HT). Usando os scFvs produzidos a partir de cada clone, podemos observar clones que têm uma preferência para o TDP-43 a partir de pacientes com ELA mais saudável. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8. Triagem scFv ELISA de potenciais Clones ALS (ALS contra FTD). O sucesso do nosso processo de panning é ainda demonstrada quando se compara ALS para FTD para os diferentes scFvs nos ELISAs indiretos. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura .
Figura 9. Dot Blot análise do potencial Clones ALS. Usando mancha de pontos em vez de ELISA é uma outra técnica para mostrar a especificidade dos clones para ALS mais FTD ou HT. Clone 2A é mostrado. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada por uma concessão do NIH: R21AG042066. Gostaríamos de agradecer a Philip Schulz por suas contribuições na criação de vídeos de captura de tela.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tomlinson I and J Libraries | MRC (Cambridge, England) | ||
| Sheets Library | MRC (Cambridge, England) | ||
| 2xYT | BD Sciences | 244020 | |
| Glucose | Amresco | 0188-2.5KG | |
| Ampicillin | Amresco | 0339-25G | Irritant |
| KM13 Helper Phage | MRC (Cambridge, England) | ||
| Kanamycin | OmniPur | 5880 | Irritant |
| Polyethylene Glycol 8000 | OmniPur | 6510 | Irritant |
| Sodium Chloride | Macron | 7647-14-5 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Amresco | 0404-1KG | Irritant |
| Potassium Chloride | EMD | PX1405-1 | Irritant |
| Potassium Phosphate Monobasic | Amresco | 0781-500G | Irritant |
| TG1 Cells | MRC (Cambridge, England) | ||
| Luria-Bertani Agar | EMD | 1.10283.0500 | |
| Bovine Serum Albumin | Amresco | 0332-100G | |
| STEN buffer | Crystalgen Inc. | 33429775 | |
| Immunotubes | Thermo Scientific | 470319 | |
| Mica | Spruce Pine Mica | 24365 | |
| Tween 20 | EMD | ||
| Trypsin | Sigma | T-0303 | Irritant |
| Triethylamine | Sigma | T-0886 | Flammable |
| Glycerol | Amresco | 0854-1L | Irritant |
| DNA Plasmid Prep Kit | qiagen | 27106 | Irritant |
| Non-Fat Milk Powder | Carnation | ||
| 96-Well High Binding ELISA Plate | Costar | 3590 | |
| Anti-M13 HRP | GE Healthcare Life Sciences | 27-9421-01 | |
| ELISA Femto Chemiluminescence Substrate Kit | Thermo Scientific | 37074 | |
| Anti-TDP 43 Polyclonal Antibody | ProteinTech | 10782-2-AP | |
| A/G Agarose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2003 | |
| HB 2151 Cells | MRC (Cambridge, England) | ||
| Isopropylthiogalactoside | Teknova | 13325 | |
| 9e10 HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-40 | |
| Nitrocellulose Membrane | Biorad | 162-0115 | Flammable |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall RC 6+ | |
| Nanoscope IIIa Atomic Force Microscope | Veeco | ||
| AFM Probes | VistaProbes | T300R-10 |
References
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